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方法論記事

成人ヒト脳組織からのヒトミクログリアの取得

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DOI:

10.3791/61438

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2020年8月30日

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1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology Jodhpur, 2Department of Neurosurgery, All India Institute of Medical Sciences Jodhpur

この記事について

サマリー

このプロトコルは、生きている、大人、人間の脳組織から原発ミクログリアを単離する効率的で費用対効果が高く、堅牢な方法です。孤立した原発性ヒトミクログリアは、恒常性および疾患における細胞プロセスを研究するためのツールとして役立つ。

要約

ミクログリアは中枢神経系の自然免疫細胞(CNS)に居住している。ミクログリアは、発達中、恒常性維持、感染または傷害の間に重要な役割を果たす。いくつかの独立した研究グループは、ミクログリアが自己免疫疾患、自己炎症性症候群および癌において果たす中心的な役割を強調している。いくつかの神経疾患におけるミクログリアの活性化は、病原性プロセスに直接関与する可能性があります。原発性ミクログリアは、脳内の免疫応答、細胞と細胞の相互作用、疾患における調節不全ミクログリア型を理解するための強力なツールです。一次ミクログリアは、不死化ミクログリア細胞株よりもビボミクログリア特性を模倣する。ヒト成人ミクログリアは、ヒト胎児およびげっ歯類ミクログリアと比較して、異なる特性を示す。このプロトコルは、成人の人間の脳から原発性ミクログリアを分離するための効率的な方法を提供する。これらのミクログリアを研究することは、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよびアストロサイトを含むCNSにおけるミクログリアと他の居住細胞集団との間の細胞細胞相互作用に関する重要な洞察を提供することができる。さらに、異なる人間の脳からのミクログリアは、個別化された医療のためのユニークな免疫応答の特徴付けと無数の治療用途のために培養することができる。

概要

中枢神経系(CNS)は、ニューロンとグリア細胞の複雑なネットワーク1で構成されている。グリア細胞の中でも、ミクログリアはCNS2,3,3の自然免疫細胞として機能する。ミクログリアは健康なCNS4で恒常性を維持する責任があります。ミクログリアはまた、シナプス2を剪定することによって、神経発達において重要な役割を果たす。ミクログリアは、含むが、制限されていないいくつかの神経疾患の病態生理学の中心です。アルツハイマー病5、パーキンソン病6、脳卒中7、多発性硬化症8、外傷性脳損傷9、神経因性疼痛10、脊髄損傷11および神経膠腫などの脳腫瘍12。

CNS恒常性および疾患に関する研究は、コスト効率が良く、時間効率の高いヒト原発性ミクログリア分離プロトコル13の枯渇に起因するげっ歯類ミクログリアを利用する。げっ歯類ミクログリアは、イバ-1、PU.1、DAP12およびM-CSF受容体などの遺伝子の発現において原発性ヒトミクログリアに類似しており、疾患を有する脳13と同様に正常な理解に有効であった。興味深いことに、TLR4、MHC II、Siglec-11およびSiglec-3などのいくつかの免疫関連遺伝子の発現は、ヒトおよびげっ歯類ミクログリア13との間で変化する。いくつかの遺伝子の発現は、両方の種14,15,15の経時的発現および神経変性疾患においても変化する。これらの有意な違いは、ヒトミクログリアを恒常性および疾患におけるミクログリア機能を研究するために不可欠なモデルにする。原発性ヒトミクログリアはまた、潜在的な薬物候補16の前臨床スクリーニングのための効果的なツールであり得る。上記の理由は、一次ヒトミクログリアの分離のための費用対効果の高いプロトコルの必要性の高まりを強調しています。

我々は、腫瘍切除または他の外科的切除のために作成された外科的窓の結果として収集された成人ヒト脳組織から原発ヒトミクログリアを単離するためのプロトコルを開発した。この方法は既存の方法とは大きく異なります。組織採取部位から約75分後にミクログリアを単離培養し、実験室で隔離プロトコルを開始することができた。我々は、単離ミクログリアの増殖を促進するためにL929線維芽細胞の上清を使用している。この方法は、特に、一次ミクログリアのみの培養と開発に焦点を当てています。得られた培養物は約80%ミクログリアである。他のプロトコルは、密度勾配遠心分離、フローサイトメトリーおよび磁気ビーズによってミクログリアの豊かな培養を提供する一方で、プロトコルは、一次ヒトミクログリア17、18、19、2018,19,を培養するための迅速でシンプルで堅牢で費用対効果の高い方法である。1720死体から固定された脳組織の代わりに外科的に除去された生きた成人の脳組織を利用する能力は、既存の手順18,21とは対照的に、21この方法の付加的な利点を証明する。

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プロトコル

すべての組織は、インド工科大学ジョードプルと全インド医科学研究所(AIIMS)ジョードプルの研究所倫理委員会からの倫理的クリアランスの後に取得されました。

1.組織の獲得と処理(0日目)

  1. 10 mLの氷冷人工脳脊髄液(aCSF)を含む50 mLチューブに組織を収集する(2 mM CaCl2∙2H2O、10 mMグルコース、3 mM KCl、26 mM NaHCO 3、2.5 mM NaH2PO4、1mM MgCl2∙6H2O、202 mmmscesce)320組織を別の場所に移す必要がある場合は、チューブが氷の上に保たれていることを確認してください。
    注:オートクレーブ蒸留水でaCSFを準備してください。ラミナーフードの0.22 μmシリンジフィルターでフィルターします。4°Cで1ヶ月間保存できます。
  2. 70%アルコールで回収管を丁寧に拭き取り、無菌層空気流室に移します。
  3. aCSFを慎重に廃棄し、無菌状態で組織を計量します。組織の重量は、その後のステップに必要なトリプシン-EDTAの体積を計算するために不可欠です。
  4. 37°Cで5分間、新鮮な温かいaCSFで組織を保ちます。このステップは細胞死を避けるために重要です。
  5. aCSFを廃棄し、37°Cで1x PBS(リン酸緩衝生理食塩基)でティッシュを1回洗浄します。 すべての血液を(必要に応じて)繰り返しPBS洗浄で洗い流してください。
  6. 組織を温かいPBSで、37°Cで5分間インキュベートする。
  7. PBSを慎重に捨て、殺菌されたペトリ皿に組織を移します。PBSはピペットで除去してもよい。これは、組織の損失を防ぐことができます。
  8. 滅菌メスを使用して、組織を小さな(少なくとも1mm3)片にダイスします。細かくダイシングされた組織は、トリプシン-EDTAがより高い収率を確保することによって組織解離のためのより高い組織表面積を提供する。
  9. 0.25%トリプシン-EDTAの10 mL/g組織を含む50 mLチューブにさいの目に切った組織を移し、10 mL血清ピペットを通してピペットで混合する。トリプシン/EDTAの2 mLをペトリ皿に加え、ピペットの助けを借りてプレートを十分に洗います。このトリプシンをハヤブサチューブに加えます。これはダイシング中の組織および細胞の損失を最小にする。
  10. 250rpmで37°Cで30分間、シェーカーにチューブをインキュベートします。このステップは、組織からの細胞の解離を増加させます.
  11. インキュベーションの終わりに、トリプシンを中和するために中和培地(グルタミンで50%DMEM/50%F12、ペニシリンストレプトマイシン1%、10%FBS)の10 mLを加えます。10 mL血清ピペットと混ぜます。中和媒体の添加量は、使用されるトリプシンの量と等しい必要があります。
  12. 4°Cで2,000xgでチューブを10分間遠心分離します。
  13. 上清を捨てて、培養培地(グルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシン、20%L929上清、10%FBS)を用いて1mLの培養液(50%DMEM/50%F12)でペレットを再懸濁する。
    注:L929細胞は、DMEM(グルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシン、10%FBS)の培養です。ATCC推奨培養法は、細胞培養に従うべきである。上清は、少なくとも75%コンフルエントである培養フラスコから収集されなければならない。それは一括で収集し、成長因子の分解を防ぐために-80 °Cで保存することができます。L929上清をストック培地に添加するのではなく、フラスコに別途添加することをお勧めします。
  14. 接着性細胞に適したT-25フラスコに細胞をプレートし、4 mLの培養培地を追加します。フラスコを37°Cで5%CO2でインキュ2ベートします。慎重にフラスコを振って組織を均一に分散させる。これは汚染の可能性を高める可能性があるため、揺れながら、フラスコの首にメディアを持ち込まないようにしてください。

2.細胞培養(2日目)

  1. 各チューブに等量の培地を集めることにより、0日目に製造したT-25培養フラスコを3本の1.5mL遠心管に回収します。フラスコを1回PBSで洗います。フラスコを軽く振って残った組織の断片を取り除きます。残骸は培養に悪影響を及ぼさないため、フラスコの過酷な揺れを避けてください。フラスコに5mLの新鮮な培養培地を加えます。
  2. 4°Cで1,466xg(4000rpm)で4分間、回収した培地を遠心分離する。
  3. 各チューブから上清を捨て、1mLの培養液をチューブの1つに加えます。ピペットとよく混ぜます。他のチューブに細胞と混合メディアを連続して追加します。ピペットと十分に混ぜ、1つのチューブに細胞をプールします。
  4. 接着細胞に適した別のT-25フラスコに細胞をプレートします。4 mLの培養培地を加え、5%CO2で37°Cでフラスコ2をインキュベートする。

3.細胞培養(4日目)

  1. 両方のフラスコから培地を捨て、新鮮な5mLの培養培地をフラスコに加えます。
  2. フラスコを37°Cで5%CO2で2日間2インキュベートします。

4. 細胞培養(6日目)

  1. 細胞はさらなる実験の準備ができています。

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結果

上記のプロトコル(図1)を用いることで、生きた外科的に切除された脳組織から原発ヒトミクログリアを分離することができた。培養細胞は、ミクログリア(緑色)のリシヌスコミュニス凝集剤-1(RCA-1)レクチン(緑色)と、前述の22、23、24、25、26,23,24,25,26のようにアストロサイトのグリア性フィブリラリー酸性タンパク質(図2)を用いて染色した。4',6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を使用して、核(青)を染色した。実験開始から6日目に、細胞はさらなる実験の準備ができていた。染色された細胞は、...

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ディスカッション

ミクログリアは、正常な脳における恒常性を確保し、様々な神経疾患の病態生理学において中心的な役割を果たす4.ミクログリアは、シナプス2の神経発達と形成の中心である。ミクログリア研究は、多様な神経疾患の発症と進行を理解する上で極めて重要であることが証明されている 4.げっ歯類ミクログリアは、一次ミクログリア研究のための選択の一般的なモデルですが、しかし、げっ歯類ミクログリアは重要な側面で一次ヒトミクログリアとは異なります13.一次ヒトミクログリアを分離するための費用対効果の高い、高収量のプロトコルの開発は、このギャップを埋めるのに役立つ可能性があります。我々は、生きている、外科的に切除された、成人、人間の脳組織から原発性ヒトミクログリアを単離するためのプロトコルを開発した。7日目 に確認した約80%のミクログリア純度を達成することができました。

プロトコルの最も重要なステップ...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

SJの研究所は、IITJの機関補助金を受けて設立され、バイオテクノロジー省(BT/PR12831/MED/30/10/1089/2015)とインド電子情報技術省(No.4(16)/2019-ITEA)からの助成金を受けています。ヒトの脳組織切片は、全インド医科学研究所(AIIMS)ジョードプルから制度倫理委員会のクリアランスの後に得られた。デザイン・アンド・アーツ・ソサエティIIT JodhpurのB.Tech学生メンバーであるMayank Rathorに、ビデオ撮影のサポートに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗生物質-抗真菌剤溶液HimediaA002
カルシウムSigma223506
遠心分離機(4°C;C)シグマ146532
遠心分離管腹部P10203
CO2インキュベーターニューブランスウィックギャラクシー170 S
D-グルコースHimedia GRM077
グルタミン入りDMEM培地HimediaAL007S
ウシ胎児血清HimediaRM9955
フラコンチューブ(50 ml)Thermo Fsiher Scientific 50CD1058
フルオレセイン Ricinus communis 凝集素-1ベクターFL-1081
蛍光顕微鏡ライカDM2000LED
フルオロシールド DAPIシグマF6057
GFAP抗体GA53670S
インキュベーター シェーカーニューブランスウィック サイエンティフィックイノーバ 42
L929ATCCNCTCクローン929細胞株 [L細胞、L-929、L株の誘導体] (ATCC CCL-1)
層流Thermo Fsiher Scientific 1386
マグネシウムHimediaMB040
ナトリウムメルク
栄養混合物F-12ハム培地HimediaAl106S
シャーデュラングループ237554805
リン酸塩緩衝生理食塩水HimediaML023
カリウムHimediaMB043
血清ピペット実験器具LW-SP1010
重炭酸ナトリウムHimediaMB045
ショ糖HimediaMB025
シリンジフィルター (0.2μ;、直径 25 mm)AxivaSFPV25R
T-25 接着細胞培養に適したフラスコ。HimediaTCG4-20X10NO
トリプシン-EDTA (0.25%)Gibco 〒25200-056
塩化塩化リン酸567545レ塩化

参考文献

  1. Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  2. Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
  3. Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
  4. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  5. Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
  6. Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16(2019).
  7. Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
  8. Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
  9. Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).
  10. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
  11. Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518(2019).
  12. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  13. Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
  14. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  15. Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  16. Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44(2018).
  17. Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
  18. Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16(2017).
  19. Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371(2016).
  20. Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
  21. Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
  22. Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811(2010).
  23. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  24. Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
  25. Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427(2002).
  26. Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
  27. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).
  28. Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
  29. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).

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