マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

サマリー

吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。

要約

マウス胚性幹細胞を神経系統に分化し、次に分化した細胞を特徴付ける一連のアッセイを行うステップバイステップの手順について述べています。E14マウス胚性幹細胞を使用して吊り下げドロップ法を介して胚体を形成し、次にレチノイン酸によって神経前駆細胞に分化し、最終的にニューロンに分化した。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)および免疫蛍光実験により、神経前駆物質およびニューロンが、8日目と12日目の分化後に対応するマーカー(神経前駆物質用のネチンとニューロンの神経フィラメント)をそれぞれ示すことが明らかになった。 Sox1 プロモーター主導のGFPレポーターを発現するE14ラインでのフローサイトメトリー実験は、8日目の細胞の約60%がGFP陽性であることを示し、この段階で神経前駆細胞の分化が成功したことを示した。最後に、RNA-seq分析を使用して、世界的な転写変化をプロファイリングしました。これらの方法は、神経細胞の分化中の細胞の同一性遷移を調節する際の特定の遺伝子および経路の関与を分析するのに有用である。

概要

開発中マウス胚盤胞^1,2の内細胞塊からの初の導出以来、マウス胚性幹細胞(mESC)は幹細胞自己再生と分化を研究する強力なツールとして用いられてきた^3。さらに、mESC分化を研究することは、神経変性疾患などの疾患の治療における幹細胞ベース療法における効率と安全性を向上させる可能性のある分子機構の多大な理解につながる^4。動物モデルと比較して、このin vitroシステムは、実際と評価におけるシンプルさ、動物とは対照的に細胞株を維持する際の低コスト、および遺伝子操作における相対的な容易さなど、多くの利点を提供する。しかし、分化された細胞タイプの効率と品質は、多くの場合、mESCの異なるラインと分化方法^5、6の影響を受けます。また、分化効率を評価する従来のアッセイは、堅牢性に欠ける選択されたマーカー遺伝子の定性的検査に依存しているため、遺伝子発現の世界的な変化を把握することができません。

ここでは、神経分化の系統的評価にアッセイの電池を使用することを目指しています。選択したマーカーとRNA-seqに対する従来のインビトロ分析を用いて、分化効率とこのプロセス中の転写変化を測定するためのプラットフォームを確立します。既に確立されたプロトコル⁷に基づいて、吊り下げ低下技術を通じて胚体(EB)を生成し、続いて上端菌量のレチノイン酸(RA)を用いて神経前駆細胞(NPC)を生成し、その後神経誘導培地でニューロンに分化した。分化の効率を調べるために、従来のRT-qPCRおよび免疫蛍光(IF)アッセイに加えて、RNA-seqおよびフローサイトメトリーを実施した。これらの分析は、ステージ固有の分化の進行を包括的に測定します。

プロトコル

1. mESC文化

1. 10 cmの組織培養処理プレートに0.1%のゼラチンをコーティングし、ゼラチンを少なくとも15〜30分間セットしてから吸い出します。
2. 種子γ照射マウス胚性線維芽細胞(MEF)は、予め温めたmESC培地(Dulbeccoの改変イーグル培地(DMEM)に15%の胎児ウシ血清(FBS)、非必須アミノ酸を含むMESCを培養する前日に、 β-メルカプトエタノール、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、LIF、PD0325901(PD)、およびChir99021(CH))
3. e14細胞を培養する前に、γ照射されたMEFをプレート表面に沈着させます。
4. 37 °Cの水浴でE14 ESCを解凍し、すぐに暖かいmESC媒体と15 cmの円錐形の管の細胞を移す。細胞を200xgで3分間ペレットし、上清を取り除きます。
5. 細胞をmESC培地の10mLに再懸濁し、先に播種したγ照射されたMEFを含む培養プレート上の細胞をプレートに入れた。5%CO2未満の37°Cインキュベーターで細胞培養をインキュベートする。
6. 培養パスケージングの場合、培地を吸引し、滅菌1xPBSでプレートを洗浄する。プレート表面を覆うのに十分な0.05%のトリプシンを加え、37°Cで3分間インキュベートします。
7. mESC培地とピペットでトリプシンを中和し、単一細胞懸濁液を生成します。細胞を200xgで3分間遠心し、上清を取り除きます。
8. 血球計または細胞カウンターで細胞を数え、10cm培養プレートに約5.0 x^105個 の細胞を播種します。
9. 細胞をmESC培地の10mLに再懸濁し、先に述べたようにゼラチンコーティングされた組織培養プレート上の細胞をプレートし、培養をインキュベートする。
   注: 細胞がコロニー内で分化するのを防ぐために、mESC を 2 日ごとに通過させることが推奨されます。フェノール赤は、pHインジケーターとしてのみ機能し、細胞密度に応じて、2日よりも早く黄色(より酸性)に変えることができます。したがって、毎日培地を変更する必要があるかもしれません。γ照射されたMEFは、いくつかの通路の後に最終的に死ぬでしょう。

2. EB、NPC、およびニューロンの分化

1. 前述のカルチャパスパサイジング プロトコルを実行し、セルをカウントします (手順 1.7 ~ 1.10)。
2. ぶら下げ方法 (日 0)
   1. 10cmの細胞培養プレートの場合、5.0 x 102細胞が20μL分化培地(15%FBS、非必須アミノ酸、βメルカプトエタノール、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピロビン酸を含むDMEM)に懸濁する約^2.5 x 10⁴細胞を数えます。細胞を含む約502μLの液滴は、10cmのプレートにメッキすることができる。
   2. 適切な数の細胞をアリコートし、次いで細胞を200xgで3分間遠心し、上清を除去する。
   3. 細胞密度5.0 x 10^2細胞 /20μL(例えば、分化培地1mLの2.5 x^104細胞 )の適切な分化培地の細胞を再懸濁する。
   4. マイクロピペットまたはリピータピペットを使用して、細胞懸濁液の20μL液滴を組織培養プレートの蓋上に置く。液滴が互いに近すぎないようにして、液滴がマージされないようにします。
      注:液滴は、プレート自体ではなく蓋の上に置かれるので、組織培養処理された取り付けプレートまたはサスペンションプレートのいずれかにメッキすることができます。より実現可能で無菌のアプローチのために、液滴を付着組織培養プレートにプレートし、以下に説明するように懸濁液プレートに移します。
   5. 1x PBSの5~10 mLでプレートを満たし、蓋を慎重にプレートに戻します。培養液を37°Cインキュベーターで培養します。
      注:PBSは、液滴が乾燥するのを防ぐために培養プレートに添加されます。
3. 2日目には、マイクロピペットを使用して蓋から液滴を回収し、10mLの分化培地で満たされた10cmの細胞培養懸濁液板に入れます。インキュベーターで低速で揺れる軌道シェーカー上の培養物をインキュベートします。
4. 4日目に、EBを収穫し、細胞を採取し、200xgで3分間遠心分離し、上清を取り除く。
   注: その後の実験の要件に従って、1x PBS で EJB を洗浄することもできます。
5. 処置を継続し、EB分化を神経前駆細胞(NPC)に誘導し、5μMレチノイン酸(RA)で分化培地を調製する。
6. 100 x g で 3 分間のエブをペレットにして古い培地を取り除くか、古い培地を吸い出す前に EB が沈着するようにします。培養プレートに5μM RAを含む分化培地10mLを加えます。
7. 6日目に、プレートを傾けて上記のように培地をピペットアウトして、培地の少なくとも半分を5μM RAを含む新鮮な培地に置き換えます。
   注:5日目と7日目には、少なくとも半分の媒体を新鮮なRA含有培地に置き換えるのが推奨されます。フェノール赤いインジケータのメモを取る;黄色がかった場合は、すべての媒体を置き換えるのが最善です。
8. 8日目に、細胞を採取し、200xgで3分間遠心し、上清を取り除いてNPCを収穫する。
   注:NPCは、その後の実験のニーズに応じて1倍のPBSで洗浄することもできます。必要に応じて、NPCを凍結して再び解凍して、後で培養および分析することができます。NPCを培養する場合、アキュタスはトリプシンの代替として使用することもできます。
9. 手順を継続し、NPCをニューロンに分化するには、遠心分離によって15 mLの円錐管にNPCを収集し、トリプシンで解体し、37°Cで3分間インキュベートします。ピペットNPCは、すべてのNPC凝集体が解別され、トリプシンを培地で中和することを確実にする。
10. 40 μmナイロン細胞ストレーナーで細胞をフィルターし、N2培地(DMEM/F12培地+ 3 mg/mLグルコース + 3 mg/mL 脂質豊富なウシ)の密度1.5 x 10⁵/cm² でめっきする前に細胞を数える 血清アルブミン(LBSA)+1:100 N2サプリメント+ 10 ng/mL bFGF + 50 U/mLペン/ストレップ + 1 mM L-グルタミン) その後のPCRおよびウェスタンブロット実験のための組織培養処理プレート;または免疫蛍光実験のための組織培養室で。
11. 9日目に、古い媒体を新鮮なN2培地に交換します。
12. 10日目にN2培地をN2/B27培地(50%DMEM/F12および50%ニューラル基底、3mg/mL LBA、1:200 N2サプリメント、1:100 B27サプリメント、50 U/mLペン/ストレップ、1mM L-グルタミン)に切り替えます。
13. 11日から12日に、次のようにニューロンを収穫します。細胞を1x PBSで洗浄し、トリプシンを加え、37°Cインキュベーターで3分間培養してから、トリプシンを培地で中和し、遠心分離機を200xgで3分間培養します。

3. mESCと分化セルの特性

1. アルカリホスファターゼ(AP)アッセイ
   1. キットを使用してアルカリホスファターゼの活動を評価します( 材料表を参照)。
   2. 培養プレートから培地を取り出し、1x PBSでESCを洗います。
   3. キットに付属の1mLの固定溶液(ホルムアルデヒドとメタノール)をプレートに加え、室温で2〜5分間インキュベートします。
      注: 修正ソリューションの過剰インキュベーションは AP アクティビティを危険にさらす可能性があります。
   4. 修正液を取り出し、1x PBSでESCを洗い、プレートにいくらかの量のPBSを残します。
      注: AP アクティビティを損なわないよう、PBS で ESC を湿らせておいてください。
   5. A、B、Cの基板溶液を1:1:1比で混合してAPソリューションを準備します。最初にAとB溶液を混合し、C溶液を添加する前に2分間室温で混合物をインキュベートします。
   6. 1x PBS を取り外し、先ほど用意した AP ソリューションを追加します。
   7. 培養プレートをアルミ箔で包むか、暗い部屋でステップ3.5を行って、暗闇の中で約15分間ESCをインキュベートします。
   8. 反応を監視し、溶液が明るくなったときに反応液を除去し、非特異的な染色を避けます。
   9. 1x PBSでESCを2回洗います。
   10. ESCを1x PBSまたは取り付け媒体で覆うことで、サンプルの乾燥を防ぎます。
       注: AP 表現には赤または紫の染色が表示されます。プレートは4°Cの冷蔵庫に収納できます。
2. RT-qPCR
   1. ESC と EB および NPC の手順 1.6 ~ 1.7 と 2.4 に従って、さまざまな段階でセルを収集します。
   2. RNA、DNA、およびタンパク質抽出溶液を使用してRNAを分離します( 材料表を参照)。
   3. 逆転写キットを使用して cDNA を生成し( 資料表を参照)、製造元のマニュアルに従います。
3. 固定と埋め込み
   1. 上記のようにEBとNPCを収穫し(ステップ2.6)、室温で30分間1xPBSで4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液で固定します。
   2. PFAを取り出し、サンプルを1x PBSで5分間洗います。
   3. サンプルを1x PBS、10%、20%、および30%スクロース溶液を25\u201228 °Cで連続希釈し、30分のインキュベーション後にサンプルを次の溶液に移します。
      注:サンプルは、埋め込みステップを続行する前に、4 °Cで30%スクロース溶液に保存することができます。
   4. サンプルを(積み重ねずに)凍結鋳型の中心に置く前に、スクロース溶液でピペットチップを濡らし、余分な液体をピペットアウトします。
      メモ: フィルター ペーパーを使用して、余分なソリューションを削除することもできます。チップチップをスクロース溶液で濡らすと、先端の壁にEBやNPCが付着するのを防ぐことができます。
   5. サンプルを再中断することなく、最適な切削温度(OCT)溶液を慎重に金型に追加し、ピペットで余分な気泡を除去します。
   6. サンプルを用いてラボのミキサーに低速で金型を置き、サンプルを軽く攪拌して15分間温かく攪拌します。これは、OCT ソリューションで再中断された場合に、EB と NPC を最下位に解決するのに役立ちます。
   7. 液体窒素またはドライアイスに金型を入れることで、サンプルを素早く凍結します。
      メモ:サンプルは、次のステップに進む前に-70°Cの冷凍庫に保管することができます。
4. 凍結切断
   1. クライオスタットを -20 ~ -18 °C に冷却してから、サンプルを器具に移します。
   2. 凍結したOCTブロックを金型から取り外し、ホルダーの表面に少しOCT溶液を置いてホルダーに固定します。
   3. 切り離し中にサンプルが失われないように、EB と NPC がブレードに最も近いように OCT ブロックを位置合わせします。
   4. 慎重にブロックの10 μmをセクションし、サンプルを含むスライスに細心の注意を払います。
   5. サンプルを含むOCTスライスを組織埋め込みガラススライドに素早く置き、OCTスライスを室温で1時間空気乾燥させます。
      メモ:サンプルは、後で使用するために-70°Cで保存することができます。
5. 免疫蛍光(IF)
   1. OCTセクションまたは培養チャンバーは、ニューロンを10%正常ロバ血清/0.1%トリトンX-100で1x PBSで1時間室温で1時間ブロックします。
   2. サンプルを5%正常ロバ血清/0.05%トリトンX-100で希釈した一次抗体で、4°Cで一晩1x PBSでインキュベートする。
   3. 1回の洗浄でサンプルを1x PBS/0.1%トリトンX-100で洗浄します。
   4. サンプルを5%正常ロバ血清/0.05%トリトンX-100で1時間室温で1時間希釈した二次抗体でインキュベートします。
   5. 1x PBS/0.1% トリトンX-100でサンプルを洗浄し、各洗浄を5分間洗浄し、1 μg/mL DAPIでサンプルをインキュベートします。
   6. カバースリップといくつかの取り付け媒体でサンプルを取り付け、乾燥させます。
   7. 蛍光顕微鏡でサンプルを観察します。
6. RNA-セクの分析
   1. 様々な段階で細胞を収集し、RNA抽出を行う(ステップ3.2参照)。
   2. cDNAライブラリを準備し、Wangら⁸に記載されているプロトコルに従って深いシーケンシングとデータ分析を行う。
   3. R パッケージ、クラスタープロファイルを使用して遺伝子オントロジー (GO) 分析を実行します。
7. フローサイトメトリー
   1. 手順 1.6 ~ 1.7 に従って ESC を収集し、セルを培地で再中断します。手順 2.4 に従って、EB と NPC を収集し、セルをメディアで再中断します。
   2. 40 μm ナイロンセルストレーナーを使用して、新しい 15 mL 円錐チューブにセルサスペンションをフィルターします。
   3. フローサイトメーター(施設のコア施設によって実行される)を使用してサンプルのGFP信号を測定します。

結果

この方法の表現として、E14細胞に対してEB、NPC、およびニューロン分化実験を行いました。E14細胞は、γ照射されたMEF集団が希釈されるまでγ照射MEF(図1A)で培養した。E14細胞の多能性を確認した結果、ナノグおよびOct4マーカーに対してアルカリホスファターゼ(AP)染色(図1B)および後述のRT-qPCR(下記参照)を行うことで、E14細胞の多能性を確認した。 γ照射されたMEFフリーE14細胞を、図2Aに示すプロトコルを用いて分化のために誘導した。簡単に言えば、500個の細胞を含む20μLの分化培地液滴を培養板の蓋に播種した(詳細はプロトコルセクション2参照)。その後、形成されたEJBを回収し、新鮮な分化媒体に懸濁液に入れた。分化の4日目から8日目にかけて、5μM RAを培養プレートに加え、NPCを誘導し、分化されたEBsは円形形状を示し、そのサイズは分化中も増加し続けた(

ディスカッション

マウス胚性幹細胞の神経分化の方法は何十年も確立されており、研究者は以前のプロトコルを変更したり^、様々な目的のために新しいプロトコルを作成し続けています^7,10,11.一連のアッセイを用いて、マウスやヒトESCの他の系統分化の解析に用いることができるニューロンへのmESCの分化段階の効率と進捗状況を総合的に分析しました。さらに、我々のアプローチは、vitro 8における神経分化に対する特定の遺伝子または経路の影響を評価するのに有用なツールであることが証明^された。

我々の方法により、多能性非コミットESCは、レチノイン酸(RA)で処理され、高効率で神経系統にコミットし、ニューロン⁷をさらに生成するように誘導される。ES細胞の神経細胞への分化を改善し、異質性を低下させるためには、ES細胞を未分化状態

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05% トリプシン + 0.53mM EDTA 1X	コーニング	25-052-CV
0.1% ゼラチン	Sigma	G1890-100G	脱イオン水で調製
16% パラホルムアルデヒド	Thermo Scientific	28908	1X PBS
40-μm cell strainer	Falcon	352340
Albumax	Thermo Fisher Scientific	11020021
AlexaFluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L)	Invitrogen	A11001	抗体を 1:500 で希釈しました IF
アルカリホスファターゼ染色キット II	Stemgent	00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox	Azura Genomics	AZ-2105
B27	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504044
BD FACSCanto	BD	657338
bFGF	Sigma	11123149001
BioAnalyzer 高感度DNAキット	Agilent	5067-4626
Chir99021	ケイマンケミカルズ	13122
クロロホルム	C298-500	フィッシャー化学
DAPI	Invitrogen	R37606
DMEM	Corning	10-017-CM
DMEM/F12 培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11320033
EB バッファー	Qiagen	19086
エタノール	111000200	Pharmco	脱イオン水で希釈
ウシ胎児血清	アトランタBiologicals	S10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
HiSeq 2500 シーケンシングシステム	Illumina	SY-401-2501
Isopropanol	BDH1133-4LG	BDH VWR 分析	脱イオン水で希釈
L-グルタミン	Thermo Fisher Scientific	25030024
LIF	N/A	N/A	MEF上清から採取
m18srRNAプライマー	IDTDNA	N/A	5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM
非必須アミノ酸	コーニング	25-025-Cl
mNanogプライマー	IDTDNA	N/A	5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGTGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes プライマー	IDTDNA	N/A	5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'mNeuroD1
プライマー	IDTDNA	N/A	5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4
プライマー	IDTDNA	N/A	5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6
プライマー	IDTDNA	N/A	5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2
supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin 一次抗体	Millipore	MAB5326	用に 1:200 で希釈しました
ニューロフィラメント 一次抗体	DSHB	2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit	BioO Scientific	NOVA-5138-07
	PD0325901 Cayman Chemicals	13034
ペニシリン/ストレプトマイシン	Corning	30-002-Cl
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	N/A	N/A	脱イオン水で調製-
塩化カリウム	P217-500G	VWR
-リン酸カリウム一塩基性無水物	0781-500G	VWR
-塩化ナトリウム	BP358-10	フィッシャーバイオ試薬
-リン酸ナトリウム、二塩基性、七水和物	SX0715-1	ミリポア
ランダムヘキサマープライマー	サーモサイエンティフィック	DMSO
レチノイン酸	Σ	R2625
			1X PBS
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064022
Tissue-Tek O.C.T. 化合物	Sakura	4583
TriPure単離試薬	Sigma-Aldrich	11667165001
TruSeq Rapid	Illumina	20020616
&β;-メルカプトエタノール	フィッシャーバイオ試薬	BP176-100