本稿では、有機溶媒混合物中のガンマ修飾ペプチド核酸オリゴマーからのナノ構造の設計と自己集合のためのプロトコルを提供する。
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この記事について
サマリー
要約
DNAおよびRNAナノテクノロジーにおける現在の戦略は、水性または実質的に水和媒体中の様々な核酸ナノ構造の自己集合を可能にする。本稿では、一意にアドレス指定可能な一本鎖、ガンマ修飾ペプチド核酸(γPNA)タイルの自己集合を通じて、有機溶媒混合物中のナノファイバーアーキテクチャの構築を可能にする詳細なプロトコルについて説明する。各一本鎖タイル(SST)は、それぞれ6基の2つの連結モジュラードメインで構成される12ベースのγPNAオリゴマーです。各ドメインは、プログラムされた相補性を使用して隣接する鎖に存在する相互に補完的なドメインに結合し、長さミクロンに成長できるナノファイバーを形成することができます。SSTモチーフは3ヘリックスナノファイバーの形成を可能にするために9つの総オリゴマーから成っている。直径-単分散構造を形成する類似DNAナノ構造体とは対照的に、これらのγPNA系は、有機溶媒混合物中の自己集合の間に幅に沿って束ねられるナノファイバーを形成する。したがって、ここで説明する自己組立プロトコルには、従来の界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム(SDS)も含まれ、バンドル効果を低減する。
概要
DNA1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、天然の核酸を用いて作られた水性または実質的に水和した培地(DNA1、3、4、5、6、7、8、9、10、RNA
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プロトコル
1. γPNAシーケンス設計
- Winfree Labが開発した、Caltech23のDNAデザインツールボックス22を、シーケンスを設計するためのプログラミングスクリプトを含むフォルダにダウンロードします。
- そのシーケンスデザインフォルダ内で、ファイル拡張子".m"と互換性のある第4世代のプログラミング言語を開き、次のコマンドを使用して、以前にダウンロードした「DNAdesign」フォルダをパスに追加します。
>> 追加パス DNA デザイン - 続いて、次のコマンドを使用して、"PNA3nanofiber.m" という名前のスクリプトを実行します ( 補足図 1を参照)。
>> PNA3ナノファイバー - このスクリプトを実行して、"thisSeqs" と "thisScore" という変数を作成します。変数 "thisSeqs" には、デザインされたオリゴマーのシーケンスが含まれ、"thisScore" はペナルティスコアです。
- スクリプトを複数回実行して、最も小さいスコアを取得します。このような実行のサンプルを 20 個 の例を表 1に示します。
- 手動で、指定されたSST構造モチーフに対して生成されたシーケンスの各ドメインの所望のWatson....
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結果
上記のセクションで議論されたプロトコルは、複数の異なるγPNAオリゴマーを使用して、自己組み立てられたナノファイバー構造の堅牢な生成のためのDNAナノファイバーからの適応SSTモチーフの設計を記述する。このセクションでは、プロトコルの正常な再作成から得られたデータの解釈について説明します。
75%DMSOでアニールされたγPNAオリゴマーのサンプルのTIRFイメージングのためのセクション5で説明したプロトコルに従って:H2O(v/v)は、図4Aに示すように顕微鏡観察下で十分に組織化されたアーキテクチャの証拠を最も容易に提供する。75% DMF: H2O (v/v) 溶媒条件は、スパイク状または針状のナノ構造体を生じ、我々の経験では、40%1,4ダイオキシン:H2O(v/v)条件は、TIRF顕微鏡を使用して見たときに糸状ナノ構造体のまばらな装飾を示す(図4C).......
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ディスカッション
本稿では、既存の核酸ナノテクノロジープロトコルを有機溶媒混合物に適応させ、改善することに焦点を当てています。ここで説明する方法は、極性無プロティック有機溶媒の定義された実験空間内の修飾とトラブルシューティングに焦点を当てています。この分野で他の確立された核酸ナノテクノロジープロトコルが適応される可能性はまだ未踏です。これは、通常、同様の有機溶媒25、26で行われるポリマーおよびペプチド合成などの他の分野での統合を通じて潜在的な用途を改善することができる。さらに、上述のプロトコルを実践しながら観察される重要なステップに焦点を当てます。
自己組立用サンプルの調製中は、DMSO および DMF の条件に対して水の体積パーセントを 25% (v/v) に保つことが重要です。したがって、自己組立に使用される有機溶媒は、同様に無水株からであることを認識することが重要です。ナノファイバー構造は、水分含有量の増加において疎水性および凝集体である。
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開示事項
著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。
謝辞
この研究は、国立科学財団助成金1739308、NSF CAREER助成金1944130、空軍科学研究局助成金番号FA9550-18-1-0199によって部分的に支援されました。γPNA配列は、トルーコード遺伝子修復社のトゥルム・スリヴァスタヴァ博士からの寛大な贈り物でした。DNAデザインツールボックスMATLABコードに関するエリック・ウィンフリー博士とリザル・ハリアディ博士の有益な会話に感謝します。また、ジョセフ・スハン、マラ・サリバン、生物学イメージングセンターがTEMデータの収集に協力してくれたことに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| &ガンマ;PNA鎖/オリゴマー | Trucode Gene Repair Inc. | セクション 2.1 | |
| UV-Vis 分光光度計 | Agilent | Varian Cary 300 | セクション 3.1.2 |
| クォーツキュベット | Starna | 29-Q-10 | セクション 3.1.1 |
| サーマルサイクラー | Bio Rad | C1000 タッチ | セクション 4.1 |
| 0.2 mL PCR チューブ | VWR | 53509-304 | セクション 4.5 |
| 無水 DMF | VWR | EM-DX1727-6 | セクション4.6 |
| 無水 DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | セクション 4.6 |
| 無水 1,4-ジオキサン | フィッシャー サイエンティフィック | AC615121000 | セクション 4.6 |
| 10X リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | VWR | 75800-994 | セクション 3.1.1 |
| 顕微鏡スライド | VWR | 89085-399 | セクション 5.2 |
| ガラス カバー スリップ | VWR | 48382-126 | セクション5.2 |
| 酢酸アミルの2%共謀 | Sigma-Aldrich | 9817 | セクション5.2 |
| 酢酸イソアミル | VWR | 200001-180 | セクション5.2 |
| ビオチン化ウシ血清アルブミン(ビオチン-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | セクション5.3 |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | セクション5.4 |
| ストレプトアビジン | Sigma-Aldrich | 189730 | セクション 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | セクション 5.7 |
| 全反射蛍光顕微鏡 | Nikon Nikon | Ti2-E | セクション 5.8 |
| 透過型電子顕微鏡 | Joel | JEM 1011 | セクション 6.6 |
| ピンセット | デュモン | 0203-N5AC-PO | セクション 6.3 |
| 酢酸ウラニル | 電子顕微鏡科学 | 22400 | セクション6.1 |
| 、300メッシュ、銅グリッド | テッドペラ株式会社 | 1701-F | セクション6.2 |
| Formvar-一酸化ケイ素タイプA、300メッシュ、銅グリッド | テッドペラ株式会社 | 1829 | 年、セクション6.2 |
| 、DNAオリゴマー/ストランド、 | IDT、 | セクション7.1 | |
| ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、 | VWR | 97064-860 | セクション8.1 |
参考文献
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G.
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再版と許可
