老化中の 線虫 における不溶性タンパク質凝集の定量化と、新しいデータに依存しない取得ワークフローによる

サマリー

この新しいワークフローは、線虫からSDS不溶性タンパク質(不溶性タンパク質)を効率的に抽出および分離し、定量的差動プロテオミクス分析のための最小限の出発物質で分離します。このプロトコルでは、データに依存しない包括的な取得質量分析を使用して不溶性物質を定量化し、バイオインフォマティクス分析を使用して老化メカニズムと病状に関する生物学的洞察を得ます。

要約

私たちや他の人々は、老化プロセスにより、不溶性タンパク質がプロテオーム全体に蓄積することを示しました。不溶性タンパク質をコードする遺伝子を40%以上の確率でノックダウンすると、C.エレガンスの寿命が延びることになり、これらのタンパク質の多くが老化プロセスの主要な決定要因であることが示唆されています。これらの不溶性タンパク質の単離と定量的な同定は、老化中に発生する主要な生物学的プロセスを理解するために重要です。ここでは、C.エレガンスからSDS不溶性タンパク質(不溶性タンパク質)をより効率的に抽出および単離し、新しいラベルフリーの定量的プロテオミクス分析を介して質量分析ワークフローを合理化する方法を詳しく説明した、修正および改良されたプロトコルを紹介します。この改良されたプロトコルは、タンパク質抽出の効率を大幅に向上させ、以前のプロトコル(通常は少なくとも40,000匹のワームを使用)よりも大幅に少ない出発物質(約3,000匹のワーム)を使用することを可能にする、ワーム溶解用の高効率のソニケーターを利用しています。その後、不溶性腫瘍の定量的プロテオミクス解析は、タンパク質の発見と同定のためのデータ依存性取得(DDA)と、包括的でより正確なタンパク質定量のためのデータ非依存性取得(DIA)を使用して実行されました。定量化されたタンパク質のバイオインフォマティクス解析は、C.エレガンスにおける他の分子的手法で容易に追跡できる潜在的な候補を提供します。このワークフローでは、1000種類以上のタンパク質を日常的に同定し、500種類以上のタンパク質を定量しています。この新しいプロトコールにより、C.エレガンスを用いた効率的な化合物スクリーニングが可能になります。本研究では、この改良されたプロトコルを野生型C.エレガンスN2-ブリストル株に検証し適用し、10日目のN2線虫は2日目の若い線虫よりも不溶性骨の蓄積が多いことを確認しました。

概要

タンパク質の恒常性は加齢とともに徐々に低下し、タンパク質の凝集が増加します^1,2,3。タンパク質凝集は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症など、いくつかの神経変性疾患に関連しています⁴。老化は、タンパク質凝集に関連する神経変性疾患の発症の主要な危険因子と考えられています。不溶性凝集体を形成しやすいタンパク質は、しばしば細胞毒性および組織機能障害と関連しており、他のタンパク質^の凝集をさらに加速させる可能性がある^5,6,7。あるいは、不溶性タンパク質凝集体が細胞防御機構を活性化して、タンパク質の毒性オリゴマー型をシステムから除去する可能性があります。不溶性タンパク質をコードする選択された遺伝子をノックダウンすると、加齢性疾患と正常な老化の両方において、線虫(C.エレガンス)の寿命が調節されます^5,8,9。したがって、タンパク質凝集の細胞および分子メカニズムを研究することは、老化を理解するために重要であり、最終的には神経変性疾患の治療アプローチにつながる可能性があります。

線虫C.エレガンスは、比較的短い寿命(約2週間)、培養の容易さ、遺伝子操作などのユニークな特性により、老化および加齢性疾患におけるタンパク質凝集の研究に最も広く使用されているモデル生物の1つになりました。

不溶性タンパク質を抽出して特性評価する能力は、C.エレガンスモデルにおけるタンパク質凝集に関連する加齢に伴う変化を決定する上で重要な役割を果たしてきました。正常な老化プロセスに対するタンパク質凝集の寄与を調査するために、私たち⁵と他の²は、以前に若いC.エレガンスと老化したC.エレガンスの不溶性体を抽出してタンパク質分解的に消化し、iTRAQ試薬を使用して化学的に標識し(「相対的および絶対定量のための同重体標識」)、次にMSベースの方法を使用して定量しました。同重体標識法と120 mgの湿式線虫(約40,000匹の線虫)を使用して、タンパク質不溶性樹脂の深さとカバレッジを大幅に向上させることができました⁵。定量分析により、同定された1200のタンパク質のうち203は、若い線虫の同様の不溶性画分と比較して、老化したC.エレガンスの不溶性体に有意に濃縮されていることが示されました⁵。これとは別に、David らは iTRAQ LC-MS/MS ワークフローも利用して、正常な老化によるタンパク質凝集体の変化を調べました²。約300mgの線虫から始めて、2つの生物学的複製を使用して~1000の不溶性タンパク質を同定し、約1000のタンパク質のうち~700が若い線虫と比較して年齢とともに1.5倍以上蓄積されることを決定しました²。全体として、これらの独立した結果は、広範なタンパク質の不溶性と凝集が正常な老化の本質的な部分であり、寿命と神経変性疾患の発生率の両方に影響を与える可能性があることを示しています^2,5。

不溶性腫瘍を研究することで、環境の影響が老化プロセスをどのように加速または減速させるかを決定することができました。Klangらは、C.エレガンスにおけるラベルフリープロテオミクスワークフローを確立し、長寿におけるメタロスタシスの役割を調査しました¹⁰。この研究では、少なくとも40,000匹の線虫を使用して不溶性¹⁰を抽出しました。データは、鉄、銅、カルシウム、マンガンのレベルが加齢とともに増加し、鉄を多く含む食事をワームに与えると、加齢に伴う不溶性タンパク質の蓄積が大幅に加速することを示しました¹⁰。同じワークフローを使用して、C.エレガンスの不溶性腫瘍に対するビタミンDの影響を調べたところ、若い線虫では38種類のタンパク質が定量化され(2日目)、高齢の線虫では721種類のタンパク質が定量されました(8日目)。ビタミンDの給餌により、老化した線虫の不溶性体は721から371に大幅に減少しました¹¹。さらなる調査により、ビタミンDを摂餌すると、C.elegans N2野生型線虫の加齢に伴うタンパク質不溶性が抑制され、タンパク質の恒常性が促進され、寿命が延びることが明らかになった¹¹。したがって、不溶性腫瘍を研究することは、老化および加齢性疾患の新規モジュレーターを特定するのに役立ちます。

不溶性植物の研究は、老化プロセスの理解を深める上で非常に貴重ですが、大量の出発サンプル材料を収集する必要があるため、妨げられてきました。Grohらは最近、老化に伴うC.エレガンスの固有のタンパク質凝集変化を研究するために、ラベルフリーのプロテオミクス定量ワークフローを導入しました。しかし、それには大量の出発物質(350mgのミミズ)^{が必要でした12}。本報告では、改良された新しい抽出および単離プロトコルを確立しました(図1)。線虫溶解中に高効率の超音波処理器を使用すると、抽出効率が大幅に向上し、その後、必要な出発物質の量が40,000から3,000に減少しました。この新しい不溶性骨髄単離プロトコルとラベルフリーのデータに依存しない取得(DIA)質量分析ワークフローを組み合わせることで、タンパク質の深さとカバレッジが大幅に向上しました。ここで紹介するプロトコルは、費用対効果が高く、他のモデルシステムでの不溶性ブロム分析の実行を可能にするために簡単に変更できます。

プロトコル

注:実験手順をより深く理解するために、ワークフローの概略図について 図1 を参照してください。

1. シンクロナイズドエイジングC.エレガンスの大量培養

1. プレートの準備
   1. 50 mMフルオロデオキシウリジン(FUdR)の有無にかかわらず、30 mLのNGM寒天を各90 mmプレートに注ぎ、プレートを培養フードで2日間乾燥させます。
   2. NGM寒天プレートを播種する前日に、OP50細菌株の凍結グリセロールストックの50μLアリコートを、2Lフラスコ内の1Lのオートクレーブ済みLB培地に接種します。
   3. 37°Cの振とうインキュベーターで250rpmで16時間増殖させます。
   4. 16時間後、細菌培養物を5,000 x g の速度で10分間遠心分離します。
   5. 上清を捨て、40 mLのオートクレーブ滅菌S-基礎溶液(50 mM K₃PO₄、100 mM NaClを水に含有)に細菌ペレットを完全に再懸濁して、25倍濃縮OP50 E. coli 培養物を生成します。
   6. 25倍濃縮細菌培養物2 mLを各NGM寒天プレートに分注し、細菌培養物が寒天表面全体を覆うように均一に広げます。
   7. プレートが適切に乾くまで、細菌培養フードでプレートから蓋を2〜3時間取り外します。
      注意: 15分ごとにプレートを回転させることにより、バクテリアが均等に分散するようにしてください。バクテリアはプレートの片側に集中する傾向があり、その結果、バクテリア密度の低い領域が生じるため、これは重要です。
   8. プレートが乾燥した後、蓋を閉め、プレートを室温で48時間放置して、OP50 E.coli食品源が完全に乾燥するようにします。
      注:プレートは2週間前に準備し、使用前に4°Cで保存できます。
2. C.エレガンスの同期コホートの維持と準備
   1. SDS不溶性画分の単離に必要なタンパク質ライセート(1.0〜1.5 mg)のインプットを得るには、サンプルあたり約3,000個の同期ワームを使用します。
   2. ~100 N2野生型妊娠成虫をNGM 25x OP50 E. coli播種プレートに移し、プレートが妊娠した成虫でいっぱいになるまで、寄生虫を20°Cで~72時間維持します。
   3. ~10 mLのS-基礎溶液を各プレートにピペットで移し、すべての線虫を15 mLのチューブに集めます。
      注意: このステップおよび将来のすべてのウォーム収集を含むステップでは、チップ表面への付着によるワームの損失を防ぐために、ローリテンションチップまたはパスツールピペットを使用することが重要です。
   4. サンプルを520 x g で30秒間回転させます。紡績後は上澄み液を取り除いてください。OP50 E. coliを除去するには、ペレットに10 mLのS-基礎溶液を加え、再度遠心した後、上清を除去します。この手順を繰り返します。
   5. 10 mLの次亜塩素酸ナトリウム漂白液(0.5 M KOHと0.48%次亜塩素酸ナトリウムを水に含有)を15 mLのコニカルチューブ内のワームペレットに加え、室温で2分間激しく渦巻かせます。
   6. 520 x g で室温で30秒間遠心分離し、不完全に溶解した虫体と卵をスピンダウンします。次に、上清を取り除きます。
   7. 手順1.2.5と1.2.6を繰り返して、すべてのワーム体を完全に除去し、卵を放出することを確認します(顕微鏡下でチューブを見て確認します)。
   8. 卵ペレットを10mLのS-基礎溶液で少なくとも4回洗浄して、漂白剤溶液が完全に除去されるようにします。
      注:漂白剤が残っていると卵の孵化が妨げられる可能性があるため、漂白剤を完全に除去することが重要です。
   9. 卵を15 mLチューブ内の5 mLのS-基礎培地に再懸濁し、ローターに20°Cで24時間置いて卵を孵化させます。
   10. 24時間後、10μLのS-basal幼虫溶液を摂取して、その中の線虫の数を数えます。線虫数の複製には、10 μL の S 基底幼虫溶液の少なくとも 3 つの別々のアリコートを使用します。3つの幼虫の濃度の平均を計算します。平均濃度に基づいて、線虫溶液を希釈して、溶液 200 μL あたり ~3,000 匹の幼虫を得ます。
       注:邪魔されないままにしておくと幼虫が落ち着く傾向があり、幼虫の数に影響を与える可能性があるため、チューブを反転させて静かに振ってください。
   11. よく混ぜ合わせ、200 μLのS-basal Larvae Solutionを90 mm NGMバクテリア播種プレートのそれぞれに加えます。
       注:特定のスポットからの細菌の枯渇を避けるために、幼虫を均等に分布させるために、プレート全体にS-basal幼虫溶液を滴下します。
   12. S-基礎溶液を乾燥させ、プレートを逆さにして20°Cのインキュベーターに48時間置きます。
   13. 48時間後、プレートから線虫をS-基礎溶液に集め、50 mM FUDRを含む新鮮なNGM播種プレートに移し、プレートを20°Cでインキュベートします。
       注:FUDRの効率を確保するために、L4ステージの早い段階でワームを転送することが重要です。
   14. 48時間後に10 mLのS-基礎溶液をプレートに加え、溶液を15 mLチューブに移すことにより、2日目の若年成人サンプルを採取します。ワームが重力によって沈降するのを待ち、S-基礎溶液が透明になったら取り除きます。
   15. ワームペレットを5mLのS-基礎溶液で2〜3回洗浄し、付着した細菌を取り除きます。できるだけ多くのS-基礎溶液を取り除き、ワームペレット(15 mLチューブ内)をドライアイス/エタノール浴で凍結します。.凍結したサンプルは-80°Cで保存します。
   16. サンプルワームを、10日目まで隔日でFUDRを含む新しいNGM OP50 E. coli プレートに移します。手順 1.2.14 と 1.2.15 の説明に従って、ワームを収集して凍結します。
       注:10日目のサンプルでは、移動と穴あけによるワーム数の損失を考慮して、より多くのワームから始めます。

2. 線虫からのSDS不溶性画分の抽出

1. 20 mM Tris base、pH 7.4、100 mM NaCl、1 mM MgCl₂ 、およびEDTAフリープロテアーゼ阻害剤を含む900 μLの氷冷ワーム溶解バッファーカクテルの存在下で、凍結したワームペレットを氷上で解凍します。サンプルを短時間ボルテックスして、溶解バッファー中のワームペレットの完全な再懸濁を確保します。
2. 15mLチューブを超音波処理槽に入れ、高強度で10回の超音波処理サイクル(各サイクルで30秒オンと30秒オフ)に設定します。最大5サイクル繰り返します(ワームが完全に溶解していることを確認してください)。
3. ライセートを3,000 x g で4分間冷蔵室で遠心します。遠心分離後、ワームの破片を含むペレットを廃棄し、上清を氷上の新しい予冷済み1.5 mL遠心分離チューブに慎重に移します。
4. BCAアッセイを使用してタンパク質濃度を定量します。通常、約1 mgのタンパク質を含むライセートアリコートを、事前に冷却した新鮮な1.5 mL遠心チューブに移します。
5. タンパク質溶解物を20,000 x g で15分間、冷蔵室で遠心分離します。
6. ペレットを乱さずに、上清を新鮮な1.5 mL遠心チューブに移し、水溶性タンパク質画分として保存します。
7. 前のステップのペレットを、1% SDSを含む500 μLの線虫溶解バッファーで室温で洗浄し、20,000 x g で室温で15分間遠心分離します。上清を取り除き、SDS可溶性画分として保存します。この洗浄ステップを2回繰り返して、SDS可溶性画分をすべて除去します。3回目の洗浄後の残りのペレットは、1%SDS不溶性タンパク質画分として定義されます。
8. SDS不溶性タンパク質ペレットを60μLの70%ギ酸に再懸濁し、激しくボルテックスしてタンパク質を溶解します。ペレットを溶解するために必要な回数だけ激しいボルテックスを繰り返します。
9. ペレットを室温の超音波装置水浴中で30分間超音波処理します。
   注:SDS不溶性ペレットは、通常、バッファーに溶解しにくいです。ただし、最終的には、このステップでペレット全体を溶解する必要があります。
10. サンプルを真空濃縮器で1時間乾燥させ、ギ酸溶液を完全に除去します。
11. 乾燥ペレットに1x LDSサンプルゲルバッファー40 μLを加え、サンプルを95°Cで10分間加熱します。サンプルを短時間ボルテックスしてスピンダウンします。13 μLを4-12% NUPAGE Bis-Trisゲルにロードし、ゲルを泳動します。イメージングのために、ゲルを蛍光タンパク質染色剤で染色します。残りのサンプルは、質量分析(MS)分析用に保存します。
12. 残りのサンプルを4-12% Bis-Trisゲルにロードし、約20分間泳いでMSインゲル化します。

3. トリプシンプロテアーゼによるインゲル化によるMS分析用タンパク質の単離

1. 次の溶液(新鮮)を調製します:25 mM NH₄HCO₃ (pH 7–8)、25 mM NH₄HCO₃ 50%アセトニトリル(ACN、pH 7–8)、および50% ACN 5%ギ酸溶液。
2. 各ゲルスライスを細かく切って(通常は<1 mm²)、0.65 mLのシリコン処理チューブに入れます。
3. 25 mM NH₄HCO₃/50% ACN溶液を約100 μL(または覆う程度)加え、室温で10分間ボルテックスします。上清を抽出し、別のチューブに移します(廃棄します)。この手順をさらに 2 回繰り返します。
4. ゲル片を真空濃縮器で完全に乾燥させます(~20分)。
5. 新鮮な溶液を調製し、25 mM NH₄HCO₃ 中の 10 mM DTT を ~100 μL (または覆うほど) を乾燥ゲル片に加えます (新たに調製した NH₄HCO₃ を使用してください)。渦を巻き、一瞬回転します。ミキサーで1400rpmで振とうしながら、56°Cで1時間反応を進めます。
6. 上清を取り除き、25 mM NH₄HCO₃ 中の55 mMヨードアセトアミド(IAA)100 μLをゲル片に加えます。渦を巻き、一瞬回転します。RTで45分間、暗闇の中で反応が進行するのを待ちます。
7. 上清を取り除き、捨てます。~100 μL の 25 mM NH₄HCO₃ を加え、10 分間ボルテックスしてゲル片を洗浄します。上清を少し回転させて取り除き、上清を捨てます。
8. ~100 μL (または覆う程度の) 25 mM NH₄HCO₃ in 50% ACN をゲルピースに添加し、10 分間ボルテックスしてゲルピースを脱水します。次に、短時間回転させて上清を取り除き、廃棄します。この手順を2回または3回繰り返します。ゲル片のサイズが小さく、白い色が濁っているように、ゲル片が完全に乾燥していない場合は、ゲル片が乾燥していない場合。
9. ゲル片を真空濃縮器で完全に乾燥させます(~20分)。
10. 最初に各サンプルに15 μLのトリプシン溶液(250 ngトリプシン)を添加し、次にゲル片を覆うのに十分な25 mM NH₄HCO₃ (~100 μL)を加えます。10分間渦巻きます。その後、短時間遠心し、混合せずに4°Cの低温室で30分間インキュベートします。
11. 必要に応じて25 mM NH₄HCO₃ を添加し、ゲル片を完全に覆います。ミキサーで37°Cで一晩16〜20時間、1400rpmで遠心およびインキュベートします。
12. 翌日、短時間ボルテックスし、消化を回転させます。約100μLのHPLCグレードの水を加え、チューブを回転させ、パラフィルム化し、10分間連続的に超音波処理します。超音波処理後、短時間回転させる。
13. 水抽出物を表す分解溶液を、きれいな0.65 mLシリコン処理チューブに移します。
14. ~100 μL の 50% ACN/5% ギ酸をゲル片 (ゲルを覆うのに十分な量) に加え、室温で 10 分間ボルテックスし、短時間遠心して溶液を回収し、1 回繰り返します。このステップと前のステップ3.13で抽出したペプチドを含むすべての溶液を1本のチューブにプールします。
15. 抽出された消化物を渦巻きにします。ペプチドを真空濃縮器(~2時間)で完全に乾燥させます。
16. 0.2%ギ酸30μLを加えて、ペプチドをミキサーで10分間再懸濁します。
17. サンプルを1850 x g で室温で5分間遠心します。ペプチド溶液を吸引し、新しいクリーンな0.65 mLシリコン処理チューブに移します。次に、C18脱塩チップを使用してペプチド溶液を脱塩します(下記参照)。

4. C18脱塩チップによる消化ペプチドの脱塩

1. ピペットを10μLにセットし、C18脱塩チップを取り付けます。100% ACNを10 μLピペッティングして脱塩チップを濡らし、廃棄します。この手順を2回繰り返します。
2. C18脱塩チップは、50% ACN、49.8% 水、0.2% FA を 10 μL ピペッティングで増やし、廃棄して洗浄します。この手順を2回繰り返します。
3. C18脱塩チップを平衡化するには、0.2% FAを10 μLの水にピペッティングしてから廃棄します。この手順を2回繰り返します。
4. ピペットを10 μLに設定し、消化されたペプチドをレジンを通してピペッティングして、溶液からレジンにペプチドをロードします。
   注:繰り返しの作用により、すべてのペプチドが脱塩チップの樹脂に確実に結合します。
5. レジンに結合した消化ペプチドを、0.2% FA10 μLを水にピペッティングして脱塩し、廃棄します。この手順を4回繰り返して、脱塩手順を完了します。
6. 新しいチューブで、10 μL の 50% ACN、49.8% 水、0.2% FA でペプチドを溶出します。これは、ピペッティングで 10x を上下させます。このステップを1回繰り返して、同じチューブ内でタンパク質消化物を2回目に溶出します。
7. 脱塩したペプチドを真空濃縮器で完全に乾燥させます(~20分)。
8. 15 μL の 0.2% FA + 1 μL iRT (Indexed Retention Time) ペプチドに再懸濁します。Voxtexを10分間、12,000 x g で2分間遠心分離した後、MS分析のためにオートサンプラーバイアルに移します(下記参照)。

5. DDAおよびDIAを用いた消化ペプチドの質量分析

注:サンプルは、DDAまたはDIA LC-MS/MS法のいずれかを使用して分析できます。この研究では、高分解能質量分析計と組み合わせたnano-LC 2D HPLCシステムを使用してサンプルを分析しました。

1. 四重極飛行時間型質量分析計に直接接続されたチップベースのHPLCシステムと組み合わせて、HPLCシステムを使用します(他のLC-MS構成およびシステムも使用できます)。
2. 逆相HPLC-ESI-MS/MSを使用してサンプルを分析します。
   1. ペプチドサンプルを C18 プレカラムチップにロードするクロマトグラフィープロトコールを構築します。ロードしたペプチドをローディング溶媒(0.1%ギ酸)で2 μL/minの流速で10分間洗浄し、脱塩します。
   2. ペプチドを分析カラム C18 チップに移し、移動相 A(2% アセトニトリル、0.1% ギ酸)および B(98% アセトニトリル、0.1% ギ酸)を使用して 300 nL/min の流速で溶出します。最初の溶出ステップは、5% B から 35% B までの 80 分間の線形グラジエントで構成されます。
   3. 移動相Bを80%まで5分間上昇させた後、移動相Bを80%で8分間維持した後、5%Bに変更してカラムを25分間再平衡化します。
3. DDAのMS装置メソッドを設定し、装置パラメータを次のように定義します。
   1. 実験 1:m/z 400–1500 からの MS1 プリカーサーイオンスキャン(蓄積時間 250 ms)には、以下のパラメータを使用します。強度閾値を設定して、電荷状態が 2 〜 5 〜 200 カウントのイオンの MS/MS スキャンをトリガーします。プリカーサーイオンの動的排除を60秒に設定します。
   2. 実験 2 では、次のパラメーターを使用します: m/z 100 から 1500 の MS2 スキャン範囲での MS/MS プロダクトイオンスキャン (1サイクルあたり 30 回のプロダクトイオンスキャンごとに 100 ms の蓄積時間)。コリジョンエネルギースプレッドをCES=5に設定し、「High Sensitivity Product Ion Scan Mode」にチェックマークを付けます。
      注:DDA取得法は、ステップ6.3(下記参照)で説明したように、スペクトルライブラリの構築に使用されます。ここでは、サイクルごとに各MS1スキャン後に、最も存在量の多い30のプリカーサーイオンのMS/MSスペクトルを取得します。合計サイクルタイムは約3.3秒です。
4. DIAのMS装置メソッドを設定し、装置パラメータを次のように定義します。
   1. 実験 1 には、m/z 400-1250 からの MS1 プリカーサーイオンスキャン(蓄積時間 250 ms)を使用します。
   2. 実験 2 では、次のパラメーターを使用します: m/z 100-1500 の MS2 スキャン範囲で 64 の可変 SWATH セグメントの MS/MS プロダクトイオンスキャン (1 サイクルあたり 64 のプロダクトイオンスキャンのそれぞれあたり 45 ミリ秒の蓄積時間)。コリジョンエネルギースプレッドをCES=10に設定し、「High Sensitivity Product Ion Scan Mode」にチェックマークを付けます。
      注:Schilling et ^al.13 で説明されている64変数ウィンドウDIA/SWATH取得法を使用して、合計サイクルタイムが約3.2秒のラベルフリー定量を実行します。DDA取得では、Q1四重極を使用して狭い質量範囲のプリカーサーイオンをコリジョンセルに伝送する代わりに、可変ウィンドウ幅の範囲(m/z 5〜90など)を使用して、64個のSWATHセグメント、各セグメントの蓄積時間でm/z全範囲(m/z 400〜1250)を段階的にステップオーバーします。 その結果、サイクルタイムは3.2秒で、これには250ミリ秒の蓄積時間を持つ1回のMS1スキャンが含まれます。可変ウィンドウ幅は、SCIEX「可変ウィンドウ計算機」アルゴリズム¹³ を使用して、特定のm/z範囲内で観察される典型的なMS1イオン電流の複雑さに応じて調整されます(狭いウィンドウは「ビジーな」m/z範囲に適用され、広いウィンドウは溶出するプリカーサーイオンが少ないm/z範囲に適用されます)。他のMSプラットフォームでは、別のDIAウィンドウ選択戦略も実装できます。

6. データ分析

注:特定のデータ解析設定は、特定の実験条件に合わせて調整する必要があります。例えば、選択されるタンパク質データベース(fastaファイル)は、サンプルが調製された種によって異なります(このプロトコルでは、C.エレガンスを使用しました)。

1. MSデータベース検索エンジンを使用して、DDA取得を分析し、タンパク質を同定します。darabase検索エンジンメソッドを次のように生成します。
   1. [Sample Description Parameters] で [Identification] を選択します。[サンプルタイプ]で、[ヨード酢酸]を選択します。[システインアルキル化]で、[トリプシン]を選択します。Digestion(リジンとアルギニンでのC末端切断を想定)で、Instrument(機器)で質量分析計の名前を選択します。をクリックし、[種] で [Caenorhabditis elegans] を選択します。
   2. 特定の処理パラメータについては、生物学的修飾をオンにします。[ID Focus]で[SwissProt]を選択します。[データベース] で [Thorough ID] をオンにします。[Search Effort] で、[Detected Protein Threshold] で 0.05 (10%) を選択します。をクリックし、[結果の品質] で [偽検出率分析の実行] をオンにします。検索エンジンの方法を保存し、生成されたメソッドを使用して、MS の生ファイルをデータベース検索エンジンに送信して処理します。
      注:反復的なプロセスでは、すべてのMSおよびMS/MSスキャンは、最初の注釈と結果に基づいて検索エンジンによって自動的に再キャリブレーションされました。
2. 検索が完了したら、 Export Peptide Summary をクリックし、Excelですべてのペプチド同定結果を信頼閾値99でフィルタリングします(偽発見率(FDR)= 1%)。
3. MS/MSスペクトルライブラリを構築して、DIA生データファイルをさらに処理し、さらに相対的なデータ定量化を行います。
   1. DIA定量分析ソフトウェアを開きます。「ライブラリ」タブを選択し、(ページ下部の)「データベース検索エンジン」から「スペクトルライブラリを生成」をクリックして、DDA生データファイルデータベース検索プロセスの一部として自動的に生成された「データベース検索エンジン」FDRレポート(*FDR.xlsxスプレッドシートファイル)を開きます。
   2. 「次へ」をクリックし、「ライブラリ設定スキーマ」を選択して「次へ」をクリックします。データベースとしてUniprot_Caenorhabditis elegans _proteomeを選択し、[Finish]をクリックすると、スペクトルライブラリが生成されます。
4. DIA定量解析ソフトウェアを使用して、DIA取得物を解析し、包括的な相対タンパク質定量を実現します。DIAデータ解析パイプラインについて、以下に説明します。
   1. ペプチドを分析および定量するには、 DIA 定量分析ソフトウェア を開き、テンプレートスキーマを使用して分析スキーマを設定します。テンプレートスキーマは、ソフトウェアで[ 設定]、[ DIA Analysis]、[ BGS Factory Settings]の順にクリックすると使用できます。
   2. テンプレートスキーマのパラメーターを次のように設定します。
      1) 識別 の下で 、PTMローカリゼーション を選択します(確率カットオフ= 0.75)。
      2) 定量で、Sum peptide Quantity として Major Group Quantity を選択し、Major Group N を Max 7 と Min 1 に、Sum precursor Quantity に Minor Group Quantity を、Minor Group N を最大 10 と Min 1 に設定、Data Filtering を Qvalue スパースとして選択し、Cross Run Normalization は選択しません。
5. 相対定量分析を実行します。
   1. 「パイプライン」タブを選択し、「ファイルからの DIA 分析の設定」をクリックし、対象の MS DIA raw ファイル(例:サンプルとコントロール)を開き、「スペクトルライブラリの割り当て」をクリックし、6.3 で生成されたライブラリを選択して「ロード」をクリックし、最後に「次へ」をクリックします。
   2. 6.5.1 で設定した分析スキーマを選択し、[ 次へ] をクリックします。適切なデータベース fasta ファイル (このプロトコルでは Uniprot_Caenorhabditis elegans_proteome) を選択し、[ 次へ] をクリックします。条件設定を定義し、サンプルに応じて異なる条件を割り当てて、「 次へ」をクリックします。
   3. 解析の概要(実験設定の概要)を確認し、 出力ディレクトリ を参照して 「終了」をクリックします。最後に 、「パイプラインを実行」 をクリックして、ラベルフリーの定量分析を実行します。
      注:「DIA定量分析ソフトウェア」の統計モジュールは、FDR分析を自動的に実行し、異なる条件を比較するヒートマップと火山プロットを生成し、同定および定量化されたペプチドとタンパク質のリストを生成し、異なる条件を比較する相対的な倍率変化とともにQ値を提供します。ここでは、サンプル条件の設定には、2 つの生物学的複製を持つ 10 日目の老化線虫と、コントロールとして 2 つの生物学的複製を持つ 2 日目の若い線虫が含まれていました。

結果

従来のワーム溶解方法には、さまざまな欠点があります。例えば、プローブベースの超音波処理およびビーズビーター法は、金属チップまたはビーズがサンプルと直接接触することを可能にすることによって過度の熱を発生し、その結果、タンパク質の回収率およびタンパク質の変性が変動する。液体窒素粉砕とそれに続く溶解緩衝液での超音波処理は、時間がかかり、多数のワームを必要とすることがあります。従来の線虫溶解法には限界があるため、標識法 iTRAQ や、不溶性体に関する定量的情報を得るために C. elegans モデルシステムで歴史的に使用されてきたラベルフリー法などの以前の MS ワークフローでは、出発物質を大量に入力する必要があります (少なくとも 40,000 線虫)。この数のワームを得るためには、手間のかかるワーム培養作業が必要です。さらに、ラベリング方法には高価な同重体化学ラベルが必要です。ラベルフリー定量法は費用対効果が高く、サンプル調製と標識法がより簡単で簡単ですが、十分な MS 分析範囲を達成するためには、非常に多くのワームが必要です。

我々が使用したソニケーターは、クロスコンタミネーション¹⁴なしで温度制御されたウォーターバスソニケーターで複数のワームサンプルを同時に溶解することにより、ワーム溶解の効率と再現性を大幅に向上させ、必要な開始ワーム材料の量を大幅に削減します。高効率の超音波処理法と定量的なDIAラベルフリーMSアプローチを組み合わせることで、~3,000匹の線虫を使用して、老化した線虫と若い線虫の不溶性を頑健に定量することができました。ここでは、プロトコルの効率をテストおよび検証し、野生型線虫株であるN2-Bristol C. elegansの老齢線虫と若齢線虫の不溶性を比較しました。このプロトコルを適用して、~3,000 匹の老齢および若齢の N2 C. elegans (各条件に対して 2 回の生物学的複製) から不溶性腫を抽出して単離し、続いて四重極飛行時間型質量分析計またはその他の MS システムを使用して、タンパク質の同定と定量のためのデータ依存型取得 (DDA) とデータ非依存型取得 (DIA/SWATH) の組み合わせを使用した MS 分析を行いました。不溶性タンパク質を最初にBis-Tris 4-12%グラジエントゲルで分析し、各不溶性サンプル中のタンパク質の量を決定しました。 図2に示すように、N2の老化した線虫(レーン2および3、生物学的複製実験)から採取した不溶性サンプルは、N2の幼虫から採取したサンプル(レーン1および4、生物学的複製実験)よりも有意に多くのタンパク質を含んでいます。

ゲル内消化後、不溶性体のタンパク質プロファイルをHPLC-MSで分析しました。このワークフローを使用すると、SDS不溶性画分から一般に1000〜1,500個のタンパク質を同定し、500〜1,000個のタンパク質を高い再現性で定量できます(未発表データ)。ここでは、DIAデータを分析し、冗長性を取り除くことにより、N2-Bristol C. elegans の不溶性体から989のタンパク質を定量することができました:768のタンパク質が有意に濃縮され、27のタンパク質が若齢(2日目)と比較して、老化したN2線虫(10日目)の不溶性体で有意に減少しました。少なくとも1.5の倍率変化と0.01未満のQ値(図3A)。ヒストグラムプロット(図3B)に見られるように、大幅に変化したタンパク質の倍率変化は正規分布を示しています。老化した線虫は、不溶性虫に対して有意に濃縮されていることが実証されました:観察された最大の変化は、不溶性体内の相対的なタンパク質量が、古い線虫と若い線虫で592倍高いことを示しました。また、32種類のタンパク質について、不溶性体内の相対的なタンパク質量は、老齢の線虫と若い線虫で>250倍高く、年齢とともに不溶性体が劇的に変化することを示しています。

老化した線虫で有意に増加し、ワームベース(WS271)によって同定された不溶性タンパク質のリストを抽出した後、KEGG経路とGene Ontology(GO)分析を実施して、老化した不溶性体に富む経路を決定し、これらが老化にどのように関連しているかについての生物学的洞察を得ました。この研究で同定されたタンパク質のKEGG経路解析では、リボソーム、ミトコンドリア、プロテアソーム、スプライソソームが関与するいくつかの経路が濃縮されていることが示されています(図4A)。遺伝子オントロジー解析により、老化した線虫に由来する不溶性体は、ミトコンドリア、発生、成体寿命の決定要因、リボソームタンパク質など、特定のカテゴリーの多くのタンパク質を含むことが示されています(図4Bおよび補足表1A)。次に、この研究で同定されたタンパク質のリストを、ベン図で示されているように、以前に発表されたDavidら²およびMarkら¹¹の研究と比較しました(図5、A、5B)。この比較では、同定されたタンパク質394/721および444/721が、それぞれDavidら(図5A)およびMarkら(図5B)の研究と有意に重複していることが示されました。この研究からKEGGによる不溶性腫の解析によって明らかになった生物学的経路も過去に特定されており、私たちの方法論が検証されています(補足表1B)。これらの経路とタンパク質の同定は、老化の文脈におけるそれらの機能に関して、さらなる生物学的研究の候補として役立つ可能性があることを示唆しています。

要約すると、効率的な超音波処理法の使用により、温度が十分に制御され、クロスコンタミネーションが低減された環境で複数のワームサンプルを同時に溶解し、開始ワーム材料を大幅に減らして高いタンパク質被覆を達成することができます。効率的な超音波処理法とDIAラベルフリータンパク質定量ワークフローを組み合わせることで、不溶性ワームタンパク質の定量に信頼性と再現性のある結果が得られました。

図 1.プロトコルの実験的なワークフロー。C.エレガンスは、異なる日に培養され、収集されました。超音波装置による線虫溶解後、1%SDS不溶性タンパク質画分(不溶性)を抽出し、ライセートから単離した。次に、不溶性体をゲル内トリプシン消化で消化し、DIA質量分析で定量した後、バイオインフォマティクス分析を行いました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.不溶性腫瘍のSDS-PAGEゲルは、N2-ブリストル株の若い線虫と古い線虫を分離しました。 N2-ブリストル株の若い線虫と老齢線虫の不溶性体をSDS-PAGEで分析し、存在するタンパク質の量を決定しました。SDS-PAGEゲルを蛍光タンパク質染色液で染色し、タンパク質バンドを可視化しました。レーン1および4:若いN2線虫の2つの生物学的複製実験からの不溶性体(2日目)。レーン2および3:老化したN2線虫の2つの生物学的複製実験からの不溶性(10日目)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.タンパク質候補は、老化した不溶性体と若い不溶性体、およびそれらの褶曲変化分布に有意な変化を示すと特定されました。 (A)老化したN2-ブリストル線虫と若いN2-ブリストル線虫の不溶性体を定量化するための火山プロット。絶対フォールド変化 >=1.5 で Q 値 <0.01 の候補は、赤い点で表示されます。(B)老化した線虫と若い線虫のサンプルにおける有意に濃縮されたSDS不溶性タンパク質の倍率変化分布のヒストグラムプロット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 4. KEGG経路およびGene Ontology(GO)解析。 (A)上部に有意な経路が示されているp 値に従って配置されたday-10不溶性腫のKEGG経路分析。(B)遺伝子オントロジー解析では、老化した線虫の不溶性は、ミトコンドリア、発生、成体寿命の決定要因、リボソームタンパク質など、特定のカテゴリーの多くのタンパク質に富んでいることが示されています。散布図ビューは、GO 用語を "セマンティック空間" で視覚化し、より類似した用語が互いに近接して配置されます。バブルの色はSTRING分析で得られたp値を反映し、そのサイズはUniProt-GOAデータベースでのGO項の一般性を反映しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 5. Insolublome タンパク質の重複は、この研究を (A) David et ^al.2 および (B) Mark et ^al.11 研究と比較した insolublome 10 日目で特定されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表1(図4および図5に関連)。 (A)STRINGデータベースによる遺伝子オントロジー(生物学的プロセス)の解析 (B)この研究で同定されたタンパク質とKEGG経路の詳細なリストと、発表された研究との重複を示すカラーコード。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコールでは、C.エレガンスから不溶性タンパク質を抽出するための改良されたサンプル調製方法を報告します。従来の線虫溶解法(プローブ超音波処理やビーズビーター技術など)を効率的な超音波処理器に置き換えることにより、不溶性タンパク質抽出の収率が向上し、ラベルフリーMS分析に必要な線虫の数が40,000匹から3,000匹に減少しました。DDAデータからのタンパク質同定にはデータベース検索エンジンを使用し、DIA Quantitative Analysis Softwareと対応するDDAデータベース検索結果を使用してC.エレガンススペクトルライブラリを構築しました(データベース検索エンジンによって生成されたFDRファイルレポートのインポート)。老化した線虫および若いC.エレガンス不溶性データの相対定量は、「DIA定量分析ソフトウェア」を使用して実行され、新しいDIAデータセットと生成されたスペクトルライブラリを処理しました。

このプロトコルでは、いくつかの手順が重要です。C.エレガンスの寿命が短いため、哺乳類細胞などの他の真核生物と比較して、老化を研究するのに理想的なシステムですが、老化関連の現象を研究する際には、線虫の均質な集団を分離することが重要です。このプロトコルでは、同期老化ワームを取得するためにFUDRが使用されました。L4ステージの早い段階で線虫をFUDRを含むNGM播種プレートに移し、その有効性を確保することが重要です。効率的な超音波処理器を使用した線虫溶解中は、サンプルの過熱を防ぐために、水浴温度を4°Cに設定し、超音波処理を30秒オンと30秒オフに設定する必要があります。10サイクル(10分)の超音波処理の最初のラウンドの後、すべての線虫が効率的に溶解されたことを確認するために顕微鏡で確認することが重要です。そうでない場合は、より多くの超音波処理サイクルが必要です。ゲル内分解のプロセスでは、各ゲルスライスを適切なサイズ(<1 mm²)の断片にさいの目に切らなければなりませんが、小さすぎるとサンプル調製プロセスで失われる可能性があり、大きすぎると分解が不十分になる可能性があります。

出発物質の必要性がはるかに少ないため、不溶性ボローム分析用のサンプルを取得するための線虫培養に関連する面倒な作業が大幅に削減されます。ただし、1% SDS 不溶性タンパク質画分の抽出と単離には複数の洗浄ステップが必要であり、サンプルの損失を回避し、再現性のある結果を確保するためには、サンプルの取り扱いを慎重に行う必要があります。MS 分析用に生成された材料の量は、その後の DDA および DIA 分析のための ~3 回の注入には十分ですが、将来の実験のために保存することはできません。さらに、その潜在的に交絡効果¹⁵にもかかわらず、老化プロセス中に線虫を滅菌するために、可能な限り低い濃度のFUdRを使用しました。将来の研究では、無菌変異体を使用するか、手動で線虫を移植して収集することにより、FUdRの使用を回避する可能性があります。

ワーム溶解に高効率のソニケーターを使用すると、不溶性体を効率的に抽出することができ、良好なタンパク質カバレッジと費用対効果の高いラベルフリーDIA MS分析が可能になり、大幅に減少した寄生虫を使用して不溶性体を定量化できます。これにより、作業負荷が大幅に軽減され、実験ごとにより多くの条件のスクリーニングが可能になります。さらに、ラベルフリーのMS DIAワークフローは費用対効果が高く、iTRAQ、TMT、SILACなどの標識法と同等のレベルでタンパク質の深さとカバレッジを提供します。C.エレガンスモデルは、老化研究のための高速スクリーニングシステムです。このワークフローは簡単に変更でき、この生物や他の生物の老化および加齢性疾患の研究に適用することができます。例えば、進行中の研究では、このワークフローを適用して、Aβ、タウ、および異なる薬物介入の有無にかかわらず、さまざまなアルツハイマー病(AD)C.エレガンスモデルにおける不溶性腫瘍およびプロテオスタシスのタンパク質プロファイルを調査しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
使用した菌株
Esherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (Bristol)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
緩衝液NGM
(線虫増殖培地)			レシピ:3 g / L NaCl、23 g / L寒天;2.5 g / Lペプトン;1 mM CaCl2、5 mg / Lコレステロール、1 mM MgSO4、25 mM KH2PO4
S-基礎溶液			レシピ: 5.85 g/L NaCl、1g/L K2HPO4、6 g/L KH2PO4、H2O to 1 L
次亜塩素酸ナトリウム漂白剤溶液			レシピ: 0.5 mL 5 N NaOH を 1 ml 次亜塩素酸ナトリウム (5%) と混合し、H20 で 5 mL にします。
Material/ Equipment
Agar	Difco Granulated Agar, BD Biosciences	90000-782
Bioruptor Plus sonication device	Diagenode, USA	B01020001
Cholesterol	Sigma	c8503
2'-deoxy-5-fluorouridine	VWR	TCD2235
Glycerol	ミリポアシグマ	356350-1000ML
のLBのスープ、ミラー	のミリポアシグマ	60801-450
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS?	シグマ	L4509-250G
塩化ナトリウム	グマ	59888
M880超音波浴、117 V、5.5ガロン	VWRを保持し、米国	89375-458
マグネシウム	シグマ	M506
マグネシウム	グマ	208337
NGM寒天プレート	VWR使い捨てペトリ皿	25384-342
NuPAGE LDS サンプルバッファー (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007
NuPAGE protein gels, 4-12%	Invitrogen	NP 0335BOX
Protease inhibiotor, cocktail (PIC)	Roche	11836170001
Pierce BCA Assay	Thermo Fisher Scientific	23225
次亜塩素酸ナトリウム 5%	VWR	JT9416-1
SYPRO ルビータンパク質ゲル染色	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S12000
MS Section
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	36XL66
Agilent Zorbax 300Extend C18 column	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	770995-902
アンモニウム重炭酸塩	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	9830 (1 kg)
ジチオスレイトール (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9779-5G
Eppendorf Thermomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	T1317-1EA
ギ酸	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507-500ML
Indexed retention time (iRT) 標準化ペプチド標準	Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland	Ki-3002-2
Iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	I1149-25G
メタノール, HPLC Grade	Honeywell International Inc., Charlotte, NC,	USA 34885
Nano cHiPLC Trap ChromXP C18-CL, 200 um x 6 mm, 3 um, 120A. (pre-column chip) (200 um x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 300 A)	Sciex LLC, Framingham, MA, 米国	804-00006
Nano cHiPLC ChromXP 75 um x 15cm, C18-CL, 3 um, 120 A (analytical column chip)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00001
Orthoganol quadrupole Time-of-Flight (QqTOF) TripleTOP 6600 質量分析計	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	Per quote
ProteinPilot 5.0	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	software download Sciex
Savant SPD131DDA Speedvac コンセントレーター	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	SPD131DDA-115
Sequencing-grade lyophilized trypsin	Life Technologies	23225
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland	Sw-3001
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	software download Sciex
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC システム	Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA	モデル # 845
Water, Burdick and Jackson LC-MS	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	600-30-76
Waters 1525 binary HPLC pump system	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT081110
Waters 717plus オートサンプラー	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters Flun Collector III	Waters Corp., Milford, MA, USA	186001878