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方法論記事

新生児腸管の発達に及ぼす急性絨毛膜炎の影響を研究する母体炎症への胎児暴露のマウスモデル

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DOI:

10.3791/61464

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2020年6月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatology, Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa, 2Division of Maternal Fetal Medicine, Department of Obstetrics & Gynecology, University of Iowa, 3Division of Neonatology, Department of Pediatrics, Vanderbilt University, 4Department of Microbiology & Immunology, University of Iowa

この記事について

サマリー

生きた生物の合併症を伴わない胎児の母体炎症(FEMI)をシミュレートする絨毛膜炎のモデルを開発し、子孫の腸管の発達に及ぼすFEMIの影響を調べた。これは、絨毛膜炎後の腸の損傷の発症のための機械化原因の研究を可能にする。

要約

絨毛膜炎は早産の一般的な沈殿物であり、壊死性腸炎(NEC)を含む多くの未熟児の罹患率に関連している。しかし、これら2つの条件間の機械的なリンクはまだ発見されていない。我々は、リポ多糖(LPS)誘発胎児の母体炎症(FEMI)を含む絨毛膜炎のマウスモデルを採用した。FEMIのこのモデルは、生殖不能、胎盤、および胎児の炎症性カスケードを誘発し、臨床絨毛膜炎の多くの症例にも存在する。生きた細菌を利用し、より正確に絨毛膜炎をもたらす上昇感染の病態生理を模倣するモデルが存在するが、これらの方法は、未熟な腸管および関連する開発マイクロバイオームの発達に間接的な影響を及ぼす可能性がある。このプロトコルを用いて、LPS誘導FEMIが妊娠喪失および早産の用量依存的増加、ならびに子孫における正常な腸の発達の中断をもたらすことを実証した。さらに、FEMIは子孫の腸損傷および血清サイトカインを有意に増加させる一方で、腸の炎症に対する先天性免疫の第1行を提供するゴブレットおよびパネス細胞を減少させることが実証された。LPS誘導FEMIの同様のモデルは、絨毛膜炎とその後の中枢神経系の異常との関連をモデル化するために使用されてきたが、このプロトコルは、絨毛膜炎と後の腸内発達の間の機械化リンクを発育する最初の試みである。

概要

絨毛膜は哺乳類の妊娠に不可欠な役割を果たす。これらは、複数の機能を提供する絨毛と羊膜が含まれています。それらは胎児を取り囲んで保護し、母体と胎児の区画1間のパラクリンシグナル伝達を促進し、そして分化の開始に関与し得る絨毛膜内に局所的なフィードバックループを作り出す。膜の現在の理解は、羊膜が構造的なバリア機能を提供することを示し、そして絨毛膜は、主に母親の免疫系2から発達中の胎児を保護するために免疫学的緩衝液を提供する。これらの膜の炎症は、絨毛膜炎として知られています。歴史的に、臨床絨毛膜炎の診断は、母体熱に加えて1つ以上の胎児または母親の臨床所見3,4の存在に続いて行われた。しかし、この定義は臨床的に有用であるが、その精度の欠如は、絨毛膜炎の研究を困難にしている。2015年、診断を明らかにしようとして、ユーニス・ケネディ・シュリバー国立小児保健人間開発研究所による専門家パネルワークショップは、子宮内炎症、または感染症、またはその両方(トリプルI)3として絨毛膜炎を定義した。微生物誘発感染は子宮/羊膜炎症の重要な原因であるが、滅菌子宮/羊膜炎症5、6、7よりも一般的に起こらないので、この明確化は重要である。全体として、絨毛膜炎は、定期出産の2\u20124%および早産期期の25\u201230%8,9に見られるように、依然として重大な公衆衛生上の問題である。

絨毛膜炎は胎児および新生児に重大な影響を及ぼす可能性がある。絨毛膜炎は、気管支肺異形成10、脳白器損傷11、脳内出血12、前産児13の網膜症、および早期発症新生児敗血症14、15を含む多くの未熟児罹患率のリスクの増加に関連することが文献に十分に文書化されている。未熟腸管の損傷や修復機構に関心を持つため、絨毛膜炎は壊死性腸炎(NEC)15,16の後の発症にも関連していることに注意することが重要である。NECは早産児の壊滅的な胃腸疾患であり、炎症およびその後の腸壊死に対する調節不全宿主応答をもたらす。毎年、NECは米国で4000人以上の乳児に影響を及ぼし、これらの乳児の3分の1までは18の病気で死亡する。NECの病因は、腸の未熟さ、未熟免疫系の調節不変性、腸内炎症、細菌転位19の組み合わせを含み、腸壊死の最終的な共通経路で最高潮に達する可能性が高い。重要なことに、NECの発症は出生後数週間および絨毛膜炎への潜在的な暴露によってしばしば起こり、絨毛膜炎とその後のNECの発症との間の機械論的なつながりを20に不明瞭にする。絨毛膜炎がNECの病態生理学に寄与する可能性のあるメカニズムの1つは、母親の免疫系のアップレギュレーションを通じて、その後、正常な胎児発達パターン21、22、23を破壊する可能性のある強い胎児炎症反応を生じさせる。

絨毛膜炎の複数の哺乳類モデルは、げっ歯類および羊24、25、26、27、28、29、30、31、32に存在する。しかし、絨毛膜炎誘発性胎児の母体炎症(FEMI)への初期の新生児期を超えて腸管の発達に関するデータはほとんど存在しない。FEMIとそれに伴う未熟腸管の損傷の発症との関係を探るため、我々はリポ多糖(LPS)誘導型FEMIモデルを適応させました。リポ多糖は、グラム陰性細菌上の細胞外表面の主要な成分であり、ヒト33を含む複数の真核生物種の自然免疫系の強力な刺激剤である。母体LPS注射は、生きた細菌の交感作用を伴わない無菌炎症カスケードをもたらし、早産34の誘導のための確立されたモデルであり、また、最も重篤な形態の絨毛膜炎24、35である急性絨毛膜炎および胎児炎症反応症候群(FIRS)のモデルである。また、羊モデル36とマウスモデル37、38、39、40の脳白と灰色物質の両方の傷害を誘発することが示されている。しかし、我々の知る限りでは、この絨毛膜炎とFEMIのモデルを使用して、過去の出生時の胃腸管の発達への影響を調べるとともに、絨毛膜炎と後にNEC41,42の発症との間の可能な機械化の関連を調査する。

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プロトコル

すべての動物の手順は、アイオワ大学の制度的動物の世話と使用委員会によって承認されました (プロトコル#8041401).すべての動物は、アイオワ大学でラボ動物ケアの評価と認定協会(AALAC)承認されたビバリウムに収容されました。全てのマウスは野生型株C57Bl/6Jであった。

1. 妊娠中マウスにおけるFEMIの確立

  1. LPSの準備
    1. 大腸菌O55:B5(ストック濃度2mg/mL)に由来するLPSを使用してください。
    2. LPSストック濃度1:100、滅菌生理食塩水を使用して、作業濃度20μg/mLを使用します。
  2. 母体LPS注射
    1. 妊娠日e15で妊娠中のダムを注入します。この時点は、マウスの妊娠を通じて約75%であり、このモデルは、絨毛膜炎による早産の大部分が発生するヒト妊娠の第3学期の初期に発達的に似ています。
    2. 注射の直前に妊娠中のマウスの体重を量り、適切なLPS投与を決定する。
    3. 100 μg/kg の LPS の総投与量の 5 μL x グラム体重 (gbw) を使用して、作業濃度の線量を計算します。コントロール動物の場合は、通常の生理液剤の同等の量を注射に使用します。
    4. 各注射の前に高い15秒間の渦LPS溶液を3回。
    5. LPSのボリュームを1mLのシリンジに引き上げる。
    6. 擦り傷の技術で妊娠中のマウスを拘束します。後回しの不用な位置に保持し、注射を行います.
      1. 30ゲージ8mmの針を、腹部の右下象限(膀胱および腹部の血管を避けるために)上に30\u201240°の角度で挿入します。針の長さを約1/4~1/2に挿入します。
      2. 注射器プランジャーを引き戻し、注入する前に負圧を確保します。負圧が存在する場合は、射出を続行します。
      3. 注射後、マウスを約30分間監視し、残りの妊娠のためにケージに戻します。

2. 子孫の出産とケア、腸の収穫

  1. e20で膣分娩を介して正常に子犬を送達する。
    注:このモデルは 、図1 で見ることができる予想用量依存性胎児の損失率を有し、以下の結果で議論されている。
  2. 子犬が母親と一緒に残り、アドリビタムフィードを受け取ることを許可します。
  3. 収穫日には、通常、出生後14日目(P14)、制度的動物ケアと使用委員会のプロトコルに従って子宮頸部脱臼を介して子犬を安楽死させます。
  4. はさみと鉗子を使用して、腹部の全長に対して、皮膚と腹腹を通して、腹部の正中線を垂直に切開する。胃からセカムに小腸をはさみで切除し、鉗子で腸間腸を取り除きます。
  5. 小腸の遠位1/3(ヒトの回腸を代表するセクション)を分離して保持し、近位小腸、盲腸、結腸を捨てる。
  6. はさみを使用して、回腸部分を半分に分割します。
  7. 後でRNA定量を行うため、RNA安定化液に近位半分を入れる。
  8. スライド準備のために10%中性緩衝ホルマリンに遠位半分を入れます。

3. 腸の損傷スコアリング

  1. パラフィン埋め込まれた組織を5μmの厚いスライスに入れ、ガラススライドに取り付けます。

    注:パラフィンの埋め込み、切り離し、スライドへの取り付けのために、標本をヒストロジーコアに送ります。
  2. 標準的な手順に従ってスライドを分離します。
  3. 標準的な手順に従ってヘマトキシリンおよびエオシンの染色切片。
  4. 前述の42、43のように腸の損傷のための3ポイントスケールでセクションをスコア。
    1. 軽顕微鏡を用いて、2人の別々の盲検研究者による一般化された腸損傷を評価し、villus完全性および基原膜43 からの分離を評価する3ポイントスケールで(補足図1)。腸の損傷は、20倍の倍率および数値開口0.50で最もよく評価される。
    2. 通常の粘膜を表す0のスコアを割り当てます。
    3. 1のスコアを割り当てると、上皮下グルエンハーゲンの空間、空胞化または上皮下持ち上げの発達を包含する軽度の傷害を説明する。
    4. 上皮持ち上げおよび空胞化が絨毛の半分以上、絨毛の歪み、または粘膜潰瘍および層の崩壊によって示される重篤な傷害を記述するために2のスコアを割り当てる。

4. パネス細胞とゴブレット細胞の定量化

  1. 脱パラフィン後、ステップ2.8からの組織切片の染色スライドは、アルシアンブルー/周期酸シフ染色を用いて、前述の44,45のゴブレットおよびパネス細胞の両方を示す。
    注:アルシアンブルー/周期酸シフ染色はパネス細胞またはゴブレット細胞に固有ではありませんが、私たちの経験では、盲目の経験豊富な研究者は、この染色を使用して、細胞標的抗体と比較して同等の細胞定量を有し、バックグラウンド染色が大幅に少ない46.
  2. 脱パラフィン、染色、脱水スライドは以下の通りである。
    1. 10分間、キシレンにスライドを2回沈めます。
      注意:キシレンはヒュームフードに使用する必要があります。
    2. 100%EtOHでリンス。
    3. 3分間100%EtOHでスライドを水没させ、その後90%のEtOHで3分間、次いで3分間70%のEtOHを、最後に3分間50%のEtOHでスライドを水没させます。
    4. 水道水を流して5分間洗います。
      注意:組織サンプルの損失を防ぐために、流水から離れてセクションを向けます。
    5. 標準的なコーヒーフィルターとフィルターアルシアンブルー染色液。
    6. アルシアブルーのステインで15分間滑り、水道水を流して2分間洗います。
    7. 200mLの二重蒸留水で1mgの周期酸を希釈する。このソリューションのスライドを5分間水没させます。その後、水道水を流して1分間洗います。
    8. シフの試薬を10分間染色する。水道水を流して5分間洗います。
    9. スライドをヘマトキシリンで1分間染色し、水道水を流して2分間洗います。
    10. 酸性アルコール(塩酸1mLを99mLで70%EtOHに混合)に1分間沈める。
    11. スコットの水道水(水道水中のNaHCO3 濃度0.1%)に1分間水没し、水道水を流して1分間洗います。
    12. スライドを退避します。
      1. 各スライドを70%のEtOHに10回浸し、その後90%のEtOHで10回、100%EtOHで10回浸します。
      2. 100%EtOHで10分間滑液を沈め、続いてフレッシュキシレンに2回3分間沈水します。
    13. 取り付け培地を試料に一滴置き、その上にカバースリップを置きます。
  3. ゴブレットセルカウント
    1. 光顕微鏡を使用して、ゴブレット細胞をカウントする(補足図2)。腸組織の各部分について、ゴブレット細胞と500の上皮細胞の数を数え、100上皮細胞あたりの比率としてゴブレット細胞比を発現する。ゴブレット細胞は、20倍の倍率と開口数0.5で最もよくカウントされます。
  4. パネス セルの棚卸
    1. 光顕微鏡を使用して、パネス細胞を数える(補足図2)。腸組織の各部分について、腸内窩当たりのパネス細胞の比率として表現する。腸組織の各部分ごとに100腸の納骨堂を数えます。パネスセルは、20x-60倍の倍率と数値絞り0.50-1.30で最もよくカウントされます。

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結果

胚性15日目にFEMIに曝露すると、用量依存性の妊娠喪失と早産率の用量依存率(図1)42に至る。実験では、妊娠の喪失と未熟児(未熟児と子宮内胎児の終焉の間の50%の損失)を最小限に抑えながら、有意な炎症性侮辱にさらすために100μg/kgのLPS用量を使用することを選択しました。

このアプローチを用いて、次に、FEMIが子孫のその後の傷害に及ぼす影響を調べた。3点の組織学的尺度を用いて一般化された腸の損傷を測定し、出生時(P0)および成人期(P56または8週の生後)に重大な傷害を発見した(図2)。この傷害は、FEMI以外の動物に対する追加の刺激がない場合に起こったことに注意することが重要であり、FEMIだけが新生児マウス腸管の正常な恒常性を破壊することを示唆している。マウスは、生後4週間の間に発達し続ける比較的未熟な腸を持って生まれるため、

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ディスカッション

絨毛膜炎は、2\u20124%の期間および25\u201230%の早産8,9に影響を及ぼす。しかしながら、絨毛膜炎の影響は、胎児および新生児10、11、12、13、14、15、16に有意な影響を及ぼすことを示しているので、過去の出生を長く延長することができる。重要なことに、絨毛膜炎は、NEC15,16のその後の発達に関連することが示されている。ま...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所(DK097335&T32AI007260)とアイオワ大学ステッド家族小児科を通じて部分的に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10% 中性緩衝ホルマリンシグマHT501128
アルシアン ブルー染色新参者供給1003A
C57Bl6/J マウスジャクソン研究所664
エタノールデコン ラボ2701
HClシグマH1758
ヘマトキシリン染色ライカ381562
LPSSigmaL2880
NaHCO3SigmaS6014
Nikon Eclipse Ni-U 顕微鏡Nikon2CE-MQVJ-1
過ヨウ素酸ACROSH5106CAS# 10450-59-9
RNAlaterThermofisherAm7021
Schiff 試薬ΣS5133
SecorImager 2400Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex AssayMeso Scale Discovery (MSD)
キシレンシグマ 534056

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