方法論記事

リナル皮質-海馬の組織性スライス培養におけるてんかん発生のモデル

DOI：

10.3791/61330

⸱

2021年3月18日

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacologia e Neurociências, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、鼻皮質海馬の組織性スライスの調製について述べています。徐々に制御された血清の剥奪の下で、これらのスライスは進化するてんかんのような出来事を描写し、てんかん発生の元vivoモデルと考えることができる。このシステムは、自発的な活動のダイナミクスを監視するだけでなく、てんかん発生の過程を通じて神経炎症性の進行を評価するための優れたツールを表します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organotypic スライス培養は脳障害のモデル化に広く使用されており、薬物の神経保護および治療の可能性を評価するための優れたプラットフォームと考えられています。オルガノシピックスライスは、組織を植え付けて作製し、複雑な多細胞ex vivo環境を表します。彼らは、脳細胞の3次元サイトアーキテクチャと局所環境を維持し、ニューロンの接続性およびニューロングリア相互相互作用を維持する。海馬のorganotypicはてんかん発生の基本的なメカニズムを探求するのに適していると考えられているが、てんかんの臨床研究および動物モデルは、骨膜および内皮質で構成される鼻皮質が発作発生に関連する役割を果たすことを示唆している。

ここでは、鼻皮質海馬の組織性スライスの調製について述べています。完全な成長培地を灌流下のCA3領域からの自発的な活動の記録は、生理学的温度で、薬理学的操作がない場合、これらのスライスが培養中の経時に進化するてんかんのような事象を描写することを示した。細胞死の増加は、ヨウ化プロピジウム取り込みアッセイを介して、およびグリオシス、蛍光結合免疫体化学で評価され、また観察された。実験的アプローチは、てんかん発生のダイナミクスと進行を研究し、この脳病理の潜在的な治療標的をスクリーニングするためのプラットフォームとしての鼻皮質海馬組織学スライス培養の価値を強調する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

てんかんは、世界で最も流行している神経疾患の1つであり、脳内の同期および過剰な神経活動の周期的かつ予測不可能な発生によって特徴付けられる。様々な抗てんかん薬(AED)が利用可能であるにもかかわらず、てんかん患者の3分の1は治療1 に難治性であり、発作および認知機能低下を経験し続けている。さらに、利用可能なAEDは、神経活動に対する比較的一般化された行動による認知を妨げる。てんかん発生は、複数および不均一なてんかん原発性傷害、数ヶ月から数十年続く長い潜伏期間、および最初の自発的発作後の抗けいれん治療の誤解を招く影響のために、ヒトでは研究が困難である。

てんかんの治療のための潜在的な治療薬の同定は、てんかんの動物モデルのために可能になった:1)遺伝的モデルは、発作が自発的に、または感覚刺激に応答して起こる遺伝的に素因のある動物を使用する。2)電気刺激誘発発作のモデル;3)ピロカルピン(ムスカリン受容体アゴニスト)、カイナテ(カイナテバ受容体アゴニスト)または4-アミノピリジン(カリウムチャネルブロッカー)を使用する発作誘導の薬理学的モデル。.これらのモデルは、行動変化の理解に不可欠であり、てんかんの根底にある分子および細胞メカニズムも重要であり、多くのAEDs 2の発見に至った。

Ex vivo製剤は、てんかん発生および分新形成の根底にあるメカニズムを探求するための強力なツールでもあります。急性海馬スライスは、6〜12時間の期間にわたって生きている細胞の電気生理学的研究を可能にし、そして数日または数週間にわたって培養器に保存することができる組織学的海馬スライスは、てんかん活動3の研究で広く使用されてきた。

Organotypic脳スライスは、植えられた組織から調製され、脳の生理学的3次元モデルを表す。これらのスライスは、関心領域の細胞アーキテクチャを保持し、すべての脳細胞とその細胞間コミュニケーション4を含む。 この領域は複数の神経変性状態における神経喪失の影響を受けるため、長期の組織性の培養に最も使用される領域は海馬である。彼らは広く脳障害をモデル化するために使用されており、薬物の神経保護および治療の可能性を評価するための優れたツールとして考えられています5,6.てんかん発生、脳卒中およびAβ誘発毒性のモデルは、海馬のorganotypicスライス7、8、9、10に記載された。パーキンソン病は腹側中皮系および線条体、ならびに皮質体体系梁線条体-実質的なニグラ、オルガノティクススライス11で探索された。オルガノシス小脳スライス培養は、軸索筋髄および小脳機能の多くの側面を模倣し、多発性硬化症12における新規治療戦略を調査するための広範なモデルである。

しかしながら、てんかんの臨床研究および動物モデルは、鼻根皮質が、近膜および内皮質によって構成され、発作発生13において役割を果たしていることを示唆している。このように、鼻皮質海馬組織のスライスにおけるてんかん発生のモデルが確立された14.徐々に制御された血清の剥奪の下で、鼻皮質海馬の組織ノティピックスライスは、常に血清含有培地に保持される類似のスライスとは異なり、進化するてんかんのような出来事を描写する。

てんかんでは、中枢神経系の多くの急性および慢性疾患と同様に、神経中心の視力は、疾患の発症および進行の根底にあるメカニズムを解明することができない。臨床的および実験的証拠は、てんかんプロセスに寄与する主要なプレーヤーの1つとして、ミクログリアとアストロサイトが関連する役割を果たす脳の炎症を指しています。てんかんの動物モデルにおける薬理学的実験は、抗てんかん作用は、炎症促進経路を標的とすることによって達成できることを示唆し、そして今日の神経炎症はてんかん15の治療アプローチの開発のための新しい選択肢とみなされている。

ここでは、鼻皮質海馬組織性スライス培養の調製と、それらから自発的なてんかん活動を記録するための詳細を十分に説明する。我々は、このシステムがてんかんのいくつかの神経炎症態様を模倣し、この病理におけるグリア細胞および神経炎症の役割を探求するのに適していることを強調する。さらに、てんかんに対する潜在的な治療アプローチのスクリーニングのための使いやすいプラットフォームを表す。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ポルトガルの法律と欧州連合(EU)のガイドライン(2010/63/EU)は、科学的目的のための動物の保護に関するすべての手続きで尊重されました。ここに記載されているすべての方法は、iMMの制度的動物福祉機関(ORBEA-iMM)と国家権限(DGAV – ディレソン・デ・アリメンタサン・エ・ヴェテリナリア)によって承認されました。

1. 鼻皮質海馬スライスの調製

注:鼻皮質海馬スライスの調製は、P6-7スプレイグドーリーラットを使用しています。

  1. 培養のセットアップと培地の準備
    1. 培養前日に、必要な培地を用意し、4°Cにします。
    2. 解剖培地を準備する:25 mMのグルコースをゲイのバランス塩溶液(GBSS)に入れます。
    3. 培養培地を調製する:50%オプティ-MEM、25%HBSS、25%ホースセラム(HS)、25 mMグルコース、30 μg/mLゲンタマイシン。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

組織の海馬のスライスにおけるてんかんシグナル分析の以前の記述に基づいて、頭蓋間てんかんの排出は、極性の急激な変化と低周波(<2Hz)で起こるバックグラウンド活動と明確に区別される発作性放電として定義されています。10s以上持続し、より高い周波数(≥2 Hz)で発生する発作性放電は、イクタルてんかん活性として特徴付けられる。イクタル イベントが前のイベントの後に 10 s 以内に発生した場合、これら 2 つのイベントは 1 つの ictal イベントと見なされます。

7 DIVの鼻皮質海馬組織性スライス(図3A)は、混合間間およびイクタル様活性を描写している。14 DIV(図3B)では、自発的な活動は、21 DIVで圧倒的なイクタル活動に進化するictal放電によって特徴付け、イクタルイベントは>1分(図3C)続く。

figure-results-1
図3:鼻皮質海馬組織の切片の自発的なてんかん活性。代表的な電解発作様事象は、インターフェース型チャンバ内のCA3領域から記録され、後(A)7DIV、(B)14DIV及び(C)21DIV.発作の詳細は下のトレースで示される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

PI取り込みアッセイの後に、ニューロンの死を特定することを目的とした神経マーカーNeuNに対する免疫組織化学が続いた。粒状ニューロンおよび錐体ニューロンによるPI取り込みは7つのDIVスライス( 図4Aの矢印)で観察されたが、PI+ ニューロンの数は14 DIV( 図4Bの矢印)で増加し、てんかん発生の進行によるニューロン死の増加を裏付ける。

figure-results-2
図4:NeuNおよびPI染色された鼻皮質海馬組織性スライスの代表的な画像。NeuN染色された成熟したニューロンおよびPI陽性細胞の画像を、20倍の目的を有する共焦点レーザー顕微鏡上の(A)7DIVおよび(B)14DIVで取得した。破線領域の拡大画像が表示されます。矢印は死のニューロンを指す(オレンジ色)。スケールバー、50 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Iba1の二重染色を、CD68と共に、ミクログリア表現型を評価するために使用した。Iba1はミクログリア/マクロファージマーカーであり、CD68は反応性ミクログリアによって高レベルで発現するリソソームタンパク質であり、ミクログリアを安静にすることによって低レベルで発現する。7 DIVスライスで、 低いCD68発現(図5Aの矢印)を持つミクログリアは、Iba1+/CD68+反応性ミクログリア(図5Aの矢印)よりも豊富であるのに対し、14 DIVでは海馬のすべての領域で、Iba1+/CD68+ブッシー/アモエボイドM1ミクログリア(図5Bの矢印)は低いCDB式(図5Bの矢印)を持つマイクログリアを上回る。14 DIVでは、Iba1+ /CD68+超影響出現の細胞を特定することができます (図 5Bのオープン矢印) これは、ミクログリアの M2 抗炎症表現型の発生を示唆する可能性があります。しかし、この問題はさらなる研究を必要とする。

最近の研究では、異なる発分CNS傷害が少なくとも2種類の反応性アストロサイト、A1およびA2を引き出し、A1アストロサイトは神経毒性16であることが示された。アストロサイトのA1サブタイプは、補体C316、17、18の発現の増加によって特徴付けられる。補体C3は、補体系の活性化において中心的な役割を果たし、さらにiC3b、C3dg及びC3d19に分解されるC3bを生成する。従って、GFAPおよびC3dの二重染色を使用して、アストログリオーシスを評価した。7 DIVではC3dの発現が検出がかろうじて可能である(図6A)、14個のDIVスライスで肥大化GFAP+/C3d+アストロサイトが観察され得る(図6Bの矢印)、A1アストロサイトの進行活性化を示唆する。

結果は、てんかん発生の過程を通じてミクログリアおよびアストロサイトの進行的活性化を示し、てんかん患者およびこの病理の動物モデルに記載された事象を模倣する。

figure-results-3
図5:Iba1およびCD68染色された鼻皮質海馬組織のスライスの代表的な画像。Iba1およびCD68染色ミクログリアと、Hoechst染色された核の画像を、20倍の目的を有する共焦点レーザー顕微鏡上の(A)7DIVおよび(B)14DIVで取得した。破線領域の拡大画像が表示されます。矢印はIba1+/CD68を指し、休息ミクログリア、矢印はIba1+/CD68+ ブッシー/アモエボイドミクログリアを示し、開いた矢印はIba1+/CD68+ 超突出したミクログリアを明らかにする。スケールバー、50 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:GFAPおよびC3d染色された鼻皮質海馬組織のスライスの代表的な画像。GFAPおよびC3d染色されたアストロサイトと、Hoechst染色された核の画像を、20倍の目的を有する共焦点レーザー顕微鏡上の(A)7DIVおよび(B)14DIVで取得した。破線領域の拡大画像が表示されます。矢印はGFAP+/C3d+ 反応性A1アストロサイト(黄色)を指します。スケールバー、50 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

てんかんの動物モデルは、多くのAEDの発見に不可欠であったが、多くの動物を必要とし、それらのほとんどは発作発症の潜伏期のために時間がかかる。海馬急性スライスにおけるてんかん活性の低マグネシウム誘導も文献3で徹底的に改訂されているが、急性スライスは6-12時間の生存率を有し、長期的な変化を評価することは不可能である。Organotypicスライスは、数日から数週間の培養で維持することができ、急性スライスの短い生存時間を克服することができ、および、組織語海馬スライスにおけるてんかん発生のモデルが3、7、8で提案されている。

ここでは、鼻皮質と海馬を含むorganotypicスライスの調製について説明する。これらのスライスは、動物ごとに準備するために15〜20分を要し、動物の犠牲から挿入物へのスライスの配置まで、そして半球当たり6〜8枚のスライスを得ることができます。海馬を露出させるために半球を開くとき、およびスライス後に濾紙から組織を取り除くときには、特別な注意が必要です。海馬の上の過剰な組織はまた、スライス中のスライスの完全性を損なう可能性があります。

鼻皮質海馬組織ノミスティックスライスは、生体内てんかんに似た進化するてんかん様の活動を描いている。文化の1週間後、ほとんどのスライスは、文化の時間と一緒に単にictalのようなイベントに進行する混合間間およびイクタルのような活動を描いています。これまでに、2~3週間のスライスでの経腸放電を記録しました。このシステムでは、てんかん様の活動は、組織ノミの海馬スライスよりも速く発達するように見える。これは、海馬への機能的入力のほとんどを保持する鼻皮質の存在に起因する可能性があります。この問題に完全に対処するために、これらのスライスが培養中に表示するてんかん信号の完全な特徴付け(ictalイベントの数と期間など)を、振幅と周波数とともに現在行われています。

このシステムは、3週間以上培養中に維持することができ、そして、例えば、神経死、ミクログリアおよびアストロサイトの活性化および炎症促進サイトカイン14の産生の増加のようなてんかんの多くの分子相関を模倣し、これらの局面の長期的な特徴付けを可能にする。また、特定の細胞経路を標的とする薬理学的介入を実施し、潜在的な治療標的をテストできる、使いやすいスクリーニングプラットフォームを表します。間違いなく、本明細書に提示されるシステムは、てんかん発生のメカニズムをさらに啓発するのに役立ちます。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、画像取得に関するすべての提案について、インスティトゥート・デ・メディシナ分子ジョアン・ロボ・アンチューンズのバイオイメージングユニットを認めたい。

このプロジェクトは、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムから、助成金契約Nº 952455、フンダサン・パラ・ア・シエンシア・テクノロジア(FCT)からプロジェクトPTDC/MEDFAR/30933/2017、ファクルダーデ・デ・メディシナ・ダ・ユニバーシダーデ・デ・リスボアから資金を受け取りました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
50 mL遠心分離管、円錐底コーニング430829
70%エタノールManuel Vieira、LDAUN1170
アンプAxon InstrumentsAxoclamp 900A
AxonInstrumentsDigidata 1440A
Anti-C3d(ヤギ)R&D SystemsAF2655:1000 の比率で希釈
Anti-CD68 (mouse)Abcamab31630-125ug:250 の比率で希釈
Anti-GFAP (mouse)Millipore SASMAB360:500
Anti-Iba1 (rabbit)Abcamab108539Dilute at a ratio 1:600
Anti-NeuN (rabbit)Werfen16712943S:500の比率で希釈
人工脳脊髄液(aCSF)自家製
B-27™サプリメント(50X)、無血清サーモフィッシャーサイエンティフィック17504-044
メスハンドル用ブレードファインサイエンスツール10011-00
ウシ血清アルブミン(BSA)NZYTechMB046025% BSAを使用して一次抗体を希釈します。10mLのPBSに0.5gのBSAを加えます。
脳/組織スライスチャンバーシステムワーナーインスツルメンツ
塩化カルシウム二水和物メルクミリポア1.02382.0500
細胞培養インサート、30 mm、親水性PTFEミリポア SASPICM03050
冷光源SCHOTTKL 300 LED
共焦点レーザー顕微鏡ツァイスLSM 710
従来のインキュベーターThermoScientific HeraeusBB15、機能ラインを37°に設定。Cおよび5%CO2
D(+)-グルコース一水和物メルクミリポア1.08342.1000
D-(+)-グルコース溶液、45% 水中シグマG8769
リン酸水素ナトリウム二水和物メルクミリポア1.06580.1000
解剖顕微鏡/拡大鏡(株
) 明治テクノ 122285Alexa Fluor 568InvitrogenA110571:200 の比率で希釈
Alexa Fluor 488 と結合したロバ抗マウス IgG (H+L)InvitrogenA21202:200 の比率で希釈
Alexa Fluor 568 と結合したロバ抗マウス IgG (H+L) を Alexa
Fluor 488Invitrogenに結合 1:200 の比率で希釈A212061:500
ロバ抗ウサギIgG(H + L)とAlexa Fluor 568InvitrogenA10042比率で希釈 1:500
デュモン #5 ファイン鉗子バイオロジー イノックスファインサイエンスツール11254-20
デュモン #5 鉗子標準 イノックスファインサイエンスツール11251-20
デュモン #7 鉗子標準デュモクセルファインサイエンスツール11271-30
デュモンメディカル #7S 鉗子ショートカーブイノックスファインサイエンスツール11273-22
ゲンタマイシンストック溶液、50 mg / mLモフィッシャーサイエンティフィック15750-037
Gey 's Balanced Salt Solution (GBSS)Biological Industries01-919-1A
Glass ElectrodesScience ProductsGB150F-10Round tips homemade
Glass Pasteur pipettes, 230 mmVWR International612-1702
Hank'S Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific24020-091
Hoechst 33342InvitrogenH1399PBS 馬血清中の 2 mg/mL のストック溶液
、熱不活化 (HS)Thermo Fisher Scientific26050-088
塩酸Merck Milipore1.09057.1000
疎水性ペンDakoS200230-2
INCU-Line IL10VWR390-0384
インターフェースチャンバーワーナーインスツルメンツBSC-HT Haasトップ
アイリススパチュラ 湾曲ファインサイエンスツール10092-12
Labculture Class II 生物学的安全キャビネットHERASafeHS 12
レンズクリーニングペーパーTIFFEN
L-グルタミン溶液200 mM (Q)サーモフィッシャーサイエンティフィック25030-024
硫酸マグネシウム七水和物メルクミリポア1.05886.0500
マイクロチューブ 0.5 mL, PPSARSTEDT72,699
マイクロチューブ 1.5 mL, PPSARSTEDT72.690.001
マイクロチューブ 2.0 mL, PPSARSTEDT72.691
マイクロマニピュレーターサッターインストゥルメントMP-285
ミロスコープ カバー メガネ、24 mm x 60 mmマリエンフェルド102242
マニキュア決まり
ニューロベースAミディアム(NBA)Thermo Fisher Scientific10888-022
Opti-MEM®I 減量血清 中サーモフィッシャーサイエンティフィック31985-047
パラホルムアルデヒド、粉末VWR ケミカルズ2,87,94,295
蠕動ポンプギルソンM312
リン酸生理食塩水緩衝液 (PBS)自家製。0.5% Tween-20 (PBS-T) を含む PBS は、免疫組織化学アッセイ中にスライスを洗浄するために使用されます。
リン酸塩標準液、水中のPO43-BDH ARISTAR452232C
ピペットセットギルソンP2、P10、P20、P100、P200、P1000
プラチナ 5ブレードジレット
塩化カリウムSigma-AldrichP5405-250g
ヨウ化プロピジウム (PI)Sigma-AldrichP4170-25MG水溶液1mg / mLで保存。
定性的濾紙、セルロース、グレード1、55 mmWhatman1001-055Medium retention 11µm
定性的濾紙、セルロース、グレード 1、90 mmWhatman1001-090中型保持 11µm
メスのハンドルファイン サイエンス ツール91003-12
スリップ チップ インスリン 注射器 針なし 1 mLSOL-M161000
塩化ナトリウムVWR ケミカルズ27800.360
リン酸二水素ナトリウム 一水和物メルク ミリポア1.06346.1000
炭酸水素メルク ミリポア1.06329.1000
水酸化ナトリウム‎メルクミリポア535C549998
装置Astro Med Inc GRASS製品グループS48刺激装置
学生ハサミストレートSharpSharpSharp 12cmファインサイエンスツール91402-12
SuperFrost Plus™接着スライドサーモフィッシャーサイエンティフィックJ1800AMNZ
TC処理滅菌 60 x 15mm 組織培養ディッシュコーニングCORN430166
TC処理滅菌 6ウェルプレートコーニングCORN3516
温度コントローラーメディカルシステムズ株式会社TC-102
ティッシュチョッパーザ・ミックル・ラボラトリー・エンジニアリング(株)MTC/2を 350 μm
トリトン X-100BDH14630
Tween-20ΣP2287
1 1 1 1 と結合したロバ抗ヤギ IgG (H+L) を を 1のサー文句ナトリウム 刺激

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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