このプロトコルは、検査用神経筋研究のためのラットの声の折り目を準備するために使用される方法を記述します。
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この記事について
サマリー
要約
このチュートリアルの目的は、神経筋の研究のためのラットの声の折り目の準備を説明することです。このプロトコルは、ラット喉頭解剖、フラッシュ凍結、および声帯の凍結切断の手順を概説する。本研究では、縦方向および断面面の両方で声を折るクライオセクションの方法を説明する。このプロトコルの目新しさは、本質的な喉頭筋の正確な同定を保証し、組織喪失の可能性を低減する、凍結切断中の喉頭追跡である。図は、両方の平面の進行性の凍結切断を示しています。29匹のラットヘミ喉頭は、甲状腺軟骨の出現から、完全な声の折り目を含む最初のセクションの出現まで、凍結切断され、追跡された。完全なボーカルフォールドは、両方の平面のすべての動物のために視覚化されました。甲状腺軟骨の出現から両方の平面におけるフルボーカルフォールドの出現までの距離には、高いばらつきがあった。体重は喉頭のランドマークの深さと相関しておらず、個々の変動性および組織製剤に関連する他の要因が、断面化中のランドマークの出現における高い変動性を引き起たす可能性があることを示唆した。本研究は、方法論を詳述し、組織化学的神経筋の調査のためにラットの声の折り目を準備するための形態学的データを提示する。個人の変動性が高いため、喉頭のランドマークは、組織および組織の損失を切除することを防ぐために、凍結切断中に密接に追跡する必要があります。ラット喉頭内のランドマークの適切な組織準備と意識を含む一貫した方法論の使用は、研究全体で一貫した結果を支援し、喉頭神経筋メカニズムを調査するためのモデルとしてラットボーカルフォールドを使用することに興味を持つ新しい研究者を支援します。
概要
ラット喉頭は、発達、老化、疾患および薬理学的薬剤1,2,3,4,5に対する構造的および機能的な神経筋喉頭適応を調査するための確立されたモデルである。組織学的方法の一貫性は、筋肉の準備と分析に関与する複数の複雑さだけでなく、喉頭軟骨内にカプセル化された筋肉の喉頭の大きさ、形状、および地形に関連する課題があるので、この作業ラインに不可欠です1,6,7,8,9,10,11 .ラットの本来の喉頭筋のサイズが小さいため、系統的埋め込み、凍結、および凍結切断は、一貫した正確な結果を達成するために重要です。例えば、ラットの声帯をコロナ平面で切り離すとき、4つの内在....
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プロトコル
この研究は、ニューヨーク大学医学部の施設動物ケア・使用委員会に従って行われました。
1. ラット喉頭を解剖する
- 制度的に承認されたプロトコルに従ってラットを安楽死させる。組織標本の毛皮の汚染を防ぐために、下顎からマニュリウムに腹側の首を剃り、アルコールで綿棒を剃ります。
- 10倍の拡大率を持つ解剖スコープの下で、気管が露出するまでメスで中線の首の切開を作成することによって喉頭全体を切除する。
- 中線で腹側外線喉頭筋を分離し、鉗子と解剖ハサミまたはメスを使用して喉頭を露出させます。
- 気管尾骨を第3気管リングに切断し、舌骨に切開ロストラルを作り、切除ハサミを使って喉頭全体を切除する。
- 拡大縮小の下で、マイクロディスセクションツール(ピンセット、ピン、ピン、マイクロシザー)を使用して喉頭から外因性喉頭組織(食道、甲状腺、外回喉頭筋)を取り除きます。
- マイクロシザーでは、後部コラリテノイド筋肉の間の正中線をランドマークとして使用して、喉頭をarytenoidの間にドーセリーします。喉頭の横壁をピンで留め、声帯を露出させ、次いでマイクロシザーで声の前部のコミュシャの間の甲状腺軟骨の正中線を通って腹孔を二分する(図1)。
注: この手順はオプションです。喉頭全体を保つためにスキップすることができます。喉頭の二....
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結果
代表的な結果は、喉頭神経筋系における声の運動の影響に関する継続的な調査の一環であった。29匹の雄フィッシャー344/褐色ノルウェーラット(生後12匹、24ヶ月齢12匹)を計量し、CO2 吸入で安楽死させ、続いて両側性乳房離脱手術を行った。
手順は、NmJと側面および内側TA筋肉の繊維サイズにラベルを付けるために概説されたプロトコルに従った。喉頭のランドマーク間の距離は、喉頭筋と周囲の軟骨を使用して縦方向および断面の両方で追跡され、凍結切断中の進行を決定した(表1)。追跡は、両方の指向性面で甲状腺軟骨の最初の出現で開始されました。図2は、TA筋肉の内側と層状に現れる甲状腺(図2a、b)との時間的順序での断面の極性の断面の目印の出現を示す(図2c,d)。
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ディスカッション
神経筋解析のためのラットの声帯を準備すると、様々な課題を提示することができます。喉頭筋は軟骨に囲まれ小さいだけでなく、標的筋を直接抽出することが困難となり、喉頭解剖学的ランドマークの深部に動物間に高いばらつきも見られた。筋肉の断面平面プロトコルの場合、完全な声の折り目のセクションは、腹側甲状腺軟骨の最初の出現後に21-85セクション(1セクションあたり10 μm)の間に現れました。
各種類のプロトコルの組織の均一な埋め込み、配向、および断面にもかかわらず、喉頭のランドマーク間の距離に変動性が指摘された。さらに、体重の違いは、喉頭ランドマークの1セットから次のセットまでの組織深さの広い範囲の変動を考慮していなかった。喉頭のランドマーク間のこの距離の変動は、動物間の喉頭解剖学の個人差、解剖時のOCT化合物内のクリオマール内の喉頭の配向の小さな違い、または断面時に検体円盤に標本を配置した方法(すなわち、離れ取りまたは配置の差の差の前に検体に置かれたOCT化合物の量)に起因する可能性がある。
検体調製.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、国立国立衛生研究所の難聴やその他のコミュニケーション障害研究所のF31DC017053-01A1(LENELL、PI)およびK23DC014517(ジョンソン、PI)の助成金によって支えられた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2-メチルブタン認定 | フィッシャーケミカル | 35514 | |
| アルミホイ | ルフィッシャーブランド | 1213101 | |
| クライオトングSS | サーモサイエンティフィック | 11679123 | |
| クライオスタット | カバイオシステムズ | CM3050 | |
| オスタットブレードCL | ターキー D554X50 | 22-210-045 | |
| 使い捨てベースモールド15mmx15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| ディスポーザブルアンダーパッド | Medline | 23-666-062 | |
| 解剖キット | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS - ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 | Gibco | 14190136 | |
| 冷凍切片 ミディアム | フィッシャーヘルスケア | 23-730-571 | |
| アイスバケツ | ベルアート | ||
| 免疫染色モイスチャーチャンバー | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| ニードルホルダー | Assi | ASSI.B148 | |
| 不織布スポンジ、4 プライ | クイック メディカル | 9023 | |
| オービタル シェーカー | Troemner | 02-217-987 | |
| パップ ペン | |||
| パラホルムアルデヒド、16% w/v aq. soln.、メタノールフリー | アルファ エーザー | 50-00-0 | |
| プレミアム マイクロ遠心チューブ | フィッシャーブランド | 5408129 | |
| 試料保管バッグ | フィッシャーブランド | 19240093 | |
| ステンレス鋼目盛り測定32オンス/ 100ミリリットル | ラーウェア | 114231B | |
| スーパーフロストプラス顕微鏡スライドフィ | ッシャーブランド | 12-550-15 | |
| タスクワイパー | キンバリークラークプロフェッショナル&トレード; 34155 | 06666A | |
| タイマー | フィッシャーブランド | 2261840 | |
| バンナスパターンはさみ | Assi | ASSI。 | |
| 注:すべての消耗品について、これらは購入する機器の例です。私たちの方法を完成させるために、正確なモデルは必要ありません。 |
参考文献
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al.
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再版と許可
