方法論記事

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

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DOI：

10.3791/61388

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2020年11月14日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS-UBI), Universidade da Beira Interior, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、高収率と再現性を持つ、胚性皮質由来のニューロンおよびアストロサイトエンリッチ培養、またはニューロングリア培養を確立できる特定の培養培地を用いた簡単なアプローチを提示する。

要約

虚血性脳卒中は、脳組織の低灌流、酸素およびグルコース欠乏、および結果的な神経喪失を特徴とする臨床状態である。多くの証拠は、グリアと神経細胞の相互作用が虚血性事象の後に有益な効果を発揮することを示唆しています。そのため、潜在的な保護機構を探索するためには、虚血環境におけるニューロンとグリアの相互作用を研究できるモデルを開発することが重要です。ここでは、ラット胚性皮質からアストロサイトおよびニューロンを単離する簡単なアプローチを提示し、特定の培養培地を用いて、ニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物またはニューロングリア培養を高収率および再現性で確立することを可能にする。

アストロサイトとニューロンのクロストークを研究するために、カバーリップで培養されたニューロンがマルチウェルプレートにメッキされたアストロサイトの単層と接触して維持される共培養システムに基づくアプローチを提案する。2つの培養物は、小さなパラフィン球によって離れて維持される。このアプローチは、独立した操作と各細胞タイプへの特定の治療法の適用を可能にし、多くの研究において利点を表している。

虚血性脳卒中中に何が起こるかをシミュレートするために、培養物は酸素およびグルコース剥奪プロトコルに供される。このプロトコルは虚血性脳卒中におけるニューロンとグリア相互作用の役割を研究するのに有用なツールを表す。

概要

世界保健機関(WHO)のデータによると、毎年約550万人が虚血性脳卒中で死亡しています。この状態は、ある脳領域への血流の中断によって特徴付けられるが、組織への酸素および栄養素の供給において可逆的または不可逆的な損失をもたらし、組織機能を変化させ、ミトコンドリア機能不全、カルシウム調節障害、グルタミン酸興奮性、炎症および細胞損失22、33を引き起こす。

血管細胞とは別に、神経細胞およびグリア細胞は虚血性脳卒中4の病態生理学に関与している。特に、アストロサイトはニューロンの維持に必須であり、最近では虚血病変5に対する応答において重要な役割を果たすることが示された。このタイプのグリア細胞は、構造的支持の機能を果たす、酸化ストレスに対する防御、神経伝達物質の合成、細胞間通信の安定化、とりわけ6。ニューロンと並んで、アストロサイトはシナプス伝達において直接的な役割を果たし、アデノシン三リン酸、γ-アミノ酪酸およびグルタミン酸7などの分子の放出を調節する。虚血によって引き起こされる傷害の一部は、シナプス裂切れにおけるグルタミン酸の過剰放出およびその蓄積によって引き起こされ、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体の過剰活性化につながり、下流シグナル伝達カスケードを活性化し、最終的に興奮性障害をもたらす8を生じる。アストロサイトはシナプス裂膜からグルタミン酸を除去し、グルタミンに変換することができるので、興奮毒性に対する防御に重要であり、それによって虚血に対する神経保護効果を発揮する。これらの細胞はまた、虚血誘発性神経炎症の役割を果たす。虚血性侮辱の後、活性化されたアストロサイトは形態学的変化(肥大)を受け、増殖し、そしてグリア性フィブリリン酸性タンパク質(GFAP)発現の増加を示す。それらは反応性(アストログリオーシス)になり、腫瘍壊死因子-α、インターロイキン-1αおよびインターロイキン-1βなどの炎症性サイトカインを放出し、一酸化窒素およびスーパーオキシドを含むフリーラジカルを産生し、神経死9,1010を誘導することができる。対照的に、反応性アストロサイトはまた、神経保護作用を果たして、脳卒中11後にアップレギュレートされる成長因子βの転換などの抗炎症性サイトカインを放出するのでである。さらに、彼らは、軸索発芽を阻害することによって組織の再生を制限することができるグリア瘢痕を生成することができます。しかし、このグリア瘢痕は、損傷部位を生存可能な組織から隔離することができ、従って制御されていない組織損傷12、13,13のカスケード波を防ぐ。

したがって、虚血性損傷の影響を制限または逆転させる治療戦略を見つけるために、虚血性傷害下でのニューロンとグリアの相互作用を研究できるモデルを確立することが不可欠です。虚血性損傷を研究するために使用される他のモデル、すなわち生体内モデル,14、15、16、,15,16オルガノスティック培養17、18、1918および17急性脳スライス20、21、22,21と比較して、一次細胞培養は複雑性が低く、これは虚血性脳卒中の病態生理学における各細胞型の個々の寄与の研究を可能にする。,2219典型的には、ニューロンエンリッチ培養とアストロサイトエンリッチ培養との相互作用を研究するために、出生後起源のニューロンおよびグリア細胞は、23、24、,24または出生後グリア細胞および胚性ニューロン25、26,26を使用する。本明細書では、同じ組織からニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物およびニューロングリア培養を確立するための簡単なアプローチが提案される。これらの初細胞はラット胚性皮質から得られ、脳卒中27、28,28によって頻繁に影響を受ける領域である。また、組織の解離は機械的な手順によってのみ行われる。したがって、このプロトコルは、開発の同じ段階で、高速かつ安価な方法で、高い性能と再現性で細胞を単離することができます。

アストロサイトとニューロンのクロストークは、カバーリップで培養されたニューロンがマルチウェルプレートに播種されたアストロサイトの単層と接触して維持される共培養システムを使用して探索することができる。小さなパラフィン球体は、2つの細胞培養物の分離を確実にするために使用することができる。この方法では、各セル型が接触する前に、独立した操作が可能になります。例えば、アストロサイトの特定の遺伝子を沈黙させ、それが虚血性損傷に対する神経の脆弱性または保護にどのような影響を与えるかを見ることができます。インビトロで虚血性様条件を誘導する確立された方法は、酸素およびグルコース欠乏(OGD)3であり、これはグルコースの省略に関連するアノキシック雰囲気(95%N2および5%CO2)によって通常の雰囲気(95%空気および5%CO2)を置き換えることから成る。322 2

記載された方法は、虚血性脳卒中の文脈におけるニューロンとアストロサイト間の相互作用を、簡単で、速く、再現可能で安価な方法で研究するのに適している。

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プロトコル

使用されるすべての動物は、動物研究のための国家倫理要件に従って、および実験およびその他の科学的目的のために使用される脊椎動物の保護のための欧州条約(指令2010/63/EU)に従って、CICS-UBI健康科学研究センターで飼育されました。

1. ラット胚皮質一次細胞培養

  1. 培地製剤
    1. 次のサプリメントを追加して神経基底培地 (NBM) を準備します: 2% B27, 0.5 mM グルタミン, 25 μM グルタミン酸および 120 μg/mL ゲンタマイシン.均質化し、pHを7.2に調整し、0.22 μmのフィルターを使用して真空濾過ステップで培地を殺菌します。ニューロングリア細胞培養の場合、 10% 熱不活性化胎児胎児血清 (HI FBS) で NBM 細胞培地を補う.
    2. 以下のサプリメントで最小必須培地イーグル(MEM)培地を調製:炭酸水素ナトリウム2.2 g/L、牛膵臓からのインスリン5mg/L、Dグルコース無水3.4g/L、ペニシリン(12 U/mL)/ストレプトマイシン(12 μg/mL)および10%HI-FBS。均質化し、pHを7.2に調整し、濾過工程で培地を殺菌します。
  2. 材料・設備の準備
    1. 1 mLプラスチックマイクロピペットチップの端子部分を左右に穿刺し、特定の直径の針(Sの場合は0.5 mm、Mは0.6 mm、Lは0.8mm)を使用して、炎を使用して先端の開口部を密封します。
    2. すべてのガラス製品を殺菌します。解剖全体を通して使用される用具(例えば、はさみ、ピンセット、メス)を70%エタノールに浸し続ける。薄層流れチャンバに入る前に、70%エタノールで材料をスプレーします。
    3. 水浴温度を37°Cに設定し、手順を開始する前に、水浴に細胞培養培地を入れます。
      注:免疫細胞化学のアッセイの場合、ポリD-リジンコーティングはカバーリップを含むマルチウェルプレートで行う必要があります。
  3. ラット胚性皮質培養
    1. 15-16日の妊娠を伴う雌のウィスターラットからラット胚を取り除く(交配の終わりは24時間続くはずであり、胚発生の1日目 と考えられる)。そのために、ケタミン(87.5mg/kg)とキシラジン(12mg/kg)でメスを麻酔し、胚を取り除きます。次に、標準的なプロトコルに従って、子宮頸部脱臼によって雌ラットを安楽死させる。
    2. 胚を50 mLの滅菌チューブに入れ、胚を覆うまでリン酸緩衝液生理食塩分(PBS)を加え、すぐに培養室に持ち込みます。
    3. それでも黄身嚢の中に、25mLの冷たいPBSを含むペトリ皿に胚を入れます。はさみとピンセットの助けを借りて、黄身嚢を壊し、胚を取り除き、冷たいPBSも含む別のペトリ皿に移します。ペトリ皿のPBSは、胚全体をカバーするのに十分でなければなりません。
      注意:卵黄嚢を開くときは、胚に損傷を与えないように注意してください。1.3.3と1.3.4では、吸収性紙で覆われたアイスパックの上に置かれた直径90mmのペトリ皿を使用してPBSを低温に保った。
    4. 胚の解剖のために、冷たいPBSの30 mLを含む別のペトリ皿にそれを移す。胚を解剖顕微鏡の下に置き、トゥイーザーを使用して固定化します。最初の切開を皮質と平行にし、眼腔から銃口の端まで行き、動物を切断しないように注意してください。
    5. 皮質の脳組織に損傷を与えないために、ピンセットを使用して慎重に頭皮と髄を取り除きます。皮質を分離するために次の切開を行います。低温殺菌ピペットを用いて、皮質組織をPBSの5 mLを含む15 mLチューブに移します。
    6. 1.2.1で調製した1 mLプラスチックチップを使用して、皮質脳組織の機械的消化を行います。通常のピペットで10回トリチュレートし、チャンクがばらばらになるまで、徐々に小さな穴(L、M、S)のピペットを使用してプロセスを繰り返します。
    7. 機械的消化後、懸濁液を400xgで3分間遠心g分離する。上清を捨て、37°Cで温めた適切な細胞培養培地で沈降液を再懸濁する。
    8. Neubauerチャンバーを用いて細胞懸濁液中に存在する細胞の総数(細胞密度)を決定し、適切な希釈液を作り、細胞をプレートする。初期細胞密度は、以前の研究5に基づいて定義された。
      1. ニューロンを豊富に培養する場合は、初期細胞密度として 0.21 x 106 細胞/cm2 を使用し、HI-FBS を使用せずに NBM 培地内の細胞を維持します。
      2. ニューロングリア培養では、初期細胞密度として0.14 x 106 細胞/cm2 を使用し、10%HI-FBSを添加したNBM培地中の細胞を維持する。
      3. アストロサイトを豊富に含む培養の場合、初期細胞密度として0.26 x 106 細胞/cm2 を使用し、前述のように補充されたMEM内の細胞を維持します。
      4. 細胞を37°C、95%O2、5%CO2に設定した2インキュベーターに2入れる。
        注意:培養期間が長い場合、68 μM ウリジンを含む27 μM 5-fluoro-2′-deoxyuridine などの抗ミトティックを添加して細胞の増殖を抑制する必要があります。

2. コカルチャーシステム

  1. 材料の準備
    1. 150°Cのパラフィンを加熱ブロックで約7分間加熱します。手順が終了するまで150°Cに保ちます。次に、1 mmの直径の無菌ガラスパスツールピペットの助けを借りて、滅菌およびPDLコーティングカバースリップの上に小さな滴を加える。パラフィン球は不規則であるが、直径は約2mmである。球体は、2つの培養物を約1.25mmで分離することができます。
    2. パラフィンは無菌ではないため、パラフィン球体を紫外線の下に15分間置きます。
    3. 共培養を確立するために、15分間70%エタノールに浸漬したトゥイザーを使用してパラフィン球体でカバースリップを移す。
  2. コカルチャー
    1. 2つの培養物を使用する準備ができたら(すなわち、ステップ1.3.8で述べた条件下で培養で7日後)、パラフィン球でカバーリップに播種したニューロンをアストロサイトを含むウェルに移します。
    2. 24 hの培養物が接触する前に、実験の目的に応じて、HI-FBSを添加したNBMにニューロンおよびアストロサイトの培養培地を変更する。
    3. 両方の細胞タイプを接触に置いた後、8-12時間待ってから、異なる刺激および手順を開始する。
      注: 共培養システムの概略図を 図 1に示します。

3. 酸素とブドウ糖の欠乏

  1. 培養培地調製
    1. OGD実験では、ハンクのバランス塩溶液(HBSS)を使用してください。HBSS培地に以下の試薬を用意します: 1.26 mM CaCl2,5.36 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4,0.49 mM MgCl2,139.9 mM NaCl, 4.17 mM NaHCO3,3.38 mM Na2HPO4.pHを均質化し、7.2に調整します。ろ過により培地を殺菌する。
      注:適切な場合は、5.56 mMのグルコースを追加して、グルコース(HBSSglu+)でHBSS溶液を補います。OGDに提出された培養物の場合、HBSS培地をグルコース(HBSSglu-)で補うものではありません。
  2. OGD 手順
    1. 細胞を播種してから7日後、培養培地を取り除き、HBSSglu-で2回洗浄する。洗浄後HBSSglu-細胞培養培地を添加し、低酸素室にマルチウェルを配置する。
    2. 低酸素室を密封し、チャンバー内に存在する酸素を除去するために20 L/minの流れで4分間の95%N2/5%CO2を含むガスミックスを加えます。2この後、フローを停止し、意図する虚血の程度に応じて、37°Cのインキュベーターに低酸素室を4時間または6時間置きます。
    3. OGDの期間後、HBSSglu-培地を残りの手順に適した培養培地に交換する。
      注: OGD 実験は、虚血性イベント中に細胞が被る インビトロ 状態をシミュレートすることを目的としているので、以前に使用したすべてのメディアが除去されることを証明することが重要です。

4. 免疫細胞化学測定

注:免疫細胞化学のアッセイを、前述の5.

  1. 簡単に言えば、異なる皮質培養を特徴付けるために、ウサギの抗GFAP(1:2000)とマウス抗微小管関連タンパク質2(MAP2;1:500)で細胞を4°Cで一晩インキュベートします。次の二次抗体を用いて室温で1時間:抗ウサギはアレクサFluor 546に共役し、抗マウスはアレクサFluor 488に共役し、いずれも1:1000希釈で。
  2. 2 μM Hoechst 33342 で室温で 10 分間インキュベーションして細胞核にラベルを付けます。
  3. 蛍光実装媒体のカバーリップを取り付け、63倍の拡大率で蛍光顕微鏡で画像を取得します。

5. 統計分析

  1. 細胞総数に対するパーセンテージまたは制御の割合としてデータを表現し、三重で行われた少なくとも3回の独立した実験の平均±平均(SEM)の平均標準誤差として提示した。
  2. 非対の学生の t テストを使用して、ソフトウェア(GraphPadソフトウェア社、サンディエゴ、CA)で統計分析を実行します。結果は、p < 0.05 の値の場合に有意であると考えられました。

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結果

培養物を特徴付けるために、GFAPまたはMAP2を発現した細胞の数を評価する免疫細胞化学、アストロサイトおよびニューロンのマーカー(図2)を広く使用し、各タイプの皮質培養で行った。この分析により、アストロサイトを豊富に含む培養物がGFAPを発現する細胞の97%を示す(図2A)。MAP2を発現した細胞の78%のニューロンエンリッチ培養について、GFAPを発現した細胞の4%、および18%の細胞がGFAPとMAP2-陰性の両方であった(図2B)。ニューロングリア皮質培養に関連して、細胞の49%がMAP2陽性、31%がGFAP陽性、20%が両方のマーカーに対して陰性であった(図2C)。

皮質培養を確立してから7日後、ニューロングリア培養およびニューロンエンリッチ培養をOGD処置に行い、4時間または6時間行った。この手順の後、MAP2およびGFAP陽性細胞...

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ディスカッション

ここで説明する方法は、ラット胚性皮質組織からのアストロサイトおよびニューロン分離からなり、ニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物またはニューロングリア培養物の確立を可能にする。これは、皮質ニューロングリアとニューロンエンリッチ胚培養が単離され、2つの培養が特徴付けられるグループ5の以前の研究から適応されました。これらの培養を用いて、Roqueらは、アストロサイトが虚血性損傷に対応する上で重要な役割を果たしていることを発見し、アストロサイトとニューロン間のコミュニケーションが神経保護に不可欠であることを示唆した5。本プロトコルでは、ニューロングリアやニューロンを豊かにした培養物の作製に加え、アストロサイトを豊富に含む培養物を得ることができ、虚血環境が孤立した、あるいは一緒に神経細胞に及ぼす影響を研究することができます。

免疫細胞化学データの分析によると、ニューロンエンリッチ培養中の細胞の18%、ニューロングリア培養における20%がMAP2およびGFAPの両方で陰性であった。これら...

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開示事項

著者らは、利益相反はないと宣言している。

謝辞

著者らは、プロジェクトUIDB/00709/2020、POCI-01-0145-FEDER-029311およびフェローシップSFRH/BD/135936/2018を通じて、ファンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・ア・テクノロジアによる資金援助を認めている。 「プログラム・オペラシオナル・ド・セントロ、セントロ2020」によるプロジェクトCENTRO-01-0145-FEDER-000013、およびプロジェクトPOCI-01-0145-FEDER-022122を通じてバイオイメージングのPPBI-ポルトガルプラットフォームへの資金提供。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
24ウェル培養プレートサーモフィッシャーサイエンティフィ142475
95% N2/5% CO2 ガスシリンダーArLíquido
抗マウスを Alexa Fluor 488に結合 InvitrogenA110011/1000 希釈; インキュベーション期間 - 室温で 1 時間
抗ウサギを Alexa Fluor 546に結合 InvitrogenA110101/1000 希釈; インキュベーション期間 - 室温で 1 時間
B27 サプリメント (50x)Gibco17504-044
Dako Fluorescence Mounting MediumDakoS3023
D-グルコース無水Fisher ScientificG/0450/603.4 g/L
落射蛍光顕微鏡ZeissAxioObserver Z1x63x 対物レンズ
Fetal Bovine Serum (FBS)BiochromS061510%
GentamicinSigma-AldrichG1272120 µg/mL
グルタミン酸Sigma-AldrichG841525µM
グルタミンSigma-AldrichG31260.5 mM
Hoechst 33342InvitrogenH13992 µM;インキュベーション期間 - 室温で10分
低酸素インキュベーションチャンバーStemcell Technologies27310OGD誘導に使用されるチャンバー
ウシ膵臓からのインスリンSigma-AldrichI55005 mg/L
ケタミンSigma-AldrichK-00287.5 mg/Kg
Minimum Essential Medium Eagle mediumSigma-AldrichM026837°Cまで温めます。C 使用前の
Mouse Anti-MAP2Santa Cruz BiotechnologySc-744211/500 希釈; インキュベーション期間 1 晩 4 °C;C
神経基礎中Gibco21103-049ウォームアップ 37 °C;組織
学のためのパラフィントローチSigma-Aldrich1.07164凝固点56-58°C
パラホルムアルデヒドSigma -AldrichP61484% PBS
ペニシリン/ストレプトマイシンバイオクロムA 2213ペニシリン (12U/mL) /ストレプトマイシン (12µg/mL)
Poly-D-lysineSigma-AldrichP1024
Rabbit Anti-GFAPDAKOZ03341/2000 希釈; インキュベーション期間 4 °C;C
炭酸水素ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS/4240/602.2g/L
キシラジンSigma-AldrichX112612 mg/Kg
ックを使用する前のC

参考文献

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