集束走査超音波を用いた脳への抗体の送達

サマリー

ここでは、血液脳関門(BBB)を葉状またはマウス脳全体に一過性に開放して蛍光標識抗体を送達し、ミクログリアを活性化するプロトコルを紹介します。また、組織学による抗体の送達およびミクログリア活性化を検出する方法も提示される。

要約

脳疾患を標的とする抗体医薬のごく一部のみが脳に取り込まれます。集束超音波は、血液脳関門(BBB)の一時的な開放を介して抗体の取り込みおよび関与を増加させる可能性を提供する。当研究室では、複数の部位を標的とした頭蓋骨を標的とした集束超音波の適用と併せて、マイクロバブルを用いてBBB全体に様々な形態の抗体を送達する神経変性疾患の治療アプローチを開発しています。血管に対するマイクロバブルおよび超音波の機械的効果は、タイトジャンクションを一時的に分離することによってBBBを横切る傍細胞輸送を増加させ、小胞媒介性トランスサイトーシスを増強し、抗体および治療剤が効果的に交差することを可能にする。さらに、超音波はまた、抗体が細胞体全体に分布するニューロンなどの脳細胞への間質脳からの抗体の取り込みを容易にし、さらには神経炎プロセスにも促進する。本研究では、蛍光標識抗体を調製し、自社で調製した脂質ベースのマイクロバブルと混合し、SUSを脳に塗布する直前にマウスに注射します。その後、脳内の抗体濃度の増加が定量化されます。正常な脳恒常性の変化を説明するために、ミクログリア貪食作用を細胞マーカーとして使用することができる。生成されたデータは、抗体の超音波送達が神経変性疾患を治療するための魅力的なアプローチであることを示唆している。

概要

治療用超音波は、脳への治療薬のアクセスを容易にすることによって、非侵襲的な方法で脳疾患を治療することを目的とした新興技術です^1,2,3。脳疾患を標的とする治療用抗体のごく一部のみが脳に取り込まれ、脳内に保持されるため⁴、治療用超音波は、その取り込みと標的エンゲージメントを高める可能性を提供します^5,6。

当研究室では、マイクロバブルを用いて血液脳関門(BBB)を介して様々な形態の抗体を送達する神経変性疾患の治療アプローチを開発しています。これを達成するために、超音波は、我々が走査超音波(SUS)⁷と呼ぶ走査モードを使用して、頭蓋骨を通って脳に複数のスポットで適用される。超音波エネルギー、静脈内注入されたマイクロバブルおよび脳血管系との間の機械的相互作用は、所与の超音波処理体積におけるBBBのタイトジャンクションを一過性に分離し、抗体および治療薬を含む他の貨物がこの障壁を効果的に通過することを可能にする^7,8,9.さらに、超音波は、間質性脳からニューロンなどの脳細胞への抗体の取り込みを容易にし、抗体が細胞体全体および神経炎プロセスにさえ分布することが示されている^5,10。

アルツハイマー病はアミロイドβとタウの病理¹¹によって特徴付けられ、病原性メカニズムを解剖し、治療戦略を検証するために多数の動物モデルが利用可能です。超音波を脳全体に逐次パターンで適用するSUSアプローチを数回の治療セッションにわたって繰り返すと、アミロイドβ沈着アミロイド前駆体タンパク質(APP)変異マウスの脳内のアミロイドプラーク病理を軽減し、アミロイドを取り込むミクログリアを活性化し、認知機能の改善につながります⁷。超音波およびマイクロバブルによるBBB開口部はまた、pR5、K3およびrTg4510タウトランスジェニックマウスにおけるタウ病理を減少させる5,12,13。重要なことに、ミクログリアは細胞外タンパク質沈着物を除去するが、SUSによって誘導されるニューロン内病理の根底にあるクリアランスメカニズムの1つは、ニューロンオートファジーの活性化である¹²。

ここでは、蛍光標識抗体を調製し、社内の脂質ベースのマイクロバブルと混合した後、麻酔をかけたマウスに眼窩後注射する実験プロセスを概説する。眼窩後注射は尾静脈注射の代替であり、同様に効果的で繰り返し行う方が簡単であることがわかっています。これに続いて、SUSを脳に適用します。治療用抗体の取り込みを決定するために、マウスを屠殺し、脳内の増加した抗体濃度を定量化する。脳恒常性の変化の代理として、ミクログリア貪食活性は、組織学および体積3D再構成によって決定される。

生成されたデータは、抗体の超音波送達が神経変性疾患を治療するための潜在的に魅力的なアプローチであることを示唆している。このプロトコルは、他の医薬品候補や、定義されたサイズの蛍光標識されたデキストランなどのモデル貨物にも同様に適用できます¹⁴。

プロトコル

すべての動物実験は、クイーンズランド大学の動物倫理委員会によって承認された。

1. マイクロバブルの社内準備

1. 1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンと1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩)のモル比を9:1で計量する。マイクロバブル溶液1mLあたり0.5mgの脂質混合物が必要である。あるいは、脂質はクロロホルムで既に購入することができ、予め溶解した脂質を使用する場合はステップ1.3に進む。
2. ガラスビーカー内の少量のクロロホルムに脂質を溶解する。
3. クロロホルムをエバポレーターまたは窒素気流で蒸発させる。
4. 乾燥した脂質膜を、0.22 μm フィルターでろ過した PBS + 10% グリセロール + 10% プロピレングリコール溶液 10 mL で再水和します。
5. 再水和脂質溶液を55°C(脂質の溶融温度以上)に設定したウォーターバス超音波処理機に入れ、完全に溶解するまで超音波処理する。
6. 脂質溶液をオートクレーブ処理した1.5mL HPLCバイアルにアリコートし、セプタキャップにねじ込む。
7. 27G針を備えた5mLシリンジでバイアル内のすべての空気を吸引し、バイアル内に真空を作ります。
8. 付属のシリンジでオクトフルオロプロパンをバイアルに加え、キャニスターからガスを吸い込みます。シリンジ内の体積を読み取ることによって、バイアルに1〜2mLのオクタフルオロプロパンを充填する。
9. 各バイアルをパラフィンフィルムで密封し、冷蔵する。
10. 実験当日、バイアルを室温にし、0.5mLの0.9%NaCl溶液をバイアルに加え、バイアルをアマルガメーターに入れ、45秒(予め設定された時間)攪拌してマイクロバブルを生成させた。

2. コールターカウンターによるマイクロバブル品質管理

1. マイクロバブル溶液をアマルガメータから取り出し、セプタを19G針で穿刺してバイアルからガスを排出する。
2. 19G針付き1mlシリンジを用いて5mLの濾過流動溶液にマイクロバブル溶液100μLを加えて2段階1:5,000段階希釈を行いマイクロバブル溶液を希釈し、次いで1:50希釈マイクロバブル溶液100μLを採取し、ピペットを用いてキュベット内の10mL濾過流動溶液にピペッティングする。
3. 電解質タンクに十分なフロー溶液があり、廃棄物タンクが空であることを確認してください。
4. キュベットをコールターカウンタープラットフォームに置き、所定の位置にロックします。サンプル取得には30μmのアパーチャを使用してください。
5. ソフトウェアで、標準操作方法(SOM)をロードし、[ SOM|濃度の編集 ]を選択します。5000倍の希釈率を入力します。
6. ソフトウェアで、適切なファイル名を選択します。たとえば、microbubble_1_dateのようにします。
7. キュベットをプラットフォームにロードして固定します。
8. ソフトウェアで [ 実行] を選択|サンプル 濃度が10%未満であることをプレビューして確認します。この数値が10%より高い場合、より高い希釈倍率でマイクロバブルの新たな希釈を行う。
9. 「開始」を選択してサンプルの集録を開始し、初期読み出しを取得します。
10. 各測定後にろ過されたフロー溶液でコールターカウンターの開口部をすすぎます。手順2.2~2.9を繰り返して、3回の反復を取得します。
11. 超音波処理器の水浴に希釈マイクロバブル溶液とキュベットを置き、30秒間超音波処理します。
12. 超音波処理されたマイクロバブルで溶液を測定し、ブランクとしてラベルを付けます。
13. ソフトウェアで、最初の読み出しから最終的な読み出しを減算します。これにより、マイクロバブルではなく、気体を含まない粒子が差し引かれます。
14. ソフトウェアで 結果の表示 を選択し、マイクロバブル濃度、サイズ分布、平均サイズ、体積濃度を表示します。

3. 蛍光抗体標識

1. マウス IgG を無添加で PBS 中に 1 mg/mL 溶液で入手します。
2. キットにある製造元の指示に従って、マウスIgGを0.1 M重曹緩衝液中のAlexaFluor 647で1 mgのラベル付けします。この量の蛍光標識IgGは、5mg/kg用量の抗体を投与する5〜7匹の成体マウスでこの手順を実行するのに十分である。
3. 色素を0.1 M重曹緩衝液中のIgGの溶液に加え、室温で15分間インキュベートする。
4. 蛍光標識抗体を精製するには、抗体溶液をスピンカラムにピペッティングし、1,000 x g で5分間遠心分離します。遊離染料はカラムベッドに残ります。
5. 分光光度計を使用してタンパク質濃度を測定します。280nmおよび650nmにおけるコンジュゲート溶液の吸光度を測定する(A280およびA650)。次の式を使用して、サンプル中のタンパク質の濃度を計算します。
   タンパク質濃度(M)=[A280-(A650 x 0.03)]×希釈倍率/203,000。
6. 分光光度計を使用して、次の式を使用してラベリングの程度を計算します。
   モルタンパク質当たりの色素モル数=A650 x希釈倍率/239 000 xタンパク質濃度(M)。
   注:許容可能な標識の程度は、タンパク質1モル当たり3〜7モルの色素であり、典型的には得られる標識の程度は約6である。

4. 超音波のセットアップ

1. 集束超音波システムを使用して、5mmスペーサーを水ボーラスに追加して、超音波焦点を水ボーラスの底から9mm下方に配置します。
2. インライン脱気装置で20分間脱気した約300mLの脱イオン水で水ボーラスを満たします(酸素含有量は3ppm未満でなければなりません)。環状アレイを充填された水ボーラスに入れ、歯科用ミラーを使用して表面に気泡がないことを確認します。表面に存在する場合は、環状アレイを取り外し、水中ボーラスに入れ替えます。
3. アプリケーションソフトウェアを起動します。波形メニューで、「 波形デューティサイクルを設定」を選択します。設定はPRF(Hz)10、デューティサイクル10%、フォーカス80mm、中心周波数1MHz、振幅(MPaピーク負圧)0.65MPa、メカニカルインデックス=0.65です。 Set キーを押して波形を定義し、メモリに保存します。
   注:集束超音波システムは、校正されたハイドロフォンによって行われた測定値から製造業者によって事前に較正されています。
4. 集束超音波システムソフトウェアで、治療計画を定義します。これには、複数の個々の治療部位からなる治療領域を定義し、それらの治療部位のそれぞれでとるべきアクションを定義することが必要である。この場合、治療ゾーンはマウス脳の1半球である。
5. モーションコントローラウィンドウで、[ スキャン ]タブに移動し、x次元のモーションの開始値、停止値、インクリメント値を入力し、y方向の動きの開始値、停止値、インクリメント値 を入力します 。X: 開始 -4、停止 3.50、Y: -3.00、停止 3、インクリメント 1.5、# ループ: 1 の値を入力します。
6. 治療部位のアクションを定義します。モーションコントローラウィンドウで、[ イベント ]ボタンを選択します。 スクリプト編集ウィンドウで、各治療部位で選択した順序で実行されるアクションのリストを選択します。スクリプトウィンドウの上部にある [移動タイプ ]をラスターグリッドに設定します。「イベント」タブで 、「アクションの追加」 を選択してスクリプト・パネルに移動し、「 同期的に移動」、「トリガー arb を 開始」、「 待機」、「トリガー arb を停止」 を追加します。待機アクションをクリックし、6, 000 ミリ秒の待機時間を選択します。
   注:これらの設定により、治療は1.5 mm間隔で6 x 5グリッドの処理スポットになり、各スポットの治療期間は6秒になります。マウスの脳を超音波処理する総持続時間は約3分です。このサイズの治療グリッドは、体重約30gの成体C57/Bl6マウスに適しています。治療スポットのグリッドのサイズは、マウスのサイズに応じて上下に調整することができます。

5. 動物の準備

1. 0.1gの正確な天秤でマウスの重量を量ります。
2. マウスを腹腔内に90mg / kgケタミンおよび6mg / kgキシラジンで麻酔する。つま先のピンチで反射神経がないかテストします。あるいは、マウスは、適切なフェイスマスクを有する適切な吸入麻酔装置を用いてイソフルランで麻酔することができる。イソフルランを使用する場合は、低体温症を防ぐために超音波検査中にマウスをヒートパッドに置く必要があります。
3. 電気カミソリを使用して動物の頭から髪を剃り、綿芽で脱毛クリームを塗布し、2〜3分間、または湿ったガーゼで髪をきれいに拭き取るまで放置します。脱毛クリームがマウスの目に入り込まないように注意してください。
4. マウスの頭の中心に永久マーカーを付けます。トランスデューサの中心には穴があり、トランスデューサの焦点と焦点を視覚的に位置合わせすることができます。
5. 以前に底部が切断され、超音波ゲルで計量ボートの底に接着されたプラスチックラップと交換された小さな計量ボートを充填する。これは8mmのスペーサーとして機能し、マウスのヘッドに良好な結合を提供し、マウスのヘッドに合わせた探触子の焦点の目視検査を可能にします。

6. マイクロバブル調製

1. マイクロバブルバイアルを室温まで温める。活性化するには、0.5mLの0.9%NaCl溶液をバイアルに加え、アマルガメータに入れて45秒間攪拌してマイクロバブルを生成する。
2. セプタを27G針で突き刺してバイアルを通気します。

7. 超音波治療

1. マイクロバブルのバイアルを反転させ、1μL/gの体重の溶液を静かに引き出す。これに蛍光標識抗体の溶液を加え、シリンジ内で穏やかに混合する。注入される最大容量は150μLである。
   注:社内で調製されたマイクロバブルは、臨床的に使用されているマイクロバブル(例えば、Definityマイクロバブル)よりも約60倍濃度が低い。注入されるマイクロバブルの数が臨床的に使用されているものと類似するように体積または濃度を調整する(すなわち、マイクロバブルの数が臨床的に使用されているものと同様である(すなわち、マイクロバブルの数が臨床的に使用されているものと同様である。定義1.2 x ¹⁰⁸ マイクロバブル/ kg体重)。
2. マイクロバブルと抗体溶液を眼窩下へ注入し、穏やかでゆっくりと注入するように注意する。次に、マウスの目に眼科用軟膏を塗布する。
3. マウスをヘッドホルダー(材料表を参照)に置き、マウスの鼻を固定します。次に、超音波ゲルで満たされた小さな計量ボートを頭の上に置きます。
4. 計量ボートの超音波ゲルの上に座るまで、水ボーラスを下げます。
5. ジョイスティックを使用して、探触子のフォーカスをヘッドの中央に移動します。モーションタブで 「原点をリセット」 を選択します。
6. [スキャンの完了] を選択します。手順 7.3 ~ 7.6 の所要時間は 2 分です。
7. 一貫性を保つために、マイクロバブルの注入から完全スキャンの選択までの間に2分の遅延があるようにタイマーを設定します。
8. 治療が完了したら、眼科用軟膏を眼に塗布し、マウスを温めた回収チャンバに入れる。処置中に低体温が観察された場合、処置中に補助的な熱を提供するために、加温パッドをマウスの下に置くことができる。

8. 組織の採取と加工

1. 超音波送達後の関心のある時点(脳内の高レベルの抗体を検出するために少なくとも1時間)に、ペントバルビトン溶液(100mg / kg)の過剰摂取でマウスを深く麻酔し、30mLのPBSでマウスを経心線灌流する。良好な灌流は、脳に送達された蛍光標識抗体を特異的に検出するために必要とされる。
2. 脳を集め、4%PFAに4°Cで24時間浸漬して固定し、PBSで洗浄する。
3. 脳をトレイの上に置き、700nmチャンネルの画像を取得することによって、赤外線スキャナで脳を画像化します。
   注:固定後、脳をPFAから除去し、PBSで洗浄し、切片化する。あるいは、エチレングリコール凍結保護剤溶液中に4°Cで24時間、または水没するまで入れ、次いで新しい凍結保護剤含有バイアルに移動し、長期保存のために−20°Cで置くことができる。
4. ビブラートームを用いてPBSで脳風邪を切開する。脳をプラットフォームに接着し、30〜40μmの切片を切断してPBSに集める。
   注:リソソーム自己蛍光(約12ヶ月以上経過した動物からの切片で流行)は、細菌の増殖をブロックするために、室温およびアジド(0.02%)を含むPBS中で、軽いチャンバーボックス内の切片の一晩照明によって漂白されるべきである。

9. 組織染色と画像取得

1. 切片をブロッキング溶液(0.2%トリトン/PBS中の5%BSA)に室温で2時間移送し、次いで溶液を0.2%トリトン/PBSで置換して切片3xを洗浄する。
2. 切片を、Iba1(希釈1:1,000)およびCD68(希釈1:500)に対する一次抗体と共に、0.2%Triton/PBS中で一晩4°Cでインキュベートし、続いて0.2%Triton/PBSで3回洗浄する。
3. 切片を蛍光二次抗体(希釈1:500)で室温で2時間インキュベートし、続いて0.2%Triton/PBSのみで3回洗浄します。
   注:核は、DAPI溶液(0.5μg/mL)を使用して染色することもできます。
4. 切片をスライドとカバースリップに、ハードセットの取り付けメディアで移します。可視化と画像取得の前に(一晩)取り付け媒体が固化するのに十分な時間を確保してください。
5. 共焦点顕微鏡を用いて、共焦点顕微鏡および少なくとも40倍の倍率の対物レンズを用いて、超音波標的脳領域のzスタック画像(少なくとも10μm深さおよび0.3μmステップサイズ、動物あたり10画像)を得る。
   メモ:信号ダイナミックレンジ内の画像を取得するように注意し、露出不足/露出過多を避けてください。顕微鏡で使用される対応するソフトウェア形式で画像ファイルを保存します。

10. 画像解析

1. 画像解析ソフトウェアのファイルインポーターを使用して、zスタック顕微鏡ファイルを変換します。
2. 変換したファイルをソフトウェアに開き、Iba1チャネルの強度を調整してミクログリア細胞を観察します。
3. 単一のミクログリアセルの周りにボックスを描画してトリミングし、「トリミング」を選択して新しいファイルを保存します。
4. IBA1 信号の 3D サーフェス レンダリングを作成するには、次の操作を行います。
   1. 前の手順で生成した単一セルの Imaris ファイルを開きます。
   2. ファイルにサーフェスを追加します。
   3. Iba1染色に対応するチャネルを選択する。
   4. Iba1染色と重なるしきい値を適用する
   5. 目的のミクログリア細胞を形成している目的の構造のみを選択する
5. プロセスの最終決定
   1. Iba1染色の体積を取得して記録する
   2. CD68染色の3D表面レンダリングを構築する
   3. IBA1サーフェスサブファイル内で、CD68チャンネルをマスクし、IBA1染色の外側のボクセルを除去します
   4. ファイルに新しいサーフェスを追加する
   5. CD68染色に対応するチャンネルを選択
   6. CD68染色と重なり、染色量にできるだけ近い閾値を適用する
   7. このファイルにはミクログリア内CD68構造のみが存在し、したがって、別の閾値フィルタリングステップを必要としないため、プロセスを終了します。
   8. CD68陽性構造の数と平均体積を取得して記録する
   9. 貪食状態におけるミクログリア活性化の尺度として、対応するIBA1構造当たりのCD68構造の相対体積を計算する。

結果

このプロトコールを用いて、蛍光標識抗体が脳に送達され、ミクログリア活性化とともに検出することができる。引き出すことができる結論は、集束超音波およびマイクロバブルの使用が抗体の脳取り込みを著しく増強し、スキャンモードで使用するとマウスの脳全体または半球に抗体を送達することができることである。 図1 は、BBBを開くために使用されるTIPS超音波アプリケーションデバイス(ラベル付けされた異なるコンポーネント)を示しています。 図2 は、マイクロバブルが正しく生成されたときに得られるはずのサイズと濃度のコールターカウンター測定からの代表的な結果を示しています。送達を容易に視覚化するために、抗体を遠赤色蛍光色素で標識した。脳による抗体の取り込みは、赤外線スキャナーまたは脳切片の蛍光顕微鏡を使用して、脳全体または切片で簡単に視覚化できます。脳切片は、蛍光標識抗体の位置を顕微鏡レベルで示す。蛍光標識抗タウ抗体RN2Nの海馬への走査型超音波送達についての代表的な結果を 図3...

ディスカッション

蛍光標識抗体は、走査モードで適用されるマイクロバブルと共に集束超音波を使用して脳に送達することができる。抗体送達、ミクログリア形態およびリソソーム拡大は、走査型超音波に続く蛍光顕微鏡によって検出することができる。ミクログリアは、Fc受容体媒介プロセスにおいて抗体と抗体が結合した抗原をリソソームに取り込むことができます⁴。

この方法を用いて反復可能なBBB開口および抗体送達を達成するためには、多くの重要なステップがある。超音波探触子とマウスの頭部との間の良好な結合を確保することが重要です。マウスの頭の毛をすべて取り除き、カップリングに気泡がないことを確認します。社内で調製されたマイクロバブルの特性は、成功に不可欠です。マイクロバブルは、¹⁰⁸ マイクロバブル/mLの十分な濃度と、マイクロバブルの90%以上が直径10μm未満になるようなサイズ分布を有する必要があります。これは、より大きなマイクロバブルが肺によって循環から濾過されることが知られているからである。許容中央値サイズは 1 ~ 3 μm です。マイクロバブル...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン	Avanti	850365C
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2000]	Avanti	880128C
AlexaFluor 647抗体ラベリングキット	サーモフィッシャー	A20186
CD68	AbD セロテック	MCA1957GA	使用 1:1000 希釈
クロロホルム	Sigma-Aldrich	372978
コールターカウンター (マルチサイザー 4e)
グリセロール	Sigma-Aldrich	G5516
ヤギ抗ウサギ IgG、アレクサ フロー 488	サーモフィッシャー	A-11008	1:500希釈ヤ
ギ抗ウサギIgG、アレクサフロー 488	サーモフィ	ッシャーA-11077	1:500希釈使用
ヘッドホルダー (型式 SG-4N, 成茂県)
Iba1 antibody	和光	019-19741	使用 1:1000希釈
画像解析ソフト	ベックマン・コールター	#8547008
アイソフローフローソリューション	ベックマン・コールター	B43905
近赤外イメージングシステム オデッセイ Fc	Licor	2800-03
オクタフルオロプロパン	Arcadophta	0229NC
プロピレングリコール	Sigma-Aldrich	P4347
TIPS (Therapy Imaging Probe System)	Philips Research	TIPS_007
	Bitplane