有機溶媒混合物中の複雑なナノ構造へのガンマ修飾ペプチド核酸の自己集合

Summary

本稿では、有機溶媒混合物中のガンマ修飾ペプチド核酸オリゴマーからのナノ構造の設計と自己集合のためのプロトコルを提供する。

Abstract

DNAおよびRNAナノテクノロジーにおける現在の戦略は、水性または実質的に水和媒体中の様々な核酸ナノ構造の自己集合を可能にする。本稿では、一意にアドレス指定可能な一本鎖、ガンマ修飾ペプチド核酸(γPNA)タイルの自己集合を通じて、有機溶媒混合物中のナノファイバーアーキテクチャの構築を可能にする詳細なプロトコルについて説明する。各一本鎖タイル(SST)は、それぞれ6基の2つの連結モジュラードメインで構成される12ベースのγPNAオリゴマーです。各ドメインは、プログラムされた相補性を使用して隣接する鎖に存在する相互に補完的なドメインに結合し、長さミクロンに成長できるナノファイバーを形成することができます。SSTモチーフは3ヘリックスナノファイバーの形成を可能にするために9つの総オリゴマーから成っている。直径-単分散構造を形成する類似DNAナノ構造体とは対照的に、これらのγPNA系は、有機溶媒混合物中の自己集合の間に幅に沿って束ねられるナノファイバーを形成する。したがって、ここで説明する自己組立プロトコルには、従来の界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム(SDS)も含まれ、バンドル効果を低減する。

Introduction

DNA1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、天然の核酸を用いて作られた水性または実質的に水和した培地(DNA^{1、3、4、5、6、7、8、9、10、RNA 11、12)}の多数の構築に成功した。しかしながら、天然に存在する核酸は、二重らせん立体構造変化を起こしたり、有機溶媒混合物^13,14において熱安定性を低下させたりしている。

これまで、我々の研究室では、γペプチド核酸(γPNA)15と呼ばれるγ位修飾合成核酸を用いた3ヘリックスナノファイバーの構築方法を報告した(図1A)。このような合成核酸模倣PNAの開発および潜在的な用途の必要性は、フィールド^16,17の中で議論されている。我々は、DNAナノ構造体^18、19、20のために提示された一本鎖タイル(SST)戦略の適応を通じて、9つの逐次異なるγPNAオリゴマーがDMSOおよびDMFのような選択された極性陽極性有機溶媒混合物に3ヘリックスナノファイバーを形成するように設計することができることを示した。γPNAオリゴマーは、Sahuらが発表した方法に基づいて、各12基オリゴマーに沿って3つのγ位置(1、4および8のベースポジション)で(R)ジエチレングリコール(mini-PEG)の改変を伴って商業的に注文した。²¹これらのガンマ修飾は、修飾されていないPNAに対するγPNAのより高い結合親和性および熱安定性に関連するらせん前組織を引き起こす。

本稿は、γPNA系ナノ構造体¹⁵の形成に対する溶媒溶液およびDNA置換の影響を調査する報告された研究の適応である。この記事の目的は、設計の詳細な説明と、γPNAナノファイバーの自己集合化と特性化のために開発された溶媒適合法の詳細なプロトコルを提供することです。そこで、まず、合成核酸模倣PNAを用いたナノ構造設計の一般的なプラットフォームであるモジュラーSST戦略を紹介する。

PNA二重化のらせんピッチは、10.5塩基あたり1ターンを受けるDNA二重と比較して、1ターンあたり18塩基であると報告されている(図1B)。したがって、実用されたγPNA SSTのドメイン長は、3つの三角形配列ヘリス間の相互作用を可能にするために、フルターンの3分の1または120°回転を収容するために6塩基に設定された。また、これまでのSSTモチーフとは異なり、各SSTは2つのドメインしか含んでおかなければ、3らせん束を形成するために包む1次元リボン状の構造を効果的に作成します(図1C)。各12塩基γPNAオリゴマーは、1、4、8の位置でガンマ修飾され、SSTモチーフ全体にわたってミニPEG群の均一な間隔分布を確保します。さらに、モチーフ内には、単一のらせんに存在する「連続した」ストランドとらせんスパンの「クロスオーバー」ストランドの2種類のオリゴマーがあります(図1D)。また、オリゴマーP8およびP6は、蛍光Cy3(緑色星)およびビオチン(黄色の楕円形)でそれぞれ(図1D)、蛍光顕微鏡を用いた構造形成の検出を可能にする標識を有する。全体として、SSTモチーフは、3ヘリックスナノファイバーの形成を可能にするために9つの合計オリゴマーで作られており、各ドメインのプログラムされた相補性を介して、隣接するオリゴマー上の対応するドメインに対して(図1E)。

Protocol

1. γPNAシーケンス設計

1. Winfree Labが開発した、Caltech²³のDNAデザインツールボックス²²を、シーケンスを設計するためのプログラミングスクリプトを含むフォルダにダウンロードします。
2. そのシーケンスデザインフォルダ内で、ファイル拡張子".m"と互換性のある第4世代のプログラミング言語を開き、次のコマンドを使用して、以前にダウンロードした「DNAdesign」フォルダをパスに追加します。
   >> 追加パス DNA デザイン
3. 続いて、次のコマンドを使用して、"PNA3nanofiber.m" という名前のスクリプトを実行します ( 補足図 1を参照)。
   >> PNA3ナノファイバー
4. このスクリプトを実行して、"thisSeqs" と "thisScore" という変数を作成します。変数 "thisSeqs" には、デザインされたオリゴマーのシーケンスが含まれ、"thisScore" はペナルティスコアです。
5. スクリプトを複数回実行して、最も小さいスコアを取得します。このような実行のサンプルを 20 個 の例を表 1に示します。
6. 手動で、指定されたSST構造モチーフに対して生成されたシーケンスの各ドメインの所望のWatson-Crick相補性を確認する。3ヘリックスナノファイバー構造の配列仕様を 表2に示します。
7. 生成されたシーケンスについて、次の点を確認します。
   1. 4 つの連続する C および G ベースを使用しないでください。
   2. 蛍光色素とビオチン分子を用いたN末端機能化の特定の配列を手動で選択し、蛍光顕微鏡検査研究を可能にします。
   3. Sahuらによって記述されるように、一本鎖オリゴマーにおける事前に組織化されたらせん立て構造を可能にするために、少なくとも3つのミニPEGガンマ修飾をバックボーンに含 める。²¹

2. γPNAストックストランドの準備

1. 50 nmolスケール合成で指定された配列のγPNA成分ストランドを得て、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)精製を行います。
2. 脱イオン水の各ストランドを300μM濃度に再懸濁します。実験に必要になるまで、-20°C冷凍庫で、数ヶ月まで再懸濁されたストランドを保管してください。

3. γPNAオリゴマーサブセットの融解曲線研究

1. 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)やジメチルホルムアミド(DMF)またはジメチルホルマミド(DMSO)などの好ましい極性有機溶媒(DMSO)などの水バッファーでメルト曲線研究を実行することにより、相補的な2オリゴマーおよび3-オリゴマーサブセットの異なる組み合わせに対する溶融温度範囲を得る( 図2参照)。
   注: DMF の 50%以上の熱融解曲線は、実験に必要な波長での DMF の吸光度が高いため、上方基準を失い、激しい乱れを示します。これは文献²⁴の中で注目される現象である。しかしながら、これらの溶媒条件下でのストランド濃度当たり5μMの融解曲線を得ることができる。
   1. アリコート16.7 μLは、各オリゴマーの300 μMストックから1000 μLにし、最終体積を1x PBSまたは100%(v/v)DMSOまたは100%(v/v)DMFのいずれかで、オリゴマー当たり5μMの最終濃度を効果的に得ます。このオリゴマーサブセット混合物を1cmの光学路、クエヴェットに移す。
   2. プログラマブル温度ブロックを搭載した分光光度計で可変温度UV-Vis実験を行います。
   3. 冷却(アニーリング)サイクルと加熱(溶融)サイクルの両方を0.5\u20121 °C/minの速度で行う場合は、15\u201290 °Cの温度範囲で融解曲線のデータポイントを収集します。冷却前に90°Cで10分間、加熱する前に15 °Cでサンプルを保管してください。加熱曲線の第1導関数のピークから溶融温度_(Tm)を決定します。
   4. すべての溶媒ケースにおいて、2-オリゴマーサブセットの溶融温度範囲が35°C以上であることを確認します。さらに、同等の2オリゴマーサブセットに追加のストランドを含む対応する3オリゴマーサブセットが、共操作性の増加に起因する_Tm のかなりの増加を示すことを確認する。
      注:これは、複数のオリゴマーの単一のポット自己アセンブリが合理的な熱安定性を持つ所望のナノ構造に協同的に折り畳むことができることを確認します。

4. 複数の異なるγPNAオリゴマーのための自己組立プロトコル

注: γPNA ナノ構造体の自己集合型サーマル・ランプ・プロトコルを考案するには、スロー・ランプ・アニールが望ましいです。

1. オリゴマー配列が生成された場合、90〜20°Cの温度冷却で22.5時間のサンプルをアニーリングする。 典型的には、2オリゴマーおよび3-オリゴマーγPNAサブセットについて得られる溶融温度は、異なる溶媒条件に対して40\u201270°Cの範囲内にある。
2. サーマルサイクラーを次のようにプログラムする:90°Cで5分間保持し、0.1°C/minの一定速度で90°Cから70°Cまで下げ、0.1°C/3分の速度で70〜40°Cから下げ、表0.1°C/mの速度で40から20°Cに下げる (3°Cを参照)。サンプルは、特性評価の前に12\u201224時間の4°Cで保存することができます。
   注:当社のナノファイバーシステムの2および3-オリゴマーサブセットは1x PBSで形成できますが、完全なミクロンスケールのナノファイバーは1x PBSに凝集しています。したがって、溶媒条件は、形成される構造の規模と大きさ、ガンマ修飾の種類と密度に基づいて最適化する必要があります。
3. マイクロンスケールの長い3ヘリックスナノファイバーの場合、溶媒最適化研究¹⁵に基づいて75%DMSO:H2 O(v/v)、75%DMF:H2 O(v/v)、40%1,4-Dioxane:H2 O(v/v)でアニールバッチサンプルを調製する。
4. アニールバッチを次のように準備します( 表4を参照)。まず、主在庫から0.67μLを取得し、脱イオン水を使用して体積を10μlにすることで、オリゴマーごとに300μMの主在庫から20μMの濃度で10μLのサブストックを調製します。
5. アリコート1 μLは、オリゴマーごとに20μMのサブストックから200 μLのPCRチューブに加えます。これは9オリゴマーのための9 μLの総容積を占める。
6. 75%のDMSOに30μL、さらに1μLの脱イオン水で75%のDMFケースを加え、各オリゴマーを500 nMの最終濃度で40μLの最終体積にします。1,4-Dioxaneの16 μLを加え、40%のダイオキシン溶媒条件で40μLに脱イオン水で体積を作ります。
7. ステップ 4.2 で述べたプロトコルを使用して、アニール バッチをサーマル サイクラーおよびアニールにロードします。

5. 全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡イメージング

1. 空のピペットの先端箱から湿気室を準備します。箱に約5 mLの水を充填して、次のように説明するサンプル流路の乾燥を防ぎます( 図3を参照)。
2. 顕微鏡スライド、2つの両面テープストリップ、ニトロセルロースコーティングカバースリップでフローチャンバーを準備します。カバースリップをニトロセルロースでコーティングするには、アセテートとエアドライで0.1%コロディオンを含むビーカーにカバースリップを浸します。
   1. 市販の2%コロディオンから2%のコロディオンをアセテートのアミル酸イソアミル溶媒で20倍に希釈してニトロセルロース溶液を調製します。
3. ビオチン-BSAの1mgを秤量し、1x PBSの1mLに溶解させることにより、ビオチン化されたウシ血清アルブミン(ビオチン-BSA)溶液を調製する。1 x PBSバッファーに1 mg/mL ビオチン BSA の流量 15 μL を、流路を角度に置くことで行います。加湿室で室温で2〜4分間流路をインキュベートします。
4. 1mgのBSAを1mLの1x PBSに溶解して洗浄バッファーを調製します。洗浄バッファーの 15 μL を流して余分なビオチン-BSA を洗浄します。表面をパッシベーションするには、加湿室で室温で2〜4分間流路をインキュベートします。
5. ストレプトアビジンの0.5 mgとBSAの1mgを測定し、1x PBSの1 mLを使用して溶解することによって、ストレプトアビジン溶液を調製します。1 mg/mL BSAを含む1x PBSで0.5mg/mLストレプトアビジンの流れ15 μL。加湿室で室温で2〜4分間流路をインキュベートします。洗浄バッファーの流れ 15 μL は、非結合ストレプトアビジンを洗い流す。
6. 75%DMSO、75%DMFまたは40%1,4-ディオキサン条件のいずれかで、1本鎖あたり500 nM濃度で、以前にアニールされた一括のγPNAオリゴマーのフロー15 μL。加湿室で室温で2〜4分間流路をインキュベートします。
7. 10 mMトロロックスをDMSOで10mMストックのトロロックスから10倍希釈して好ましい溶媒条件で調製します(2.5mgのトロロックスを測定し、DMSOの1mLに溶解します)。ナノ構造と同じ溶媒組成を有する1mMトロロックスの15 μLで流路内の非結合ナノ構造を洗浄します。
   注: 流路のDMSO含有量が50%のDMSOは、TIRF中の溶媒条件の屈折率が異なるので、一般的にカバースリップ水TIRF角度に合わせて調整されるため、小さな信号障害を発生させます。これは、脱イオン水を使用して10 mMトロロックス10倍希釈して作られた1mMトロロックスで洗浄することによって是正することができます。この手法は、より鮮明な画像を提供しますが、フローチャネルで 2 相マイクロバブルを生成するため、形成が発生したかどうかを評価する場合にのみ役立ちます。その結果、 図4Dに示すように、ナノ構造が2相の界面で見える可能性があります。
8. 60x油浸出目的と1.5x拡大鏡を使用してTIRFイメージングを搭載した蛍光顕微鏡を使用して、フローチャネルをスライドホルダーおよび画像に転送します。Cy3 チャンネルを監視して、60 倍または 90 倍の倍率で流路をスキャンします ( 図 4を参照)。

6. 透過型電子顕微鏡(TEM)イメージング

1. 50mLの蒸留水で酢酸ウラニル0.5gを秤量し、1%酢酸酢酸水溶液を調製した。シリンジに取り付けられた0.2 μmのフィルターを使用して、1%の尿酸酢酸水溶液をフィルター処理します。
   注:または、2%の尿酢酸水溶液は、商業メーカーから購入することができます。
2. 300メッシュサイズの銅グリッドをコーティングした市販のフォームバーサポート層を購入します。
   注:フォームバー支持層は、2分を超えてDMSOのような溶媒によって溶解することができることに注意することが重要です。より長いサンプルインキュベーションのために、銅グリッド上の一酸化ケイ素で安定化された市販のフォルドバールが利用可能であり、グリッドが炭素被覆グリッドよりも親水性を持ち、 図5Cに示すように激しいサンプル条件および電子線に耐えることができます。
3. ピペット4 μLのサンプルをグリッド上に15秒フィルターペーパーを使用して、フィルターペーパーをグリッドに接触させることでサンプルを取り除きます。
4. すぐに5秒のグリッドに4μLの染色液を加えます。
5. 以前のように汚れを取り除き、フィルターペーパーを1\u20122 minのグリッドに対して保持して、グリッドが乾燥していることを確認します。サンプルは、通常、染色後 1\u20122 h 以内に画像化する必要があります。あるいは、グリッドが完全に乾燥していることを確認した場合、グリッドは、イメージングの前に最大3日間、TEMグリッドストレージボックスに保存することができます。
6. 80kVで動作する透過型電子顕微鏡を使用して、10Kから150Kまでの倍率でグリッドをTEM標本ホルダーと画像に転送します( 図5参照)。

7. 選択的DNA置換に基づくγPNA-DNAハイブリッドの異なる形態

1. 標準脱塩を用いて25nmolスケールで合成した市販オリゴヌクレオチドメーカーから、指定配列のDNAオリゴマー( 表5参照)を得る。20 μMストック濃度でRNaseフリー脱イオン水を使用してこれらのDNA配列を再中断します。
2. 連続したγPNA鎖置換にDNAを用いた場合、配列D3、D5およびD9は、鎖p3、p5およびp9を置き換えることができる。同様に、DNAとのクロスオーバーγPNA鎖置換に関しては、配列D1、D4およびD7は、鎖p1、p4およびp7を置き換えることができる。
3. 各γPNAまたはDNAオリゴマーの20μMサブストックからアリコート1μLを、ステップ2.7のように200μLのPCRチューブに加えます。30 μLの無水DMSOと1 μLのRNaseフリー脱イオン水を加え、最終体積を40 μLにします( 表6参照)。
4. ステップ 4.2 で述べたプロトコルを使用して、アニール バッチをサーマル サイクラーおよびアニールにロードします。
5. セクション5のステップに従うか、またはセクション6で言及されたTEMイメージングプロトコルを使用して、TIRFプロトコルを使用して、γPNA-DNAハイブリッドナノ構造を特徴付けます( 図6を参照)。

8. 様々な濃度のSDSにおけるγPNAナノファイバーの異なる形態

1. 20mgのSDSを測定し、100μLの脱イオン水に溶解して、20%(wt/v)SDSの主在庫を準備します。
2. 20%のSDSストックから3μLを取得し、脱イオン水を使用して体積を10μLにすることで、6%(wt/v)SDSサブストックを準備します。
3. γPNAオリゴマーを5.25mM及び17.5mMSDSの最終濃度でアニールする。各γPNAオリゴマーの20μMサブストックからアリコート1μLを、ステップ2.7のように200μLのPCRチューブに加えます。30 μLの無水DMSOと6%と20%のSDSの1 μLを加え、最終体積を40 μLにして、SDS最終濃度をそれぞれ5.25 mMと17.5 mMにします( 表7参照)。
4. ステップ4.2で述べたプロトコルを使用して、様々なSDS濃度のアニールバッチをサーマルサイクラーおよびアニールにロードします。
5. セクション5のステップに従って、またはセクション6で言及されたTEMイメージングプロトコルを使用して、SDSの存在下でγPNAナノ構造体を特徴付けます( 図7を参照)。

Results

上記のセクションで議論されたプロトコルは、複数の異なるγPNAオリゴマーを使用して、自己組み立てられたナノファイバー構造の堅牢な生成のためのDNAナノファイバーからの適応SSTモチーフの設計を記述する。このセクションでは、プロトコルの正常な再作成から得られたデータの解釈について説明します。

75%DMSOでアニールされたγPNAオリゴマーのサンプルのTIRFイメージングのためのセクション5で説明したプロトコルに従って:H2O(v/v)は、図4Aに示すように顕微鏡観察下で十分に組織化されたアーキテクチャの証拠を最も容易に提供する。75% DMF: H₂O (v/v) 溶媒条件は、スパイク状または針状のナノ構造体を生じ、我々の経験では、40%1,4ダイオキシン:H₂O(v/v)条件は、TIRF顕微鏡を使用して見たときに糸状ナノ構造体のまばらな装飾を示す(図4C)...

Discussion

本稿では、既存の核酸ナノテクノロジープロトコルを有機溶媒混合物に適応させ、改善することに焦点を当てています。ここで説明する方法は、極性無プロティック有機溶媒の定義された実験空間内の修飾とトラブルシューティングに焦点を当てています。この分野で他の確立された核酸ナノテクノロジープロトコルが適応される可能性はまだ未踏です。これは、通常、同様の有機溶媒^25、26で行われるポリマーおよびペプチド合成などの他の分野での統合を通じて潜在的な用途を改善することができる。さらに、上述のプロトコルを実践しながら観察される重要なステップに焦点を当てます。

自己組立用サンプルの調製中は、DMSO および DMF の条件に対して水の体積パーセントを 25% (v/v) に保つことが重要です。したがって、自己組立に使用される有機溶媒は、同様に無水株からであることを認識することが重要です。ナノファイバー構造は、水分含有量の増加において疎水性および凝集体である。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
&ガンマ;PNA鎖/オリゴマー	Trucode Gene Repair Inc.		セクション 2.1
UV-Vis 分光光度計	Agilent	Varian Cary 300	セクション 3.1.2
クォーツキュベット	Starna	29-Q-10	セクション 3.1.1
サーマルサイクラー	Bio Rad	C1000 タッチ	セクション 4.1
0.2 mL PCR チューブ	VWR	53509-304	セクション 4.5
無水 DMF	VWR	EM-DX1727-6	セクション4.6
無水 DMSO	VWR	EM-MX1457-6	セクション 4.6
無水 1,4-ジオキサン	フィッシャー サイエンティフィック	AC615121000	セクション 4.6
10X リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	VWR	75800-994	セクション 3.1.1
顕微鏡スライド	VWR	89085-399	セクション 5.2
ガラス カバー スリップ	VWR	48382-126	セクション5.2
酢酸アミルの2%共謀	Sigma-Aldrich	9817	セクション5.2
酢酸イソアミル	VWR	200001-180	セクション5.2
ビオチン化ウシ血清アルブミン(ビオチン-BSA)	Sigma-Aldrich	A8549	セクション5.3
ウシ血清アルブミン(BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	セクション5.4
ストレプトアビジン	Sigma-Aldrich	189730	セクション 5.5
Trolox	Sigma-Aldrich	238813	セクション 5.7
全反射蛍光顕微鏡	Nikon Nikon	Ti2-E	セクション 5.8
透過型電子顕微鏡	Joel	JEM 1011	セクション 6.6
ピンセット	デュモン	0203-N5AC-PO	セクション 6.3
酢酸ウラニル	電子顕微鏡科学	22400	セクション6.1
、300メッシュ、銅グリッド	テッドペラ株式会社	1701-F	セクション6.2
Formvar-一酸化ケイ素タイプA、300メッシュ、銅グリッド	テッドペラ株式会社	1829	年、セクション6.2
、DNAオリゴマー/ストランド、	IDT、		セクション7.1
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、	VWR	97064-860	セクション8.1