グノトビオティック・アメリカン・ゴキブリの設立と維持 (ペリプラネタ・アメリカーナ)

グノトビオティック動物は、マイクロバイオーム研究^1、2、3のための非常に貴重なツールであることが証明^{されています}。無菌および定義された植物相動物は、宿主免疫応答、腸上皮成熟、および宿主代謝^{1、4、5、6、7}を含む宿主微生物相互作用の解明^を可能にした。単純化されたコミュニティを接種したグノトビオティック動物はまた、腸内の微生物と微生物の相互作用、特に交差摂食および拮抗関係を解明する際に、8、9、10、11をより完全に理解するのを助けた。哺乳類の腸内微生物叢における研究のための現在の好ましいモデルシステムは、マウスモデルである。このシステムは、上記の発見において不可欠でしたが、重要な欠点は、関連するコストです。特別な装置と高度な訓練を受けた技術者は、グノトバイオティクス施設を設立し、維持する必要があります。これは、動物動物の動物維持のあらゆる側面に与えられなければならない特別な注意と組み合わせて、動物動物を標準的な動物モデル¹²よりも10〜20倍の費用がかかるグノトビオティック動物を引き起こす。高コストのため, 多くの研究者は、グノトビオティックマウスモデルを買う余裕がないかもしれません.さらに、マウスモデルは、人間の健康に翻訳することを探している研究のための最も広く受け入れられている選択肢かもしれないが、人間とマウスの間の多くの生理学的および形態学的な違い^{があります 13}.明らかに、腸内微生物叢の多くの側面に関する増え続ける質問に答えるのに十分な特異なモデルはありません。

昆虫モデルは、哺乳類の種と比較してメンテナンスコストが低いため、安価な代替品です。さまざまな昆虫種の広範な無菌およびグノトビオティック研究は、複数の一般的に使用されるモデルの開発につながっている。蚊とショウジョウバエは、世界的な疾患と遺伝的な難病への関連性のために生殖不能な仕事のための一般的なモデルである^14,15.もう一つの新興モデルシステムは、ミツバチ(アピス・メリベラ)の、受粉と社会性研究におけるその重要性を考えると¹⁶である。しかし、これらの一般的に使用される昆虫の多くは、哺乳類の腸内群¹⁷に見られる分類学的複雑さを欠き、より高次の相互作用をモデル化する能力を制限している。アメリカのゴキブリの腸内に見られる微生物の多様性の総量は哺乳類に似ているだけでなく、ゴキブリの腸内に存在する微生物の多くは、哺乳類およびヒトの腸内微生物叢に一般的に見られる家族およびフィラに属する^。ゴキブリの後腸はまた、哺乳類の大腸に機能的に類似しており、栄養分^19,20の抽出を補助する細菌を密集した発酵室である。最後に、ゴキブリの雑食性は、食事の専門家では不可能であろう食事療法の多様性を可能にします。

アメリカのゴキブリは、高等生物の腸内微生物群集を理解するための有用なモデルシステムであり得るが、ゴキブリの害虫としての地位は、このシステムを害虫駆除²¹に関連する。腸内のコミュニティのゴキブリの健康と生理学への影響に関する基本的な知識を活用することは、害虫管理のための新しい技術の開発に支援します。

この方法の目的は、グノトビオティックアメリカゴキブリ(ペリプラネタアメリカーナ)の確立と維持の包括的な説明を概説することですが、このプロトコルは、任意の排卵ゴキブリのニンフを生成するために使用することができます。成熟したオテカエの効率的で非侵襲的な収集のための方法と、昆虫^22、23、24のグノトバイオティクス状態を監視する非破壊技術^が含まれる。グノトビオゴキブリを達成し維持する以前の方法は、oothecaコレクション23、24、25、26、27を記述しているが、ootheca成熟度は、種固有の手がかり(Blattellaゲルマニカ^{22、24、25)}の観点から解釈されるか、または明示的に記述されていない^27、28であり^、システムに不慣れな人にとっては実装が困難である。ここで説明する方法は自然に落とされたウーテカエを使用するため、卵を早期に除去する誤差は存在しない。このプロトコルには、培養依存的な品質管理方法と文化依存性の両方の方法が含まれ、培養に依存する方法は、昆虫を犠牲にする必要はありません。最後に、この方法は、複数のグノトビオティックゴキブリ研究からの情報をまとめ、Gnotobioticゴキブリを達成し維持するために必要なすべての情報を含む包括的なプロトコルを作成します。

1. 材料の準備

1. ストックゴキブリ文化の維持
   注:これらの堅牢な昆虫を飼育する多くの方法があります。避難所と水を提供する際の詳細は、アクセス可能な材料(すなわち、段ボールチューブの代わりに卵のカートン)によって異なる場合があります。次の滅菌プロトコルは、任意のストックタンクのセットアップに対して動作します。
   1. 37.85 L (10 ガロン) の魚のタンクに十分なウッドチップの寝具を広げて、約 1 インチの寝具でタンクの底を覆います。(平らな)段ボールを2分の4に切って住宅を準備します。段ボールの管(例えば、トイレットペーパーチューブ)とタンクの一端に積み重ね管に段ボール片を挿入する(図1)。
   2. 昆虫の脱出を防ぐために、タンクの内側の上2インチに石油ゼリーの薄い層を塗ります。
      注:タンクの角の内側を適切にコーティングしてください。
   3. 以前のストックタンクから(占有された)段ボールチューブを転送してゴキブリを追加し、住民を解放するためにそれらを振ります。各転送のために、100-200混合年齢、混合セックスゴキブリを移動します。ドッグフード(20~30個)を加え、タンク内のドッグフードの量を監視し、低いときに補充します。
   4. 水皿をセットする。
      1. 小さなプラスチック製の再利用可能な食品容器に二重蒸留水(ddH₂O)を充填します。食品容器の蓋にセルローススポンジと穴をほぼ同じ大きさに切ります。
         注:セルローススポンジは、ゴキブリが水皿に溺れるのを防ぎます。
   5. 蓋の穴にスポンジを挿入し、充填された容器の上に蓋を置きます。容器をタンクに入れ、低い時に補充します。綿布でタンクを覆い、弾性バンドで所定の位置に固定します。
   6. タンクが過剰な量のフレームや昆虫の死骸を蓄積し始めると、新しいタンクを設置し、ゴキブリを移送します。
      注:タンクは通常6ヶ月ごとに転送されます。廃炉ストックタンク内の残りのゴキブリ/卵は、1時間-20°Cで凍結することによって安楽死させられ、ストックタンクの内容物は、その後、オートクレーブバッグに移され、処分前にオートクレーブ(1時間、重力サイクル)に移されます。ストックタンクは、使用間に2%の漂白剤で滅菌されます。
2. 二次容器を消毒する。
   注:このコンテナにはフィルタは含まれていませんが、代わりに無料の空気交換が可能です。
   1. 蓋と底の両方の内側に2%の漂白剤をスプレーし、10分間浸します。きれいなペーパータオルで漂白剤を拭き取ります。
   2. 蓋の内側と底部に70%のエタノールをスプレーし、清潔なペーパータオルで拭きます。使用するまで蓋を交換してください。
3. 卵や住宅のニンフをインキュベートするためのBHIスラントとフラスコを作ります。
   1. パッケージの指示に従ってBHIを準備し、2%寒天を追加します。明確になるまでBHI-寒天溶液を沸騰させます。
   2. スラントの場合は、5 mLアリコートを18 mm x 150 mmガラス試験管とキャップに移します。オートクレーブ(滅菌時間=20分、液体サイクル)を介して滅菌します。45°の角度でオートクレーブチューブを置き、スラントに冷却します。固めたら、乾燥を防ぐために使用するまで冷蔵する。
   3. フラスコの場合、煮たBHI寒天溶液の10 mLアリコートを250 mLのエルレンマイヤーフラスコに移し、フラスコの底部を完全に覆います。フラスコをホイルで覆い、オートクレーブ(20分、液体サイクル)で滅菌します。オートクレーブフラスコを冷却し、乾燥を防ぐために使用するまで冷蔵します。
      注: このセットアップにはエアフィルタは必要ありません。ホイルカバーは、オープンエアフローからの汚染を防止しながらガス交換を可能にするのに十分です。
4. オートクレーブを介して殺菌:ホイルで覆われたビーカー(滅菌時間= 1時間、重力サイクル)で半サイズ(約1/2インチ)に分割されたオートクレーブ可能なラットチャウ、キャップボトルのddH₂O(滅菌時間= 20分、液体サイクル)、およびホイルで覆われたビーカーの鉗子(滅菌時間= 20分、重力サイクル)。
   注:ラットチャウビーカーをオーバーフィルしないでください。ペレットはオートクレーブで膨らむ。
5. 「産科病棟」タンクを設置する。
   注:このタンクにはストックタンク(段ボールチューブ、スポンジ付きの水皿、ドッグフード、ウッドチップ寝具、 図1参照)と同じ材料が含まれており、oothecaeコレクションのために転送されない限り、ゴキブリは空でなければなりません(セクション2参照)。
6. 過飽和塩化ナトリウム(NaCl)溶液を満たしたビーカーを調製して、インキュベーターを加湿します。この溶液を調製し、DDH_2Oの100mLあたり37gのNaClを加え、溶解するまで撹拌します。
   注:通常、500 mLの飽和塩溶液は、通常、チャンバー寸法51cm x 46 cm x 46 cm(H x W x D)を加える前に、約1ヶ月間、培養器を湿気させます。

2. オテカエのコレクション

1. ウーテカイ(図2)を運ぶ女性(計画実験に応じて任意の数)をストックタンクから「産科病棟」に移し、鉗子を使用して、グラビドメスを含む段ボールチューブを移動します。
   1. 車のチューブにグラビドメスに加えて複数の昆虫が含まれている場合は、まずチューブを振り出して石油ゼリーで鳴らされた追加のプラスチック容器に入れ、次にターゲット昆虫が一人で段ボールチューブに戻るように促します。
2. 彼らは彼らのオテカイを落とした後、ストックタンクに戻って女性を転送します。鉗子でタンク内のごみからオテカエを取り出します。
   注:オテカエは、多くの場合、転送されている女性の24時間以内にドロップされます。

3. オテカエの洗浄

1. 3 mLのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む5mL遠心分離管にオテカエを加えます。10 sのための渦。新鮮なSDSを含む遠心管で2回目の洗浄ステップを繰り返します。
   注:SDSの3 mLあたり最大5つのオテカエを使用することができます。
2. 繊細な作業ワイプを使用して、各オテカの表面を静かにこすって破片を取り除きます。徹底的なクリーニングを支援するために、より多くのSDSを追加することができます。洗浄されたオテカエを計量艇に入れ、殺菌の準備が整うまで置きます。
   注: プロトコルはここで一時停止する場合がありますが、oothecae を長期間(数日から数週間)低湿度環境に放置すると、脱水症状が発生し、生存率が失われます。

4. オテカエの殺菌とインキュベーション

1. 滅菌後の水のアリコート滅菌水滅菌されるすべてのオテカのために、滅菌水の1 mLで2つの1.5 mL遠心分離管を充填します。
2. 濃縮物を10μL加える(32%)5 mL 遠心分離管内の 3.2 mL の ddH₂O に対する過酢酸ストック溶液を、殺菌用の 0.1% 溶液を作成します。キャップと反転を数回混合します。
   注意:過酢酸は皮膚や肺と接触して有害です。ヒュームフードで希釈します。
   注:これは、殺菌と同じ日に行う必要があります。あらかじめ希釈すると、溶液はすぐに分解され、適切に殺菌されません。5個もの洗浄済みオテカエを3.2mLの希酸で滅菌することができる。
3. 0.1%の過酢酸溶液に(最大5個)洗浄したオテカエを5分間入れます。チューブを60sごとに数回反転します。
4. 層流フードでは、滅菌鉗子を使用して、各オテカを、分け入れ菌リンス水を入れて独自の遠心管に移します(ステップ4.1)。ミックスするために数回反転します。2回目のすすいで繰り返し、滅菌鉗子を使用してそれぞれのリンスオテカを独自のBHI傾斜に移します。
5. 滅菌された二次容器にスラントを入れます。孵化するまで4〜5週間、30°Cの加湿インキュベーターに容器を移動します。
   注:スラントは、小さな試験管ラックまたは中小ビーカーによって直立して保持することができます。
6. スラントを定期的に確認します(週1-2倍)。寒天に真菌または細菌コロニーの成長が現れた場合は、汚染された傾斜を取り除きます。4週間のタイムポイントが近づくと、毎日スラントをチェックしてください。
   注:一度孵化すると、ニンフはBHIだけで数週間まで生き残ることができますが、最適に成長しません。

5. グノトビオティックニンフのメンテナンス

1. 層流フードでは、無菌鉗子で調製されたBHIフラスコ(ステップ1.3.3から)に殺菌されたラットチャウのペレットを無菌的に移す。滅菌性チェックとして、フラスコを24時間30°Cインキュベーターの二次容器に入れ、増殖が現れる場合は使用しないでください。
2. 無菌食品ペレットでBHIフラスコにニンフを加えます。BHIの傾斜からそれらを振り、彼らはラミナーフローフードでフラスコに落ちてみましょう。
   注:ニンフは試験管のガラス壁に牽引力を持っていません。チューブを振って傾斜部分からノックオフし、チューブを傾け、ガラスをフラスコに滑り込まさせるのが効果的です。ニンフは鉗子を使って移すことができるが、致命的な傷害のリスクは高い。
3. フラスコのBHI床に直接ピペットを入れ、ラミナーフローフードで週に1回300 μLの無菌水を水にします。
4. ニンフフェックがBHI床を覆い始めると、新しいBHIフラスコに移し、ステップ5.1のように(滅菌を検証するために)事前に殺菌されたラットチャウ24時間を加える。

6. 無菌の品質管理

1. 制限フラグメント長ポリモーフィズム(RFLP)を介してグノトビオティック状態の培養に依存しない品質管理チェックのために犠牲にするためにBHIフラスコから1つのニンフを取り除きます。これを行うには、無菌遠心分離管(ステップ5.1からのニンフの移動に似ています)にニンフを注ぐか、無菌木製アプリケーターをフラスコに入れ、ニンフが登り始めるのを待ってから遠心分離管に移します。
2. 遠心管のニンフに0.5mのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、すべての大きな部分が分解されるまで無菌マイクロペステスルで均質化します。渦はよく。
3. 細菌DNA抽出キット(材料表)を用いて、ニンフホモジネートからDNAを抽出します。
   1. 5,000 x g で10分間均質化されたニンフを遠心分離し、上清を取り除きます。サーマルシェーカーを37°Cに予熱します。
   2. 1x Tris-EDTAを100 μL、渦を加え、ペレットを完全に再懸濁します。10 μLのリソチームを加えて混ぜ、次に予熱した37°Cサーマルシェーカーで30分(揺れなし)インキュベーションを行います。
   3. サンプルに25mgのガラスビーズを加え、最大速度で5分間渦を加えます。サーマルシェーカーを55°Cに予熱します。
   4. 100 μL のプロテナーゼ K バッファーと 20 μL のプロテナーゼ K. ボルテックスを使用して新しい 1.5 mL 遠心分離管に上清を移す前にビーズを落ち着かせるようにします。
   5. インキュベートは、600rpmで振盪し、55°Cのサーマルシェーカーで60分間行う。2分間10,000xgで遠心分離機、上清を新しい1.5 mL遠心管に移します。サーマルシェーカーを65°Cに予熱します。 溶出バッファーを 65 °C ハイブリダイゼーションオーブンで予熱します。
   6. 220 μLのエタノールを100%加えます。20 sの最高速度で渦。10倍上下にピペットを入れて、目に見える沈殿物を分解します。
   7. DNAカラムを2mLの採取チューブに挿入し、形成した可能性のある任意の沈殿物を含むカラムにサンプルを移す。10,000 x g で1分間遠心分離機を、回収管から濾液を捨てて、回収管を交換してください。
   8. 500 μL の結合バッファーをカラムに加え、遠心分離機を 10,000 x g で 1 分間追加します。コレクションチューブから濾液を捨て、回収管を交換してください。
   9. カラムに700μLのDNA洗浄バッファーを加え、遠心分離機を10,000 x g で1分間追加します。コレクションチューブから濾液を捨て、回収管を交換してください。2回目の洗浄手順を繰り返します。
   10. 遠心分離機空柱を2分間乾燥させ、その後新しい1.5 mL遠心分離管に移した。50 μLの予熱溶出バッファーをDNAカラムマトリックスに直接加え、65°Cで5分間インキュベートします。
   11. 10,000 x g で遠心分離機を1分間に溶出する。分光光度測定またはフルオロメトリーを介して濾液中の抽出DNAを定量化する。
4. 16S遺伝子全体を増幅して消化する。ゲル電気泳動を用いてフラグメントを可視化する。
   1. 2xマスターミックスの12.5 μL、各プライマー1492R(5'-GGTTACCTGTTACGACTT)および27F(5'-AGAGTTTTGTCCGGCTCTCAG)、5 ngのDNA、および分子グレードの水を使用して25μLの総反応量を達成します。
   2. 次のサーモサイクラープログラムを実行します: 60 sのための94 °C;続いて、30 sの94°Cの35サイクル、45sの50°C、90sのための68°Cが続きます。68°Cを5分間続く。
   3. DNA精製キット(材料表)を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)製品を精製する。
      1. PCR産物に120μLの精製バッファーを加え、混合する渦を加えます。蓋の中に液滴を集めるために簡単に遠心分離機。DNAカラムを2mLの回収チューブに挿入し、調製したカラムに液体を移し、13,000 x g で1分間遠心分離機≥。
      2. 濾液を捨てて、回収管を交換してください。700 μL の DNA 洗浄バッファーと遠心分離機を ≥13,000 x g で 1 分間追加します。濾液を捨てて、回収管を交換してください。2回目の洗浄手順を繰り返します。
      3. 2分間空の柱を乾燥させて新しい1.5 mL遠心管に移します。50 μLの予熱溶出バッファーをDNAカラムマトリックスに直接加え、室温で2分間インキュベートします。
      4. 10,000 x g で遠心分離機を1分間に溶出する。分光光度測定またはフルオロメトリーを介して濾液中の抽出DNAを定量化する。
   4. 精製PCR産物1μgを5μLの消化バッファー、10単位のRsaI、分子グレードの水に加え、総反応量50μLに加え、37°Cで60分間インキュベートします。
   5. 2%アガロースゲル上で20μLの消化DNAを実行することにより、ゲル電気泳動で消化された製品を分離します。ゲルを視覚化して、グノトビオティックの状態を確認します。
      注:グノトビオティック昆虫は、402 bp、201 bp、および163〜148bpのスミアのバンドを、endosymbiont、 ブラタバクテリウムの16S rDNA配列に基づいてのみ生じるべきである。ゲルに見られる余分なバンドは、微生物種を汚染していることを示しています。

7. ニンフガルの成長の無菌追跡

1. フラスコの半透明のBHI床を通して昆虫を測定することによってニンフルの成長を追跡するために体長を記録する。
   注:ニンフは、動きを遅くするために4°Cに15分間置き、測定しやすくすることができます。

ストックタンクは図 1に示すように設定されています。「妊娠した」女性は、 図2に示すように、後腹部に付着したオテカによって識別される。BHI寒天上のオテカのインキュベーションは、非破壊的な方法でグノトビオティック品質管理を可能にする。場合によっては、殺菌が失敗し、 図3Bのようにウーテカの周りに成長が現れます。これらのウーテカエは削除し、廃棄する必要があります。我々の手では、殺菌に対して10%の平均故障率が認められた(n=51)。oothecaeハッチは、 図3Aに示すように、培地上で増殖せずに滅菌後平均34日をハッチする。滅菌された非汚染オテカの典型的なハッチ率は41%(n = 46)で、1oothecaあたり平均11ニンフを観察しました。 図4のように、より大きなニンフはホイルで覆われたBHIフラスコに移されます。ホイルは汚染を防ぎ、ニンフは成長する余地がある。均質化されたニンフからの16S rDNAのRFLPは、グノトビオティックの状態を確認するために使用される。グノトビオティックニンフは、 図5に示すように、非無菌のニンフよりも遅い速度で成長することが観察されている。 図6 は、正常にグノトバイオティクス昆虫だけでなく、標準(非無菌)ニンフからの結果を示しています。

この試験は、陽性の培養結果がない場合の汚染をまだ特定していないが、このステップは、酸素感受性または潔癖性微生物の汚染を排除するための重要な実験中に日常的に行われている。標準的/無菌昆虫と比較して、生殖神経ゴキブリでは成長が遅く見られた。

図1:ゴキブリのストックカルチャーのセットアップ
段ボールチューブは、タンクの端に積み重ねられています。食料と水はタンクの前部近くにあります。綿布カバーと弾性バンドは、視認性のために取り外されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:"妊娠"アメリカゴキブリ。
矢印はオテカを示しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:BHIスラント上で正常にグノトビオティックニンフが孵化し、滅菌に失敗した画像。
このプロトコルに記載されているように、オーテカエを殺菌し、インキュベートした。(A)BHI傾斜の微生物の増殖の欠如は、昆虫が、培養可能な生物を含まないことを示す。(B) コロニー形成をもたらすスラント上のオテカエは、汚染されたものとして廃棄されるべきである。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:グノトビオティック飼育装置。
昆虫は、汚染を防ぐためにホイル蓋で覆われた無菌フラスコに保管されます。二次容器(緑色の蓋)は、2%の漂白剤とそれに続く70%エタノールで殺菌される。二次コンテナ内の空気の流れは制限されません。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:生殖腺生物と非生殖腺の体長を比較した代表的な成長率データ。 昆虫の両方のグループは、オートクレーブげっ歯類の食事を与えられました.グノトビオティック昆虫(ここでは:n=105)は、記載されているようにBHI上に保持される。無菌昆虫(ここではn = 50)は、水のための小さな皿とオートクレーブウッドチップ寝具付きのフラスコに住んでいます。無菌ニンフは平均0.059 mm/日で成長し、グノトビオティックニンフは0.028 mm/day(p < 0.0001)で成長します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:品質管理のためのRFLP結果の代表的なゲル画像。
全16S遺伝子アンプリコンをRsaIで消化した。PCR用のDNAを、1x PBSで均質化したニンフから抽出した。「Gニンフ」レーンはグノトビオティックニンフに対応し、「conv nymph」レーンは従来の非生殖管に対応します。仮想制限ダイジェストに基づいて、endosymbiont(Blattabacterium)は、163 bpと148 bpの間のバンドのスミアを有するサイズ402 bp、206 bp、および163 bpのバンドを有することが期待される。グノトビオティック昆虫は 、ブラタバクテリウム バンディングパターンのみを示す必要があります。混合細菌群集は、様々なサイズのバンドのスミアを有することが期待され、ここでは「他の細菌16S断片」とラベル付けされる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは開示する利益相反を持っていません。