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方法論記事

ヒトナチュラルキラー細胞代謝の解析

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DOI:

10.3791/61466

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2020年6月22日

 ,  , 
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

この記事について

サマリー

本論文では、末梢血から分離されたヒトナチュラルキラー(NK)細胞の解糖とミトコンドリア呼吸を、静止状態またはIL15誘発活性化後に測定する方法について述べた。記載されたプロトコルは、他のサイトカインまたは可溶性刺激によって活性化された初代ヒトNK細胞に容易に拡張することができる。

要約

ナチュラルキラー(NK)細胞は、主に自然な抗腫瘍および抗ウイルス免疫応答を媒介し、生存、細胞増殖、インターフェロンガンマ(IFNγ)および/または細胞毒性プログラムなどのサイトカインの産生を促進するために、様々なサイトカインおよび他の刺激に応答する。サイトカイン刺激によるNK細胞活性化は、その生体エネルギーおよび生合成の要件をサポートするために代謝経路の実質的なリモデリングを必要とする。NK細胞代謝障害は、肥満やがんを含む多くの慢性疾患に関連していることを示唆する大きな証拠があり、NK細胞代謝を決定する方法の利用可能性の臨床的重要性を強調している。ここでは、ヒトNK細胞のエネルギー代謝の変化を監視するツールとして、糖分解とミトコンドリア酸素消費量のリアルタイム測定を可能にする細胞外フラックス分析装置の使用について説明します。ここで説明する方法は、現在、広範囲の臨床試験で調査されているシステムであるIL-15などのサイトカインを用いたNK細胞の刺激後の代謝変化のモニタリングも可能にする。

概要

ナチュラルキラー(NK)細胞は、抗腫瘍および抗ウイルス応答を媒介する生来のリンパ球である。NK細胞は、ヒト末梢血中の全リンパ球の5~15%を含み、脾臓、肝臓、骨髄およびリンパ節にも含まれる。NK細胞は、T細胞受容体(TCR)やB細胞受容体(BCR)などの多形性クロオチピッレセプターを発現しない。対照的に、それらの細胞分解機能の活性化は、標的細胞11,22の表面上の不変リガンドを認識する受容体の関与によって促される。

末梢血から分離されたヒトNK細胞は、ヒト血清を添加した培地で数日間生存することができる。IL-15やIL-2などのサイトカインによるNK細胞の活性化は、細胞を増殖させ、その殺滅能力の増加に駆り立て、他の効果の中でも,3、4、5。,5いくつかの研究は、NK細胞活性化と代謝活性の変化との間に直接的な相関関係を示している6.これらの代謝変化は、エネルギーと生合成の観点から細胞の特定の要件を満たす運命にある。

好気性細胞や生物は、炭水化物、脂肪、タンパク質の異化と酸化を伴う一連の化学反応を通じてエネルギーを得る。解糖、三カルボン酸(TCA)サイクルと酸化リン酸化を組み合わせて、真核生物細胞はATPの需要の大半を満たし、細胞増殖および増殖に不可欠な高分子のビルディングブロックとして必要な中間体を得る。解糖のプロセス(図1A)は、細胞内のグルコースの侵入から始まります。細胞質では、グルコースはリン酸化され、ピルビン酸(グルコース分子あたり2分子のATPの正味生産)に変換され、乳酸に還元したり、ミトコンドリアに輸送してアセチルCoAに変換してTCAサイクルに入ることができます。TCAサイクルは、アセチルCoAのより多くの分子を燃料としてサイクリングを続け、CO2 を生成します(最終的には細胞の外に拡散し、培地中でH2Oと反応することによって、培地の酸性化につながる炭酸を生成します)とNADHは、電子輸送鎖に電子を寄付する分子(ETC)。。電子は異なるタンパク質複合体を通過し、最終的に酸素によって受け入れられます。これらの複合体(I、IIIおよびIV)も、ミトコンドリアマトリックスから膜間空間にH+ をポンプする。生成された電気化学的勾配の結果として、H+ は、ATPの生成に蓄積された潜在的なエネルギーを投資する、複雑なV(ATP-シンターゼ)を介してマトリックスに再び入ります。

解糖とミトコンドリア呼吸の両方は、阻害剤を使用することによって異なる点で遮断することができます。これらの阻害剤の知識と使用法は、細胞外フラックスアッセイの開発の基礎となった。pHや酸素などの2つの単純なパラメータをリアルタイムで測定することにより、細胞外フラックス分析装置は、96ウェルプレートにおける解糖およびミトコンドリア呼吸の速度を推測します。解糖解析ストレス試験は、グルコースを含まない基底培地(図1B)7で行7われる。細胞外酸性化率(ECAR)の最初の測定は、解糖非依存性酸性化を示す。非解糖酸化と呼ばれ、TCAによって産生されるCO2と相関し、前述のように、培地中のH2Oと結合してH+(TCA結合ECAR)を生成する。最初の注射は、グルコースの利用を誘導し、解糖を高めるためにグルコースです。2回目の注射は、両方のロテノーネを組み合わせた、 複合体I阻害剤と、複合体III阻害剤であるアンチマイシンAは、細胞の細胞ATPレベルを維持するために解糖分解を活性化することによって、このミトコンドリアATP産生の劇的な減少に応答するETC.細胞をブロックし、これは基底状態の細胞によって使用されないが、ATP需要の増加に応じて潜在的に採用することができる解糖の量を表す(コンペンサ第3の注射は、グルコースアナログ2-デオキシグルコース(DG)であり、これは、酵素ヘキソキナーゼの基質としてグルコースと競合する。このリン酸化の産物である2-デオキシグルコース-6-リン酸はピルビン酸に変換できないため、解糖が遮断され、ECARが最小限に下がります。この時点で測定されたECARには、解糖または呼吸活性に起因しない他の細胞外酸性化源と、2-DG(ポスト2-DG酸化)によって完全に阻害されない残留解糖が含まれる。

ミトコンドリアストレス試験は、グルコースを有する培地(図1C)8で8行われる。酸素消費率(OCR)の最初の測定は、ミトコンドリア呼吸の基本線(基底呼吸)に対応しています。最初の注射は、ATP合成酵素(複合V)を介して陽子の戻りを阻害するオリゴマイシンであり、ATP合成を遮断し、したがってミトコンドリア膜を急速に過分極し、呼吸複合体を通して更にプロトンのポンピングを防ぎ、OCRの減少をもたらす。ベースライン呼吸とオリゴマイシンの添加によって与えられた値との比較は、ATP結合呼吸を表す。酸素消費量の残りのオリゴマイシン無感率はプロトンリークと呼ばれ、これはアデニンヌクレオチドトランスロケース9のようなミトコンドリア膜内の脂質二重層またはタンパク質を通るプロトンの流れを表す。第二の注射は、アンカプラー2,4-ジニトロフェノール(DNP)、ミトコンドリアマトリックスへのH+の大量の侵入を誘発するイオノフォアであり、ミトコンドリア膜の脱分極化およびミトコンドリアATP合成の破壊につながる。細胞は、膜電位(最大呼吸能力)を回復しようとする無駄な試みにおいて、電子輸送速度と酸素消費量を最大レベルに増加させることによって、プロトン動機力の消滅に反応する。最大呼吸能力と基底呼吸の違いは、細胞の予備呼吸能力であり、これは細胞が基礎状態でATPを生成するために使用しない呼吸量を表すが、ATP需要の増加に応じて、またはストレス8の条件下で潜在的に募集することができる。3回目の注射はロテノーネとアンチマイシンAの組み合わせです。この注射は、ETCとOCRが最も低いレベルに完全に減少し、残りの酸素消費量は非ミトコンドリア(NADPH-オキシダーゼなどによって引き起こされる)になります。

代謝経路の変化は、インビトロでサイトカインを用いたNK細胞の連続的な活性化が、異なる代謝経路10,11の研究によってNK細胞枯渇を引き起こす可能性が示唆されているので、11何らかの形でNK細胞の機能を予測することができた。NK細胞の代謝状態と機能の相関は、がん免疫療法の観点から非常に重要です。この分野では、IL-15の注入を伴うNK細胞の活性化は、単独で、またはモノクローナル治療抗体と組み合わせて、腫瘍細胞死死を改善するために試験されている12、13、14。,1412,これらの治療戦略に応じてNK細胞の代謝状態に関する知識は、NK細胞活性化状態および殺死機能の貴重な予測を提供するであろう。

単球などの他の骨髄系およびリンパ球細胞における代謝経路の研究は、TおよびB細胞が15と記載されており、最適化された方法が16に公表されている。このプロトコルでは、大量の純粋かつ生存可能なNK細胞を生成するNK絶縁プロトコルと、細胞外フラックス分析装置を用いて代謝活性を測定するための最適化されたプロトコルの両方を組み合わせた方法を提供する。ここでは、安静細胞およびIL-15活性化ヒトNK細胞の代謝変化の研究に有効な方法であることを示す。細胞外フラックスアッセイでは、細胞数や薬剤濃度などのパラメータがテストされ、最適化されています。他の呼吸法と比較して、細胞外フラックス分析装置は完全に自動化されており、非常に少量の細胞を同時に、最大92サンプルでリアルタイムでテストすることができ、比較的迅速な方法で(複数のサンプルと反復で)高スループットスクリーニングを可能にする17。

NK細胞代謝を研究することでNK細胞機能を評価する研究者が利用できる。これは、他のサイトカイン、抗体または可溶性刺激によって活性化された細胞にも適用することができる。

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プロトコル

すべての実験は、ヘルシンキの医学研究の倫理原則の宣言に従って行われました。ドナーからの末梢血サンプルは、99-CC-0168 IRB承認プロトコルの下でNIH輸血科から得られ、患者の書面によるインフォームド・コンセントを得た。

1. 試薬の準備

  1. NK細胞の単離用試薬
    注:細胞培養フードでこれらの試薬を準備してください。
    1. NK分離バッファーを準備する: 1 mM EDTA と 2% 胎児子牛血清 (FCS) を使用して、以前に熱不活性化された PBS (pH 7.4) を補います (30 分間 56 °Cで)。
    2. NK培地を準備する:サプリメントアイコーブの修正ダルベックのメディア(IMDM)10%人間血清(HS)。滅菌フィルターおよび2-8 °Cで保管してください。 培地を37°Cに温め、細胞に加えます。
    3. 200 μg/mL で PBS でヒト IL-15 を再中断します。
  2. 細胞外フラックスアッセイ用試薬
    1. アッセイ培地の準備:ミトコンドリアストレス試験培地の場合、1 mMのピルビン酸ナトリウム、2 mM L-グルタミン、10 mMグルコースをベース培地に加えます。解糖分解試験培地の場合は、2 mM L-グルタミンを塩基培地に添加します。
      注:グルコース、ピルビン酸およびグルタミンの濃度は、細胞外フラックス分析装置メーカーが推奨するとおりに提供されます。しかし、必要に応じて、研究者が培地の組成を完全に一致させるためにメディア構成を変更することができます。
    2. ベンチトップpHメーターを使用して0.1 N NaOHで両方のメディアのpHを7.4に調整し、0.2 μMの細孔サイズを通して無菌フィルターを2〜8°Cで保存します。 37°Cにウォームメディア、pHをチェックし、必要に応じて使用前に7.4に再取り付け。
      注:アンビエントCO2 のみが細胞外フラックス分析装置の雰囲気中に含まれ、重炭酸塩のない培地の使用が重要です。
    3. 試薬のストックソリューションを準備する:オリゴマイシン(ATPシンターゼ阻害剤)、DMSO中の10 mMストック溶液;2,4-ジニトロフェノール(DNP、アンカプラー)、1 Mストック溶液 DMSO;抗マイシンA(複合体III阻害剤)、DMSO中の10 mMストック溶液;ロテノーン(複合体I阻害剤)、DMSO中の10mMストック溶液。すべての試薬の30 μLアリコートを作り、-20°Cで保管してください。
      注: このガイドラインは、個別に購入し、研究者が作成した試薬を対象としています。試薬が代わりに分析装置から購入された場合は、試薬の準備に関するガイドラインに従ってください。

2. NK細胞は末梢血から隔離される

  1. ヒト血液からの末梢血単核細胞(PBMCs)調製
    メモ: 細胞培養フードでこれらの手順を実行します。血と接触しているすべての残渣や物質を漂白剤で除染し、焼却するために適切な容器に捨てます。
    1. ピペット20mLのリンパ球分離培地(LSM)を50mL円錐管に。
    2. 慎重に、30°の角度でチューブを維持しながら、ピペット20 mLの血液LSM上に、非常に穏やかに、チューブの壁に触れる。LSMとの血液の混合を避け、2つの流体の間に目に見える、明確に定義された相を作成します。
      注:末梢血または濃縮された白血病製品を使用することができます。
    3. チューブを25分間、室温で1000 x g 遠心します。それはチューブ(LSMと血液)ミックスの両方の相を作ることができるので、ブレーキを使用しないでください。
    4. 慎重に遠心分離機からチューブを取り出し、ラックに入れ.LSM(クリア)と血漿(黄色)の間の相で形成される細胞(単核細胞)の顕著な層の存在を確認し、赤血球は管の下部にペレットを与えます。
    5. 10 mLのプラスチックピペット(約5〜8 mL)で単核細胞層を軽く吸引し、新しい50 mL円錐形チューブに入れます。最大2種類のチューブのリンパ球間相を一緒にプールすることができます。
    6. 単核細胞2xを45 mLPBSで再懸濁し、800xgで5分間x g遠心分離して室温で洗浄する。
      注:このステップの後、末梢血単核細胞(PBMC)のペレットが得られ、研究者はNK単離工程に進むことができます。
  2. PBMC からの NK 分離
    1. 2.1.6のセルをカウントし、NK分離バッファ(1x 108 PBM/mL)で再中断します。
    2. 細胞再懸濁液(109 PBMC)を10mLとし、50mLチューブに入れ。
    3. 500 μL (バッファーバッファー 50 μL) の NK 細胞分離抗体ミックスと 10 μL (バッファーの 1 μL/ mL) 抗 CD3 陽性単離抗体ミックスを PBMCs に加え、室温で 10 分間インキュベートします。
    4. 磁性ビーズをボルテックスし、抗体(100 μLビーズ/ml PBMC)とPBMCsの混合に1 mLを加えます。たまにかき混ぜながら室温で10分間インキュベートする。
    5. 35 mL の NK 分離バッファー (3.5 ml バッファー/ml PBMC) を加え、磁石の上に 15 分間混ぜて置きます(2.2 x 107 PBMCs/mL)。その後、正に選択されたビーズと細胞(NK細胞を除くすべて)がチューブの壁に付着します。
    6. 管の側面または底部に触れることなく、50 mLプラスチックピペットで上清(NK細胞を含む)を慎重に回収してください。
    7. セルカウンターと遠心分離機を使用して細胞を数え、800 x g で5分間カウントします。
    8. 10%HSを含むIMDMで5 x 106細胞/mLで単離されたNK細胞を再懸濁し、実験が行われるまで5%CO2で37°Cのインキュベーターに入れる。2
      注:このNK絶縁プロトコルは、50 mLチューブと大きな磁石の使用に適応したセル番号と試薬のボリュームを状態にします。このプロトコルは、異なるチューブで分離ステップを繰り返すか、チューブ内の体積を減らすことによって縮小することによって(より多くのPBMCsが得られる場合に)スケールアップすることができます。14-45 mLの最終容積50mLポリスチレン管は、容積4-14、15 mLポリスチレンチューブが使用され、容積1-4 mLのために、5 mLポリスチレン管が使用される。磁石は異なっており、それぞれの場合に適切なチューブにフィットします。抗体ミックスとマグネティックビーズの量は、細胞数と最終体積に応じてスケーリングすることもできます。
  3. フローサイトメトリー用NK細胞集団染色
    1. ステップ2.2.8からサンプルあたり0.25 x 106 細胞を取り、室温で5分間800 x g で遠心分離して培地を取り出し、500 μLのPBSで細胞ペレットを再懸濁します。
    2. メーカーの推奨に従って生存性染料(DMSO再構成染料1 μL~1 mLの細胞再懸濁液)を加え、室温で30分間インキュベートします。
    3. 5 mL PBSで再懸濁し、800 x g で5分間遠心分離して室温で2倍洗います。
    4. 光から保護された氷上で30分間10%HSを含有するIMDMの100μLに対応する抗ヒト抗体を染色する( 表1参照)。すべての抗体は単一の染色ステップで組み合わせ、使用することができる。
    5. フローサイトメトリーでサンプルを分析し、得られたNK細胞集団の純度を評価する。18,19,19に記載した細胞格数および分析方法を使用する。
  4. NK細胞は可溶性IL-15を用いて刺激する
    1. 96ウェルプレート(ラウンドボトム)のウェルに10%HSを含むIMDMのステップ2.2.8または2.4.3から0.75 x 106 細胞を再懸濁します。
    2. 10% HSを含むIMDMでヒトIL-15〜1μg/mLを希釈します。希釈したヒトIL-15の100μLを細胞に加えると、最終的な濃度は0.5μg/mLに達します。
      注意:0.5 μg/mLはIL-15の飽和濃度です。IL-15またはIL-2、IL-12またはIL-18などの他のサイトカインの低濃度は、必要に応じて研究者によって試験され得る。
    3. 細胞を37°Cのインキュベーターに入れ、細胞外フラックスアッセイを行う前に48時間刺激します。IL-15なしで10%HSを含むIMDMで同じ濃度と体積で無刺激(対照)細胞を再懸濁し、48時間同じインキュベーターに入れる。

3. センサカートリッジの水和

メモ:センサーカートリッジの96プローブチップには、O2およびpHの変化を検出するために水和する必要があるO2およびH+用の個々の固体蛍光2体が含まれています。

  1. アナライザーをオンにし、37 °Cまで温める。
  2. センサーカートリッジパッケージを開き、ユーティリティプレートからセンサーカートリッジを分離します。ユーティリティプレートの各ウェルに200 μLの校正液を追加し、センサーカートリッジをプレートに戻して、センサーが溶液に完全に沈んでいるかどうかを検証します。最適な結果を得るために、蒸発を防ぐために適切に加湿されたCO2-フリーインキュベーターで37°Cでカートリッジを一晩インキュベートします。水和中にセンサーの下で気泡の形成を防ぎます。
    メモ:最小カートリッジハイドレーション時間は、CO2-freeインキュベーターで37°Cで4時間です。あるいは、CO2-フリーインキュベーターで37°Cで200μLの無菌水でセンサーカートリッジを一晩水和し、続いて200μLの予熱キャリブラント溶液を使用してセンサーカートリッジをインキュベートして、実行開始前に45〜60分、使用することができる。

4. 細胞外フラックスアッセイ

  1. 接着コートプレートの準備
    注:代謝パラメータの測定は96ウェルアッセイプレートの底に形成された微小室で行われるので、サスペンション細胞はまずウェルの底部に接着されなければなりません。ムール貝 ミチルスエドゥリス から抽出した細胞接着剤が採用されている。細胞接着剤の製造業者は1から5 μg/cm2のコーティングの集中を推薦する。この分析液培養マイクロプレートのウェルは、約0.110cm2の表面を有する。したがって、5 μg/cm2 濃度の場合、約 0.55 μg の接着剤が必要です。25 μLの接着剤溶液を各ウェルに塗布するので、分析液のマイクロプレートに最適な接着溶液濃度は22.4 μg/mL(22.4 μg/mL x 0.025 mL = 0.56 μg)です。
    1. 2.5 mLの細胞接着溶液(22.4 μg/mL)を0.1 M重炭酸ナトリウム、pH 8.0で調製します。重炭酸塩は、メーカーによると、6.5と8.0の間にある細胞接着性能に最適なpHを提供します。
    2. 細胞接着溶液のピペット25 μLをアッセイプレートの各ウェルに、室温で20分間インキュベートします。その後、溶液を取り除き、200 μLの滅菌水/ウェルで2倍洗います。細胞培養フード内でプレートを15分間開いた状態に保ち、井戸を乾燥させます。
      注:コーティングされたプレートは、4°Cで1週間まで保管することができます。
  2. 接着剤でコーティングされたプレートの細胞種
    1. ステップ2.4.3から遠心分離細胞は200 x gで室温で5分間。上清を除去し、ミトコンドリアストレステスト培地(ミトコンドリアストレステストが行われている場合)または解糖ストレステスト媒体(解糖ストレステストが行われている場合)で細胞を洗浄します。ペレット細胞は再び、同じ培地内の好ましい細胞濃度に再懸濁する(再懸濁量は選択した細胞濃度に依存し、各ウェルには180μLの細胞懸濁液が含まれるため、 0.26 x 106、0.52 x 106、1.04 x 10 6、2.08 x 106、4.17x 106、8.33 x 106セル/mLセル懸濁液を用意 .047 x 106,0.094x 106,0.187x 106,0.375x 106,0.75x 106および1.5 x 106セルをそれぞれそれぞれ)。6
    2. 各ウェルの側面に沿ってウェルごとに細胞懸濁液のプレート180 μL。マルチチャンネルピペットをお勧めします。分析液培養プレートのウェルA1、A12、H1、およびH12をバックグラウンド補正用の制御ウェルとして使用します。これらのウェルにアッセイ培地を180μL加えます(細胞なし)。追加の制御井戸は、必要に応じて、プレートに十分なスペースがある場合に使用することができます。
      注:血清の存在は、貧しい細胞の取り付けの原因となる可能性があります。
    3. CO2フリーインキュベーターで37°Cで30分間プレートを2インキュベートします。その間に10倍の化合物を準備します(下記のステップ4.3を参照)。
    4. 遠心分離機の設定をゼロブレーキに変更します。プレートを200 x g で5分間遠心します。顕微鏡下の細胞を観察し、ウェルの底に単層を形成していることを確認します。プレートをCO2フリーインキュベーターに25分間戻します。最良の結果を得るには、めっき後の合計時間は約 1 時間以下でなければなりません。
  3. センサーカートリッジにロードする10倍の作業ソリューションの準備
    メモ:センサーカートリッジの96個のプローブチップのそれぞれは、個々のウェルに化合物を順次注入するために使用できる4つのポート(A、B、C、D)を収容します。
    1. ミトコンドリアストレステストを行う場合は、それぞれ2.5 mL 10 μMオリゴマイシン、1 mM DNP、10 μMロテロンと10μMのアンチマイシンAをミトコンドリアストレスアッセイ媒体で調製します(ステップ1.2.3からストック液を使用)。注入後のウェル内の最終濃度は、1 μMオリゴマイシン、0.1 mM DNP、1 μMの抗マイシンA/ロテロンです。
    2. 解糖解析のテストを行うために、10 μMロテロンと10 μMのアンチマイシンAの混合物を解糖分解ストレスアッセイ媒体に2.5 mLずつ調製します(ステップ1.2.3のストック溶液を使用)。500 mM溶液の解糖分解試験媒体にグルコースを溶解し、2-デオキシグルコース(2-DG)を解糖分解ストレス試験媒体に溶解します。注入後のウェル内の最終濃度は、10 mMのグルコース、1 μMの抗マイシンA/ロテノン、50 mM 2-DGとなります。
    3. 37°Cに温かい溶液、pHをチェックし、必要に応じて7.4に再取り付けします。ステップ4.3.1で調製した化合物をロードする。(ミトコンドリアストレステストの場合)または4.3.2(解糖構造ストレステスト用)またはポートA、BおよびCに(ステップ3.2から)マルチチャネルマイクロピペッタとカートリッジを備えたポートローディングガイドを使用して、 表2に示すように。
      注: アッセイ中にすべてのウェルに適切な注入を行うために、使用されるポートの各シリーズ(例えば、すべてのポートA)には、センサカートリッジ全体に同じ注入量が含まれている必要があります。これは、バックグラウンド補正井戸に、さらには実験で使用されていないそれらの井戸に適用されます。
    4. プログラムのセットアップ中に、読み込まれたセンサーカートリッジをCO2フリーインキュベーターで37°Cでインキュベートします。
  4. 細胞外フラックスアッセイプロトコルの設定
    1. 細胞外フラックス分析ソフトウェアを開き、 グループ定義 と プレートマップ タブを使用すると、類似した条件を持つウェルのグループ(例えば、同じ数の細胞を持つウェル、または静止細胞またはIL-15刺激細胞のいずれかであるウェル)を示します。また、背景補正ウェル(デフォルトではA1、A12、H1、H12が設定されますが、追加のウェルを使用できます)と空の井戸を示します。
    2. 「プロトコル」タブを使用して、ソフトウェアの表 3に記載されているプログラムをセットアップします。
    3. [ アッセイを実行 ]タブを使用してプログラムを開始します。センサーカートリッジ(10x化合物を含む)とユーティリティプレートをトレイに置きます。キャリブレーションステップ(15~20分)の後、プロンプトが表示されたら、アッセイプレートの校正板(蓋なし)を、取り付けられたセルに交換します。この後、実行は完全に自動化されます(機械はすべての測定と注入を実行します)。
      注:特定の化合物が適切なポート(ポートAのオリゴマイシン、DNPおよびアンチマイシン/ロテワンン)にロードされている限り、同じプレートでミトコンドリアストレステストと解糖構造ストレステストを行うことが可能です。 ミトコンドリアストレステストが行われる井戸のBとCはそれぞれ、糖分解ストレステストが行われる井戸のポートA、B、Cのグルコース、アンチマイシン/ロテノンおよび2-DG)、各テストの各一連のポートとウェルで同じ量の注射が使用されます。 Group Definitions Plate Map
    4. 実行が完了したら、データを取得し、ソフトウェアを使用して分析します。

5. セル数決定

注: 結果は、セル番号の違いが生じる可能性を考慮して正規化できます。以下に説明する2つの主要なアプローチを用いることができる。

  1. DNA含有量の判定
    1. 各ウェルからピペットで残りのアッセイ媒体を取り除きます。培地を吸い込むときは、細胞を邪魔しないように注意してください。プレートは、分析まで-20°Cで保存することができます。
      注:凍結ステップは、効率的な細胞のリシスおよびDNA含有量の決定のために重要です。
    2. 細胞増殖アッセイ細胞溶解バッファー(20x)の1x溶液を蒸留水(200 μL/well)で調製します。
    3. 細胞増殖アッセイ染料ストック溶液(400x)を1x細胞溶解バッファーに加えます。ウェルあたり50〜50.000細胞の検出には、1x細胞増殖アッセイ色素を使用してください。より高い細胞数の場合、最終濃度1xより高い細胞増殖アッセイ色素を用いることは推奨される。この場合、5倍の最終濃度で細胞増殖アッセイ色素を使用する(細胞増殖アッセイストック溶液を1x細胞溶解バッファーに80倍希釈する)。
    4. 各ウェルに細胞増殖アッセイ試薬の200 μLを加えます。室温で2~5分間サンプルをインキュベートします。光から守る。
    5. 励起時のサンプルの蛍光を測定する: 480 nm;放出:製造業者の推薦に従って蛍光マイクロプレートの読者を使用して520 nm。
  2. タンパク質含有量の判定
    1. 注意して、細胞に触れることなく各ウェルからアッセイ培地を完全に吸引し、少なくとも1時間 −20°Cで細胞を凍結する。あるいは、細胞を、分析が行われるまで、より長い時間(最大1週間)凍結し続けることができる。
    2. 1xプロテアーゼ阻害剤(100xストック溶液から)を添加した50μLの放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解培地を各ウェルに加えます。プレートをシェーカーの上に室温で5分間置き、プレートを氷の上で30分間インキュベートして完全な細胞のリシスを行います。
    3. プレートを室温で 200xg で5分間遠心します。このステップは、タンパク質測定との干渉を防ぐために細胞破片をペレット化する。
    4. メーカーの推奨に従って、ビチンコニン酸(BCA)アッセイによりタンパク質濃度を測定します。

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結果

末梢血からのNK細胞の分離は純粋で実行可能な集団を提供する

細胞外フラックスアッセイは、ウェル内のH+ およびO2 濃度の測定に基づいており、細胞の異なる集団またはその生存率を区別しません。このため、目的の細胞の非常に純粋で実行可能な集団を得ることが、これらの実験で成功するための重要なステップでした。

末梢血からのNK細胞の単離は、セクション2に記載されるように行った。得られたNK細胞の純度と生存率を評価するために、PMBCおよび単離されたNK細胞集団からの小さなアリコートを、フローサイトメトリーによって染色および分析した(図2A)。単核細胞は、前方(FSC-A)対側散乱領域(SSC-A)を示すプロットにゲート付けされた。この母集団内では、単一セルが、FSC-Aと前方散乱高さ(FSC-H)を示すプロットの対角線に沿ってゲートされた。シングル集団内では、生存率を評価し、PMBCおよびNK細胞集...

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ディスカッション

本論文では、末梢血から純粋で生存可能な初代ヒトNK細胞を効率的に単離し、培養するためのプロトコルを確立した。また、細胞外フラックス分析装置を用いることで、酸素消費率や細胞外酸性化率で評価したNK細胞の代謝活性測定条件を最適化しました。他の呼吸法と比較して、細胞外フラックス分析装置は高速であり、少数の細胞を必要とし、高スループットスクリーニングを可能にする。しかし、その試薬は高価であり、化合物の注射はわずか4に制限されています。NK細胞におけるサイトカインによる糖分解および酸化リン酸化の代謝リモデリングおよび活性化は、堅牢なNK細胞応答21に不可欠であり、ここで説明する技術は、NK細胞の代謝プロファイルをリアルタイムで研究することを可能にする。このプロトコルは、IL-2、IL-12およびIL-18、または活性化受容体に結合する抗体などの他のサイトカインによって活性化された細胞に拡張することができる。最適な合流点で細胞をめっきしたり、最適な結合を使用して最大酸素消費量を刺激するなど、見落とされがちないくつかの重要なステップに取り組んでいます。しかし、実際のO2レベル曲線(...

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開示事項

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

謝辞

著者らは、マイケル・N・サック博士(国立心臓・肺・血液研究所)の支援と議論に感謝する。この研究は、国立衛生研究所、国立がん研究所、国立心臓、肺、血液研究所の壁内研究プログラムによって支援されました。JT は MICINN (スペイン) のラモン y カハル プログラム (助成金 RYC2018-026050-I) によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-デオキシ-D-グルコース(2-DG)ミリポアシグマD8375-5G解糖ストレステストインジェクターコンパウンド
2,4-ジノトロフェノール(2,4-DNP)ミリポアシグマ D198501ETCアンカプラー/ミトコンドリアストレステストインジェクターコンパウンド
96ウェル細胞培養プレート/蓋付き丸底Costar3799NK細胞培養
アンチマイシンAミリポアシグマA8674コンプレックスIII阻害剤/解糖系およびミトコンドリアストレス試験用インジェクター化合物
BD FACSDIVA ソフトウェアBD Biosciencesフローデータ収集
BD LSR FortessaBD Biosciencesフローデータ収集
Cell-TakCorning354240細胞接着
CyQUANT細胞増殖アッセイThermoFisher ScientificC7026DNA定量のための細胞増殖アッセイ。細胞溶解バッファーとCyQUANT GR色素を配合
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit IIStemcellテクノロジー17851PBMCからのNK細胞単離
EasySep Human NK cell Enrichment KitStemcellテクノロジー19055PBMCからのNK細胞単離
EasySep MagnetStemcellテクノロジー18001PBMCからのNK細胞単離
EDTA 0.5 M、pH 8品質Biological10128-446NK sell separation
buffer FACS tubesFalcon-Fisher Scientific352235Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubesFalcon-Fisher Scientific14-432-22NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS)Gibco10437-028NK cell separation buffer
FlowJo SoftwareBD Biosciencesフローデータ分析
グルコースミリポアシグマG8270ミトコンドリア負荷試験媒体の成分。解糖ストレス試験 インジェクター化合物
Halt プロテアーゼ阻害剤 カクテルサーモフィッシャーサイエンティフィック78429プロテアーゼ阻害剤 100X. RIPA溶解バッファーでの使用
ヒトIL-15Peprotech200-15-50ugNK細胞刺激
ヒト血清 (HS)Valley Biomedical9C0539NK細胞培養培地サプリメント
IMDMGibco12440053NK細胞培地
L-グルタミン (200 mM)ThermoFisher Scientific25030-081ストレステスト培地の成分
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitThermoFisher ScientificL34965フローサイトメトリー染色用生存率色素
LSMmpbio50494XPBMCs ヒト血液からの分離
マウス抗ヒト CD3 BV711BD Biosciences563725T細胞フローサイトメトリー染色
マウス抗ヒトCD56 PEBD Pharmingen555516NKフローサイトメトリー染色
マウス抗ヒトNKp46 PEBD Pharmingen557991NKフローサイトメトリー
オリゴマイシンミリポアSigma75351コンプレックスV阻害剤/ミトコンドリアストレステストインジェクター化合物
PBS pH 7.4Gibco10010-023NK細胞分離バッファー
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225For determination of protein
concentration RIPA Buffer BostonBioProductsBP-115Cell lysis
RotenoneMilliporeSigmaR8875Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller SoftwareAgilentタツノオトシゴXFe96アナライザー用コントローラー
タツノオトシゴウェーブデスクトップソフトウェアAgilentデータ分析用
タツノオトシゴXFベース ミディアムAgilent102353-100細胞外フラックスアッセイベース ミディアム
タツノオトシゴXFe96アジレント外フラックスアナライザー
タツノオトシゴXFe96 FluxPakAgilent102416-100XF96細胞培養プレート20枚、XFe96センサーカートリッジ18個、化合物をアッセイカートリッジに移すためのローディングガイド、キャリブラント溶液1本(500ml)が含まれています。
重曹ミリポアSigmaS5761Cell-Tak溶液の調製
ピルビン酸ナトリウム (100 mM)ThermoFisher Scientific11360-070ミトコンドリア負荷試験媒体の成分
性 染色 アナライザー 細胞

参考文献

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