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方法論記事

海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

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DOI：

10.3791/61282

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2020年9月9日

 ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, Louisiana State University School of Veterinary Medicine

この記事について

サマリー

現在のプロトコルは、海馬への腹側テグメンタル領域(VTA)グルタミン酸突起をトレースするための簡単な方法を示しています。VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激をCA1記録と組み合わせて、VTAグルタミン酸末端が生体内での推定ピラミッド発火率を調節する方法を示した。

要約

脳内のニューロン亜集団の光遺伝学的調節は、研究者が生体内およびex vivoで神経回路を解剖することを可能にした。これは、神経回路内のニューロンタイプの役割と、学習に対する情報符号化におけるその重要性を決定するための前提となる。同様に、この方法は、目覚めおよび麻酔動物における2つ以上の接続された脳領域の生理学的意義を試験するために使用することができる。現在の研究は、VTAグルタミン酸ニューロンが麻酔をかけマウスのCA1(海馬)における推定ピラミッド型ニューロンの発火率をどのように調節するかを示している。このプロトコルは、海馬の層内のVTAシナプス前グルタミン酸末端のトレースのためのVTAグルタミン酸ニューロンのアデノ関連ウイルス(AAV)依存的標識を採用する。AAVベクターに収容された光制御オプシン(チャネロドプシン;hChR2)および蛍光タンパク質(eYFP)の発現は、VTAグルタミン酸末端の前向きのトレースを許可し、VTAグルタミン酸ニューロン細胞体(VTA)の光刺激を認めた。高インピーダンスの急性シリコン電極をCA1に配置し、生体内でのVTA光刺激に対するマルチユニットおよび単一ユニットの応答を検出した。この研究の結果は、海馬(CA1、CA3、およびDG)におけるシナプス前VTAグルタミン酸末端の層依存分布を示す。また、VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激は、生体内の推定CA1錐体単位の発火およびバースト速度を増加させた。

概要

過去10年間で、ニューロン型変調の特異性を高めるための遺伝的ツールの配列が開発され、複雑なニューラルネットワーク1のマッピングが行われました。特に、神経細胞に感染し、複製する固有の能力を持つ神経刺激性ウイルスは、ニューロンサブタイプの特定のタンパク質を発現またはアブレートするために展開されています。蛍光タンパク質または遺伝的にコードされたシナプス活性指標を収容する場合、トランスフェクトされたAAVベクターは脳領域を横切るニューラルネットワークを標識および線引きする2,3。AAV構築物におけるプロモーターの選択は、ある程度の特異性(プロモーター依存性発現)を有するニューロン型におけるベクターの発現を指示する。しかし、Cre-loxの組換えを通じて、AAV構築物は、ニューロン標識4、5、6、7に対するより大きな特異性で展開される。注目すべきは、AAVベクターにパッケージ化された光活性化された微生物オプシンおよび蛍光タンパク質は、各種ニューロンサブタイプ8で発現することができ、かつ、イメージング、ニューロン型回路トレース、および光変調9,10に最適である。

AAVは、脳領域(または核)に立体的に注入され、ソーマ、樹状突起、軸索末端におけるレポータータンパク質の発現を駆動する。レポーター遺伝子(eYFP)を収容するAAVの神経発現は、ニューロン細胞体の標識化を促進し、他の脳領域11、12、13、14との間の突起の細胞細胞体および解剖学的トレースを促進する。光制御されたオプシン(例えば、hChR2)を担うAAV-eYFP構築物は、ビボ16における脳領域を標的とする神経投影の画像6、15および刺激ベースの生理学的トレース用のツールとして展開することができる。AAV血清型に応じて、ニューロン標識の方向は、前向きまたは逆行性11、12であってもよい。これまでの研究では、AAV5がニューロン12で前向きに移動することを確立しています。このように、hChR2を発現する細胞体の光刺激は、脳内の他の場所でシナプス前効果を生じる(標的)17。

ここで、AAV(血清型5)を用いて、CaMKIIαプロモーターを用いて、VTAグルタミン酸ニューロンおよび軸索突起においてeYFP(レポーター)およびhChR2(オプシン)を発現させた。この研究の結果は、CA1、CA3、およびDG海馬領域におけるVTA-グルタミン酸シナプス前末端の層依存分布を示す。また、VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激は、ベースライン値と比較した場合に、生体内でのCA1マルチユニットおよび単一ユニットの発火率を増加させた。このプロトコルは、ニューラル回路トレース実験から得られるデータの品質を向上させることができる、手頃な価格のツールと市販のソフトウェアを利用しています。

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プロトコル

すべての実験および動物の取り扱い手順は、ルイジアナ州立大学獣医学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 実験動物

  1. 5~6週齢のマウスを使用してください。
  2. 12時間交互の光と暗いサイクルの標準的な条件の下でケージごとに3〜5匹の動物を収容する。食べ物と水は、アドリビタムを提供する必要があります。

2. 頭蓋骨の起術と動物の調製

注: このセクションでは、マウスの頭蓋切除術の術前および手術前の手順について説明します。標準的な定位装置と適切な座標を使用してください (前道:AP、平凡:ML、およびドーソベンタル: DV)。マウスの脳アトラスを参照して、関心のある脳領域の座標を決定します。

  1. 腹腔内ケタミン(100mg/kg)/キシラジン(10mg/kg)カクテル注射でマウスを麻酔します。手術開始前に感覚の欠如を確認するためにつま先ピンチテストを行います。
    注:または、適切な鼻室を有するイソフルラン麻酔もこのステップに使用することができる。
  2. 動物の頭部を立体装置にそっと固定します。
    注意:このプロセスでは、動物を注意して扱うことが重要です。また、手術を進める前に呼吸数やその他の生命力を確認してください。動物はストレスを軽減するために〜7分間休ませてください。
    1. 動物の体がその上に横たわるようなステレオタキシックフレームに加熱パッドを置きます。これは、体温を維持し、手順を外して動物を暖かく保つのに役立ちます。術後のケアと回復のために加熱パッドを保持します。
  3. クリッパーを使用して頭皮の上の毛を除去し、ヨウ素溶液で皮膚をきれいにします。
    1. 頭皮の感覚をブロックするために局所リドカインを適用します。
    2. メスを使用して、正面から後頭部まで伸びる中線の頭皮切開を行います。
    3. ヨウ素溶液で切開領域を洗浄し、カルバリアを露出させます。
      注:少量の過酸化水素溶液を適用して、カルバリアから骨膜を除去することができます。これにより、ランドマーク(ブレグマとラムダ)と縫合糸の可視性が向上します。
    4. マウス脳立体定位アトラスを用いて、ブレグマに対するAPおよびMLの座標を決定する。
    5. VTA注射の場合、超微細な鈍点針注射器(例えば、ニューロスポイト)を座標APに配置する:-3.08 mm/ML:ブレグマに対して0.5mm。
    6. 穴あけ工具を使用して、印の付いたAP/ML座標で頭蓋骨に1mmの穴(頭蓋切開術)を行います。
      注: この手順では、かなりの注意が必要です。ドリルビットが脳組織を押しつぶすのを防ぐために、掘削中に最小限の圧力を適用する必要があります。現在の研究では、ドリルビットは0.8mm、ドリル速度は15,000 rpmに設定されました。
      注意:過酸化水素が切開やカルバリアの洗浄に使用された場合は、溶液の完全な除去を確認するか、掘削前に完全な乾燥を可能にします。

3. AAVカクテルインジェクション

注: このセクションでは、成人C57BL/6マウスのVTAへのAAV注入プロセスについて説明します(23~27 g)。記載された方法は、標準定位装置および適切な座標を用いて任意の脳領域へのAAV注入に使用することができる。このプロトコルを実証するために、eYFPおよびhChR2は、CaMKIIαプロモーター下でAAV5媒介トランスフェクションを用いてVTAグルタミン酸ニューロンで発現した(図1)。Cre-loxの組換えもこのステップに使用することができます。

  1. 注射器に超微細な鈍点針(32 G;100 nL精度の5 μL容量)を入れる。マイクロマニピュレータでシリンジホルダーを固定します。
    注: この手順では、1.6 nL キャリブレーションを備えた手動シリンジ ホルダーを使用しました。自動インジェクターも使用できます。
  2. 二重蒸留水でシリンジを充填し、液体の流れを洗浄し、テストします。
  3. 氷の上のAAV(血清型5)カクテルのアリコートを解凍します。AAVは、良好な発現のためにウイルスの刺激を維持するために-80°Cで保存するのが最善です。
  4. 取り付けられたシリンジに1,000 nLのAAV溶液(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で10 mM)を充填し、pH 7.4。AAV溶液の10nLを分配し、注射部位に針を下げる前に液体の流れを確認する。
  5. マイクロマニピュレータを使用して、針を必要な深さ(DV座標)に立体的に下げます。針を所望の深さまで下げた後、注射器を注射前に10分間所定の位置に留めておきます。
    注:この手順では、針は脳の海中表面から4.5mmの深さ(DV)でVTAに下げられました。他の脳領域については、適切なドーソベントラ座標を使用します(マウスの脳アトラスを参照)。
  6. 600~800 nLのAAVをVTAに注入します。注入量は、標的部位の大きさに応じて調節されてもよい。
    1. 60 nL/分(3分間隔)の速度でAAV溶液を提供します。
    2. eYFPおよびhChR2をVTAグルタミン酸ニューロンおよびプロジェクションで発現させるために、AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFPを注入する。
      注: Cre-loxの 再結合法は、実験の目的に応じて使用することもできます。
    3. 針をAAV注射後15分間所定の位置に保つ。これにより拡散と逆流が減少します。
  7. 注射針を引き出し、切開を縫合して傷口を閉じる。
  8. 術後ケアの一環として抗生物質と鎮痛を投与する。暖かいパッド入りのプラットフォーム上にマウスを置き、目が覚めるまで動物を監視します。
    注:3週間の注射の後、AAV発現はマウス脳切片におけるレポータータンパク質(eYFP)の蛍光検出によって観察することができる。また、光刺激実験は3週間後に行うことができる(図2)。

4. 光遺伝学を用いたインビボニューラル録音用のセットアップ

注:このセクションでは、脳回路の光遺伝学的なトレース(CA1へのVTAグルタミン酸ニューロン投影)を用いた急性神経記録のステップについて説明します。必要に応じて、このステップを開始する前に、システム(アンプと接続)で電気ノイズや接地の問題を確認します。ファラデーケージでこのステップを実行すると、録音中の電気的ノイズを除去できます。

  1. AAV注射後3週間で、腹腔内ウレタン注射(0.2mg/kg)によりマウスを麻酔する。
    注意:ウレタンは発がん性があり、保護具を着用しながら慎重に取り扱う必要があります。また、この濃度でウレタン麻酔を投与することは非生存である。
  2. 先に説明したように、動物の頭部を立体的なフレームに貼り付ける(ステップ2.2、 図3A)。頭蓋骨を露出させるために頭蓋間膜の問題を起こします(図3A)。掘削ツール(ビットサイズ:0.8mm、速度:15,000 rpm)を使用して、頭頂骨の一部を取り除きます。
    1. 頭蓋骨の折り目術は、幅約3mm x 4mmである必要があります。乾燥を防ぐために、この領域上に人工脳脊髄液(aCSF)の滴を適用します。
  3. 解剖(デジタル)顕微鏡の下で、曲がった針の先端(27 G)を使用して、露出した硬膜を切除する。この領域の繊細なパイルカバーと皮質組織を引き離さないように注意してください。
  4. 後頭部の骨に穴を開け(ビットサイズ:0.8mm、速度:10,000 rpm)を接地スクリュー(パンヘッドフィリップススクリュー)を保持する。M0.6 x 2.0 mm)。
  5. ステンレス鋼のアース線を接続します。
    注: 他のタイプのワイヤも使用できます (図 3b)。
  6. 複合光刺激(VTA)とニューラル記録(CA1)には、超微細(10μmまたは1μm)のマイクロマニピュレータを取り付けたマルチレールステレオタックス装置を使用します。光ファイバーを取り付け、ニューラルプローブを10 μm範囲と1μm範囲のマイクロマニピュレータにそれぞれ取り付けます。
    1. 必要に応じて、ヘッドステージプローブアダプタを使用します(図3c)。
      注: 現在のプロトコルでは、32 チャンネルのヘッドステージに 4 チャンネルの記録用電極を保持するアダプタが取り付けられていました(図 3d)。ステンレス鋼のアース線は、アダプタのグランド接続ポートにはんだ付けされました。
  7. 調整 AP: -3.08 mm ML: 0.5 mm、 400 μm の直径の光ファイバーを VTA に下げます。
    1. 光ファイバを下げる前に、ファイバー結合LEDソースに接続された光ファイバケーブル(ステンレス鋼またはセラミックフェルール付き)にフェルールを接続します。
      注: 光の強度とフォーカスが希望どおりに設定されていることを確認します。LED光源の選択は、対象となるオプスインに対応する必要があります。ここでは、hChR2光活性化に470 nm(青色光)LEDドライバを使用した(図4a)。
    2. 光パルスをニューラル記録と同期させるには、LEDドライバと記録コントローラのデジタル IN ポートをトランジスタトランジスタロジック(TTL)パルサー(図4b)に接続します。これは、BNC スプリッターを使用して実現できます。
      メモ:TTLパルサーを使用すると、望ましいパルス列の周波数と持続時間をデジタル的に設定する柔軟性が得られます。現在のプロトコルでは、10ミリ秒の光パルスが50 Hz18でトリガされました。LEDドライバのTTL制御の場合は、ドライバを「トリガー」に切り替えます。このモードでは、「ノブ」を回すことで光強度を調整できます。刺激周波数は実験変数に対応するように調整でき、1~100 Hzの範囲です。神経回路トレースの場合は、>20 Hzの刺激周波数を推奨します。
    3. ノブを調整して、光電アーチファクトを生成せずに応答を生成できる有効強度を決定します。必要に応じて、光ファイバを再配置して、アーティファクトを除去します。
      メモ:現在のプロトコルに使用されるLEDドライバは、約21.8 mWの光パワーを生成します。

5. ニューラル記録

  1. 厚さ15~50μmの鋭い神経プローブを使用し、長さが5mm以上の長さを測定します。
    注:深部脳構造からの記録は、より長いシャンクを有する神経プローブを必要とする。現在の研究では、20mmシャンク長のプローブが使用されました。
  2. プリアンプのヘッドステージを、シリアル・ペリフェラル・インターフェース(SPI)ケーブルを介して録音コントローラーに接続します。記録コントローラ ポートの LED カラーライトを確認します。緑と黄色のLEDは、接続されたアンプボードの適切な電圧を示します。赤色の LED は、動作するソフトウェアヘッド ステージ コントロールを示します (図 5b)。
  3. マイクロマニピュレータを使用して、CA1のピラミッド型セル層に電極接点部位を配置します(AP:-1.94mm、ML:+1.0mm、DV:+1.1~1.2mm)。
    注:光ファイバーと電極は、光刺激と記録のために他の望ましい脳領域に配置することができます。

6. アンプとフィルタの設定

  1. USB 3.0ポートを介して、記録コントローラアンプシステムをコンピュータに接続します。SPIケーブルを使用して、ヘッドステージをアンプに接続します。コントローラソフトウェアを起動します。正しく接続されていない場合、システムは「デバイスが見つかりません」というメッセージを表示します。
  2. [ 実行 ] をクリックして、チャネルのアクティビティを表示します。各波形は、電圧(y軸)対時間(x軸)としてプロットされます。対象地域に応じて、電圧と時間スケールを調整して波形表示を調整します。
  3. アクティブなチャネルが少数の場合は、未使用のチャネルを無効にして、ストレージディスクのファイルサイズを小さくします。
  4. 取得ソフトウェアの帯域幅パラメータを編集して、サンプリングレートとカットオフ周波数を設定します。シングルユニットの記録では、上下のカットオフ周波数をそれぞれ300 Hzと5,000 Hzに設定します。アンプのサンプリングレートを30 kS/sに変更します。
    注: 高いサンプリング レートを選択すると、ファイル サイズが大きくなります。
  5. 録音する前に、1,000 Hzでインピーダンスを測定して、電極チャンネルの完全性を確認してください。これは、ユーザーインターフェイス(コントローラソフトウェア)で機能を起動することによって行うことができます。動作チャネルには、0.1 ~ 5 MΩ の範囲のインピーダンス値を指定する必要があります。
  6. オーディオ出力(スピーカー)が ANALOG OUT ポートに接続されている場合は、 ゲイン と サイレンサ を調整して最適なスパイク音を得ます。
  7. スパイク記録にTTLパルス列マーカーを表示するには、 デジタルIN マーカーの表示を有効にします。パルス列のタイムスタンプを記録するには、メイン実験の前に デジタルIN チャンネル表示を有効にします。
    メモ:通常、複数の「デジタルイン」チャンネル(1または2)があります。TTLパルサーのBNCケーブルが、記録コントローラソフトウェアで表示するために選択された「DIGITAL IN」ポートに接続されていることを確認します。
  8. スパイク波形をリアルタイムで表示するには、スパイクスコープウィンドウを開き、マウスクリックを使用してしきい値を設定します。
  9. ルート平均二乗(RMS in μV)を監視して、ノイズレベルを検査します。クリーンスパイク記録の場合、ニューラルスパイク閾値は、少なくとも5倍RMSであるのが好ましい。
  10. セットアップが完了したら、ファイル出力形式を選択します。
    注: ここでは、CA1 ニューラル スパイクが .rhd 形式で記録されています。その他のファイル形式 (.rhs および .dat) も、解析ソフトウェアで許可されているファイル形式に一致するように選択できます。

7. 生体内光遺伝学的記録と設定

  1. さまざまな調整可能なパルスパラメータを表示するパルス制御ソフトウェア(TTL)を開きます。ソフトウェアの適切な COM ポートを選択します。 [トレーニング ]と[ グループ ]の設定を調整して、パルスパラメータを設定します。
    注:パルスの状態は、実験変数と設計を考慮して決定する必要があります。
  2. 増幅器コントローラソフトウェアで、[ 実行 ]をクリックして、海馬または希望する脳領域の神経スパイクを検出します。必要に応じて、電極の深さを調整して、実行可能な活性ニューロンを検出します。
  3. 細胞外電圧活性が検出されたら、ベースラインスパイクを15分間観察し、動物の生命力を監視します。また、光パルスをテストして、CA1または所望の解剖標的領域内の応答性ニューロンを検出します。
    注:光電アーチファクトをチェックし、光強度または光ファイバの位置を調整して除去します。
  4. 希望の周波数で光パルスをトリガする前に、約10分間のベースラインアクティビティを記録します(図5a,b)。これにより、照明の有無にかかわらず、発射速度またはバーストレートを比較できます。
    注:現在のスタディでは、ベースラインアクティビティをイルミネーションなしで10分間記録し、その後50Hz(Movie 1)でイルミネーションを記録しました。

8. 分析

  1. rhd ファイルを Nex5 出力形式に変換します。
  2. プロセスファイル名。単一ユニットのラスタートレインと波形を検出するためのオフラインソーターソフトウェアのNex5ファイル(図5a–b)。
    1. ドロップダウン ウィンドウから目的のチャネルを選択します。
      注: 連続的に記録されたスパイクデータはOFSSの別のウィンドウで表示することができます。時間スケールも調整できます。テトロードを使用する場合、OFSSは4つのチャンネルをテトロードとしてソートするように設定できます。
    2. 波形抽出の閾値交差の電圧レベルを設定します。
      注意: スパイク検出を適切に行うには、5 倍の RMS を使用してください。
    3. 波形を検出し、次に谷シーク(自動)またはK平均(半自動)法を使用してスパイクソートを実行します。必要に応じて、3D 主成分分析 (PCA) スペースの類似領域を占める単位をマージします。
    4. エクスポートソート済み .さらなる分析のためのNex5ファイル(図5c–d)。
      注: インタースパイク間隔、発射速度、およびバースト速度の解析結果は、他の解析プラットフォームにエクスポートできます。

9. AAV発現の蛍光検出

  1. 記録後、イオブルランチャンバーで動物を安楽死させる。
  2. 10 mM PBS(〜10 mL)で経心面灌流を行い、続いてリン酸緩衝パラホルムアルデヒド(PB-PFA、〜10mL)を4%行う。
  3. 脳全体をそのまま取り除き、48時間4%PB-PFAに固定します。
  4. 4°Cで凍結保存のために30%スクロースを含む4%PB-PFAに固定脳を移す。 72時間後、クライオスタットで脳を切り離し、ゼラチンコーティングされたスライドにスライスを取り付けます。
    注:現在のプロトコルでは、DG、CA3、およびCA1でAAVラベル端子を示すために、海馬(rostral)の閉じた部分を含むセクションが選択されました。

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結果

順次トレース

AAV発現は、注射後21日目のC57BL/6マウスのVTAにおけるレポータータンパク質(eYFP)の免疫蛍光イメージング(eYFP)によって検証された(図2)。海馬におけるシナプス前VTAグルタミン酸突起の前向き標識化に成功したDG、CA3、CA1の層におけるeYFP検出によっても検証された(図6a–d;ムービー 2 と 3.

海馬調節CA1活性へのVTAグルタミン酸予測

VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激は、推定錐型CA1ニューロンの活性を増加させた。これは、ライトオフフェーズ(図5a–b)と比較した場合、ライトオンフェーズ(M...

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ディスカッション

過去10年間で、AAV構造の設計は大幅に進歩しました。このように、より多くのニューロン特異的プロモーターが、改善されたトランスフェクション特異性14のためのAAV血清型の配列に組み込まれている。蛍光タンパク質、トランスポーター、受容体、イオンチャネルの遺伝子を組み合わせることで、イメージング、神経変調、シナプス活性検出用のAAVライブラリが存在するようになりました。市販のAAV構築物において、遺伝的にコードされたフルオロフォアとイオンチャネル(オプシン)の組み合わせは、神経回路14、18、19の神経解剖学的および電気生理学的トレースを組み合わせることができる。同様に、プロモーター(またはcre-lox再結合法)の選択は、回路内のニューロン型特異的突起のトレースを可能にすることができる。現在の研究では、このプロトコルは、海馬(CA1領域)へのVTAグルタミン酸神経投影の解剖学的および電気生...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作品は、OOMに授与されたCBSブリッジンググラントによって資金提供されています。OOM、PAA、およびASは、研究を設計し、実験を行いました。ASとPAAは結果を分析した。OOMとPAAは原稿を準備しました。AAVを利用できるようにしてくれたカール・ディスセロス博士(スタンフォード大学)に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3% 過酸化水素フィッシャー化学H312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYPAddgeneプラスミド #26969
BNC ケーブルAmazon
BNC スプリッターAmazon
セラミック スプリット メイティング スリーブ Ø1.25mmフェルール。ThorlabsADAL1-5
ドリルドレメルLR 39098
ゼラチンコーティングスライドフィッシャーサイエンティフィックOBSLD01CS
ハミルトンの注射器 (Neuros)WPI Inc.06H
ヘッド ステージ アダプターニューロネクサスAdpt-Q4-OM32
高インピーダンス シリコン プローブニューロネクサスQ1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch レコーディング コントローラーINTANRHD2000
ヨウ素溶液Dynarex1425
イソフルランピラマルNDC 66794-017-25
ケタミンスペクトラムK1068
LEDドライバーThorlabsLEDD1B
LED光源(470 nm)-青色光ThorlabsM470F3
マイクロマニピュレーター成重M0-203
光ファイバーThorlabsCFMLC14L05
なべ頭フィリップスネジ (M0.6 X 2mm)AmazonM0.6 X 2mm
プリアンプヘッドステージ(32チャンネル)INTANC3314
Stereotaxic frameKopf1530
TTL pulserPrizmatix4031
UrethaneSigmaU2500
XylazineAlfa AesarJ61430
SoftwareCompanyバージョン
Graphpad プリズムGraphPadソフトウェア バージョン 8
Intan レコーディング コントローラーIntantechバージョン 2.07
NeuroexplorerNex Technologiesバージョン 5.215
Plexon オフライン スパイク ソーターPlexon Incバージョン 4.5
ACSF 構成: ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 23, 3 KCl, 1.25 NaH2sub>sub, 1 MgCl2>,<><>
2 CaCl<サブ>2および25グルコース)。

参考文献

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