ヒト腎臓組織における局所転写論を明らかにするレーザー微小解剖の応用

Summary

糸球体、近頭尿細管、太い上昇肢、集結管およびインタースティジウムを含むヒト腎臓のサブセグメントのレーザーマイクロディシセクションのプロトコルについて述べている。次いで、RNAを得られたコンパートメントから単離し、RNAシーケンシングを行い、各サブセグメント内のトランスクリプトームシグネチャの変化を決定する。

Abstract

ヒト腎臓組織の遺伝子発現解析は、恒常性および疾患病態生理を理解する重要なツールである。この技術の解像度と深さを高め、組織内の細胞のレベルにそれを拡張することが必要です。単一核および単一細胞RNAシーケンシングの使用は広く普及しているが、組織解離から得られた細胞の発現シグネチャは空間的文脈を維持しない。特定の蛍光マーカーに基づくレーザーマイクロディション(LMD)は、既知の局在化を伴う特定の構造および対象細胞群の単離を可能にし、それによって腎臓組織における空間的に固定されたトランスクリプトーミックシグネチャの取得を可能にする。迅速な蛍光ベースの染色に導かれたLMD方法論を最適化し、ヒト腎臓内の5つの異なるコンパートメントを分離し、その後のRNAシーケンシングを貴重なヒト腎臓組織標本から行います。また、収集した検体の妥当性の評価を可能にする品質管理パラメータも提示します。この原稿で概説されているワークフローは、高い信頼を持ってサブセグメントの転写シグネチャを分離するこのアプローチの実現可能性を示しています。ここで提示される方法論的アプローチは、関連する抗体マーカーの置換を伴う他の組織タイプにも適用され得る。

Introduction

組織標本の研究における技術の進歩は、様々な臓器における健康と病気の状態の理解を改善しました。このような進歩は、病理学が限られた領域または特定の細胞タイプで始まることができるが、臓器全体に重要な意味を持つことを強調している。したがって、現在の個別化医療の時代において、細胞レベルと地域レベルの両方で生物学を理解することが重要であり、^世界的に1.これは、病理学的ストレスを開始および/または応答する様々な特殊な細胞および構造で構成される腎臓において特に当てはまる。様々なタイプのヒト腎臓病の病因はまだよく分かっていない。ヒト腎臓における特定の管状のセグメント、構造、または間質の領域における遺伝子発現の変化を研究する方法論を生み出すと、疾患の病因を知らせることができる領域固有の変化を発見する能力が高まる。

ヒト腎臓生検検は限られた貴重な資源です。したがって、腎臓組織のトランスクリプトミクスを問い合わせた技術は、組織を減態するために最適化されるべきである。細胞および地域レベルでのトランスクリプトミクスを研究するために利用可能な方法は、単一細胞RNAシーケンシング(scRNaseq)、単一核RNaseq(snRNaseq)、その場空間ハイブリダイゼーション、およびレーザーマイクロダイスセクション(LMD)を含む。後者は、下流RNAシーケンシングおよび分析^{2、3、4、5}のために、組織切片内の対象となる領域または構造を正確に分離するために適しています。LMDは、解剖中に蛍光ベースのイメージングを使用して検証されたマーカーに基づいて、特定の細胞タイプまたは構造の同定に頼るために採用することができる。

レーザー顕微鏡解剖支援地域転写術のユニークな特徴には、1)細胞および構造の空間的文脈の保全が含まれ、細胞が組織学的ではなく発現によって同定される単一細胞技術を補完する。抗体マーカーは発現シグネチャを定義するため、2)この技術は他のイメージング技術に情報を提供し、知らされる。3)マーカーが疾患で変化した場合でも構造を識別する能力;4)約20,000遺伝子における低発現転写物の検出。5)顕著な組織経済。この技術は、十分なRNA取得に必要なコアの厚さが100μm未満の腎臓生検に対してスケーラブルであり、大規模なリポジトリまたは学術センター⁶で一般的に利用可能なアーカイブされた凍結組織の使用を可能にする。

その後の研究では、ヒト腎臓組織で使用するための新しい急速蛍光染色プロトコルで最適化された、地域およびバルクトランスクリプトミクス技術を詳細に記述します。このアプローチは、凝集した管間質の表現とは対照的に、インタースティジウムおよびネフロンサブセグメントに対して別々の発現データを提供するため、従来の LMD 探索を改善します。厳格かつ再現性を確保するために実施される品質保証と管理対策が含まれています。このプロトコルは、細胞および関心のある領域の可視化を可能にし、これらの孤立した領域からのRNAの満足のいく獲得をもたらし、下流RNAシーケンシングを可能にする。

Protocol

この研究は、インディアナ大学の機関審査委員会(IRB)によって使用が承認されました。

注:最適な切断温度(OCT)化合物に保存され、-80°Cで保存されている腎臓腎切開組織(XおよびY次元の両方で最大2 cm)でこのプロトコルを使用してください。 RNA汚染を制限する方法ですべての作業を実行し、きれいな使い捨て手袋とフェイスマスクを使用してください。すべての表面の清潔さを確認します。このプロトコルが最適化された装置は、パルスUVレーザーを搭載したレーザーマイクロ解剖システムです。

1. クライオセクション

1. 1.2 μm LMD PPS膜(ポリ(p-フェニレンスルフィド)は、凍結切断の直前にUV光(組織培養層流れフード)に30分間スライドします。最適な組織付着のために、スライドを室温で保管してください。
2. クライオスタットを-20°Cに冷却します。 作業面を清掃し、新しい切断ブレードを取り付けます。
3. 小さなスライドボックス(RNase表面除染液で洗浄)をクライオスタットチャンバーの中に置き、切りたてのティッシュでスライドを保存します。
4. 組織ホルダーにOCTで標本を付着し、チャンバー温度に達するために数分間平衡化し、OCTブロックとホルダーの間の接着を強化します。熱抽出器を使用してプロセスを支援します。
5. 試料を12μmの厚さに切り、スライドアダプタを使用して専用のLMDスライドに貼り付けます。各スライドは、スライドごとに1つの腎切除セクションを保持するか、スライドごとに最大2つの腎臓生検セクションを保持します。スライドを -80 °C に乾燥剤カートリッジを使用して保管し、密閉したビニール袋の中に保管して、余分な水分がスライドボックス内に蓄積するのを防ぎます。
6. 各スライドに、標本ID、日付、スライド番号をラベル付けします。
7. 凍結切断の最初の日から10日以内に標本とスライドを使用してください。

2. レーザーマイクロディシス

1. 染色の直前に、以下を加えることによってRNaseフリーPBSで10%BSAの抗体ミックス(Ab-Mix)を調製する:FITC-ファロイジンの4 μL、 DAPIの1.5 μL、アレクサフルオール546に直接結合したタム・ホースフォールタンパク質(THP)抗体の2μL、RNase阻害剤の3.3μL、PBS中の10%BSAの89.2 μL(100 μLの体積に達する)。
   注:代替抗体はTHP抗体の代わりに使用されてもよい。例えば、2μLのメガリン/LRP2抗体は、アレクサフルオール568に直接結合して、近位細管を標識するために使用することができる。Ab-Mixには、LRP2またはTHP抗体が含まれています(それぞれ、近位細管または太い上昇肢のいずれかを視覚化します)。他の抗体は、ユーザのニーズに応じて検証され得る。
2. スライドを氷冷(-20°C)で100%アセトンで1分間洗い、湿度室に移動します。
3. RNaseフリーPBSでスライドの上部を30sリピートで洗います。
4. RNaseフリーPBSで10%BSAでスライドの上部を30sの繰り返し洗います。
5. 5分間、Ab-Mixを塗布します。
6. RNaseフリーPBSで10%BSAでスライドの上部を30sの繰り返し洗います。
7. スライドを5分間空気乾燥し、レーザーマイクロ解剖切断プラットフォームに積み込みます。
8. PCR作業に適した回収チューブ(オートクレーブ0.5 mLマイクロ遠心分離チューブ)を取り付け、RNA分離キットから50 μLの抽出バッファーを含みます。
9. LMD を続行します。各 LMD セッションは、2 時間以内に完了します。
   1. 顕微鏡カメラを使用して、実行されたプロトコルのアーカイブ目的、トレーニング、品質評価の解剖を検証するために、LMD前後の免疫蛍光画像を収集します。0.5 ~ 1 ng の RNA を得るためには、最低 500,000 μm² 領域が必要です。これは、多くの場合、関心のあるすべてのサブセグメントに十分な量の材料を得るために、最大8 x12 μm厚いセクションを使用する必要があります。
   2. 染色、形態、位置によって関心領域を特定し、40を超えるレーザーパワーを使用してそれらを切除します。
      注: 解剖基準は次のとおりです。近位細管はFITC-ファロイジンおよびLRP2標識によって定義される。太い昇順の四肢はTHPラベリングによって定義されます。収集ダクトは核形態(DAPI)および他の染色の欠如によって定義される。糸球体はFITC-ファロイジンおよび形態によって定義される。インタースティジウムは、染色された管状の間の面積として定義される。
10. 2つの12μm断面をLMDスライドに貼り付け、その断面全体を抽出バッファに解剖することで、バルク断面式シグネチャを得ます。
11. LMDプロセスが完了したら、収集マイクロ遠心チューブを閉じ、それを激しくフリックして、コンテンツがキャップからチューブの底に移動したことを確認します
12. 30 sの3,000 x g でチューブを遠心分離します。
13. 42°Cの水浴で30分間チューブをインキュベートします。
14. 2分間3,000 x g でチューブを遠心分離します。
15. 上清を新しい0.5 mLチューブに移し、-80°Cで保管してください。

3. RNAの単離

注: この RNA 絶縁プロトコルでは、市販の RNA 分離キットからプロトコルを適合させました。製造元のプロトコルは、プロジェクトに設定された品質管理要件を満たすように変更されています。

1. 各RNA精製カラム(PC)に250μLのコンディショルドバッファー(CB)を加え、室温で5分間インキュベートします。
2. 遠心分離機 16,000 x gで 1 分間すべての PC .
3. 50 μLの70%エタノール(キットに付属)を組織サンプルでチューブに加えます。上下にピペットを入れ、サンプルをよく混ぜます。渦を出さないで下ろしてください。遠心分離機を使用しないでください。
4. 100 x g で 2 分間調整された PC と遠心分離機に混合物を移し、16,000 x g で 30 s の遠心分離を迅速に行います (流れを除去するため)。特定のサブセグメントに対して組織サンプルを持つチューブが 1 つ以上ある場合は、この手順を繰り返します。
5. 100 μL のウォッシュバッファ 1 (WB1) を PC に追加し、遠心分離機を 8,000 x gで 1 分間追加します。
6. 各サンプルごとに40 μLのDNaseを用意します(RDDバッファの35 μLに5μLのDNaseを追加します)。その後、PCの膜に直接40μLの混合物を加え、室温で15分間インキュベートします。
7. PCの膜にWB1の40 μLを加え、8,000 x gで15 sの遠心分離機を加 えます。
8. PCの膜に100 μLのウォッシュバッファ2(WB2)を加え、遠心分離機を8,000 x gで1分間加 えます。
9. PCの膜にWB2の100 μLを加えて、16,000 x gで2分間遠心分離し、16,000 x gで1分間の遠心分離の直後に加 えます。
10. PCを新しい0.5 mLチューブに移します。
11. 膜に溶出バッファー(EB)の12 μLを加え、室温で7分間インキュベートします。したがって、全ての分化された解剖組織サンプルの最終容積は、サブセグメント当たり12μLである。
12. 遠心分離 1000 x g で 1 分間、16,000 x gで 2 分間のサンプルを.
13. バイオアナライザ分析用に2μLを新しいチューブに移します(凍結融解イベントを防止するため)。
14. すべてのチューブを-80 °Cに保管して、さらなる処理の準備が整います。

4. RNAシーケンシング

1. 商業用バイオアナライザーと少量のRNA測定専用チップを使用して、シーケンシング用の各サンプルを評価します。
2. ライブラリの準備とシーケンスの前に次の品質管理(QC)パラメータが必要です:バルクの場合は4 ngより大きく、各サブセグメントの1 ng以上のRNAの量。200ヌクレオチド(DV200)より長い転写物のパーセントは、LMD標本(最適>75%)に対して25%を超える必要があります。
3. 少量の分解されたRNAを対象とした商用cDNAライブラリ調製キットでライブラリの準備を行います。サプリメントに記載されている市販キットの場合、25% の最小 DV200 と断片化を必要としないオプション 2 を使用することをお勧めします。シーケンス テクノロジによっては、30% 7 など、より高い最小 DV200 しきい値が必要^{になる場合があります}。
4. cDNAアダプターとインデックスを追加します。
5. 磁気ビーズ技術を使用して、RNAseqライブラリを浄化します。
6. RNAseqライブラリ増幅工程の前に市販のrRNA除去キットを使用してリボソームcDNAを枯渇させます。
7. 2 ng/μL cDNAライブラリ濃度で磁気ビーズ技術を使用して、最終的なRNAseqライブラリを精製します。
8. バルク用に 3,000 万読み取り/サンプル、サブセグメントセクションの場合は 1 億読み取り/サンプルを使用して、商業シーケンシング システムで 75 bp ペアエンドの RNA シーケンシングを実行します。
9. バッチ効果の制御を可能にするために、シーケンシングの実行ごとにリファレンスRNA(25 μg)を使用してください。リファレンスRNAの初期濃度は1μg/μLで、シーケンシングで使用される最終濃度は25 ng/μLです。
10. FastQC アプリケーションを利用してデータ解析を実行し、シーケンシング、遺伝子間およびミトコンドリア読み取りの品質を評価し、遺伝子に起因する読み取りを決定します。
11. アライメントには統合ゲノミクスビューア(IGV)を使用し、トランスクリプト発現測定にはedgeR/rbamtoolsを使用します。
12. 100,000 読み取りより少ないサンプルを削除します。位数は、ユーザー定義のしきい値で低く発現した遺伝子を除外した後、データセット内の生の読み取りを正規化します。
13. 式を、他のすべてのサブセグメントおよび log2 変換の平均に対する対象サブセグメントの比率として定量化します。同じ遺伝子の相対発現は、サブセグメントとサンプル間で比較され得る。しかし、遺伝子とRNA種間の分解の可能性により、2つの異なる遺伝子間の相対的な発現を比較することは理想的ではありません。
14. 各ネフロンサブセグメントに固有のメーカーのセットの遺伝子発現を比較するために濃縮分析を行い、参照RNAサンプルはバッチ間で比較されます。R 値が 0.9 を超える平均式の標準偏差の 1 以内のバッチ効果は許容可能と見なされます。バッチ効果スコアを高くする場合は、追加の正規化が必要です。受け入れられたバッチ効果から逸脱した実行には、フラグを設定できます。Q30 は、シーケンス実行ごとに 90%以上にする必要があります。

Results

サンプル

9つの基準腎切除術(インディアナ大学で得られた3つの標本と腎臓精密医療プロジェクトを通じて得られた6つの標本)からのデータを提示し、腎臓腎球体のセグメントおよび間質領域を分離する急速な蛍光染色法を利用する。このプロセスで利用されたセクションは、死亡した腎臓ドナーまたは影響を受けない腫瘍腎摘出から得られた。これらのサンプルは、連続したセクションから採取したH&E染色で可視化された疾患の病理学的証拠を有していなかった(図1A)。

レーザーマイクロディスセクション品質管理

腎臓の管状サブセグメントの同定は、独自の管状マーカーの抗体染色、ならびに形態および構造的ランドマークによって達成される。 図1B-C は、代表的な腎摘出術からの管状サブセグ...

Discussion

LMDベースのトランスクリプトミクスは、組織内の特定の領域に遺伝子発現を固定する有用な技術である。腎臓におけるこの技術とその潜在的な応用の基礎は、前に説明された⁸.しかしながら、最適化、近代化、蛍光法解解の合理化は、特に下流RNAシーケンシングのための高精度解離を目的とすることは、あまりユビキタスではない。この方法論は組織内に空間的に接地されているため、特に疾患状態において、組織構造における新規または過小評価されたマーカーを明らかにする可能性がある。実際、細胞の多くの一般的なマーカーは疾患によって変化する可能性があるため、空間的文脈のない同一性裁定のために細胞RNA発現マーカーのみに依存することは、疾患状態では困難である可能性がある。したがって、空間的に固定されたLMDアプローチは、単一細胞および単一核RNAシーケンシングのような他の多くの転写技術を補完し、その遺伝子発現プロファイル⁹によって主に細胞を定義する地上真理プラットフォームを提供する可能性がある。さらに、LMDが提供する遺伝子発現の深さ(サンプルあたり最大20,000個の遺伝子)は...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アセトン	Sigma-Aldrich	270725-1L
アンプレ ビーズ	ベックマン・コールター	A63880
バイオアナライザー	アジレント	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	サーモフィッシャー	62248
乾燥剤カートリッジ	Bel-Art	F42046-0000
DNAse	Qiagen	79254	RDDバッファーは、パッケージに含まれています
レーザーマイクロダイセクション顕微鏡	ライカ	LMD6500
メガリン/LRP2抗体	Abcam	ab76969	Alexa Fluor 568
マイクロ遠心チューブ	サーモフィッシャー	AB-0350
顕微鏡カメラ	ライカ	DFC700T
PBS (RNAse Free)	VWR	K812-500ML
Phalloidin (Oregon Green 488)	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems	KIT0204
PPSメンブレンスライド	Leica	11505268
qPCR Human Reference Total RNA 25 µg	タカラクロンテック	636690
RNA 6000 真核生物 トータルRNAピコチップ	アジレント	5067-1513
RNAse アウェイ	サーモフィッシャー	7000
RNAse阻害剤	サーモフィッシャー	AM2696
シーケンサー (HiSeq または NovaSeq)	イルミナ	NA
SMARTer ストランドトータル RNAseq ピコ インプット v2	タカラクロンテック
Tamm-Horsfall タンパク質抗体	R&D Systems	AF5144	Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583