ここに提示されるホスホプロテオミクスアプローチ、すなわち、シロイヌモゼスホスファプロテオームのハイスループットと深いカバレッジを提供するリンポプロテオミクスに基づく抽出チップを停止して行く。このアプローチは、シロイヌナズナの浸透性ストレスシグナル伝達の概要を示す。
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この記事について
サマリー
要約
タンパク質リン酸化は、浸透状態下での酵素活性と遺伝子発現の調節に不可欠です。質量分析法(MS)ベースのホスホプロテオミクスは、植物シグナル伝達の研究方法を変えました。しかし、カバレッジの深さを達成するための多くの出発材料と長期のMS測定時間の要件は、植物の世界的なホスホプロテオミクス変化のハイスループット研究の制限要因となっています。植物ホスホプロテオミクスの感度とスループットを向上させるために、浸透応力に応答して植物リン酸化摂動の迅速かつ包括的な分析のためのタンデムマスタグ(TMT)標識と相まって、ストップアンドゴー抽出(ステージ)チップベースのホスホプロテオミクスアプローチを開発しました。ステージチップ技術のシンプルさと高スループットを活用して、全体の手順は、リンペプチド濃縮、分画、およびサンプルクリーニングステップを完了するために2つのヒントを使用して約1時間を要し、アプローチの使いやすく、高い効率を示唆しています。このアプローチは、植物のリンプロテオミクス分析(>11,000リンペプチド同定)を提供するだけでなく、隣接する分画間の優れた分離効率(<5%のオーバーラップ)を示します。また、TMT標識を用いて多重化が行われ、野生型および snrk2 デクプル変異型植物のホスホプロテオミクス変化を定量化した。このアプローチは、陸上植物における初期の浸透シグナル伝達の理解に光を当てる浸透性ストレスに応答して、Raf様キナーゼのリン酸化事象を明らかにするためにうまく使用されている。
概要
高いサリン性、低温、干ばつは浸透応力を引き起こし、これは植物の生産性1,2に影響を与える主要な環境要因である。タンパク質リン酸化は、浸透ストレス3、4、5に対する植物応答におけるシグナル知覚および伝達を媒介する最も重要な翻訳後修飾の1つである。SNF1関連プロテインキナーゼ2s(SnRK2s)は、浸透性ストレスシグナル伝達6に関与している。SnRK2ファミリーの10人のメンバーのうち9人は、浸透性ストレス7、8に応答して有意な活性化を示す。snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 10デクサプル(snrk2-dec)全10個のSnRK2に変異を有する変異体は、浸透圧ストレスに対する過敏症を示した。snrk2-dec変異体において、イノシトール1,4,5-トリスリン酸(IP3)の浸透ストレス誘導蓄積、アブシジン酸(ABA)生合成、および遺伝子発現が強く減少し、浸透応力応答におけるSn....
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プロトコル
1. サンプル準備
- コントロールとストレス処理苗(1 g)をアルミニウム箔で収穫し、液体窒素でサンプルを凍結フラッシュします。
注:通常、成熟した植物よりも2週齢の苗からより高いタンパク質濃度が観察されます。1グラムの苗木は約10mgのタンパク質ライセートを生成し、MS分析には十分です。すべての遠心段階は、ステップ1で16,000 x g で行われます。 - 液体窒素で満たされた乳鉢と害虫を使用して、冷凍苗を細かい粉末に粉砕します。
- 10 mM トリス(2-カルボキセチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)、40 mM 2-クロロアセタミド(CAA)、プロテアーゼおよびインヒビターアセクターゼ阻害剤を1mL加えて、乳鉢の中で、100 mMトリス-HCl、pH 8.5)を加えて、乳鉢を混ぜます。
- 植物のライゼートを1.5mLチューブに移し、95°Cで5分間加熱します。
- チューブを氷の上に10分間置きます。10 sの氷の上にチューブを超音波処理し、10 sのために一時停止し、3回繰り返します。
- 20分間チューブを遠心分離し、植物の150 μLを1.5 mLチューブに入れ、
- チューブに600μLの100%メタノールを加えます。渦とチューブをスピンダウン。
- 100%クロロホルムの150μLをチューブに加えます。渦とチューブをスピンダウン。
- 450 ....
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結果
このワークフローの性能を実証するために、IMACステージチップとHp-RPステージチップ分画を利用して、マンニトール処理の有無にかかわらず野生型および snrk2-dec 変異苗のホスホプロテオミクス変化を30分間測定しました。各サンプルは生物学的三数で行われ、実験ワークフローは 図1に示されている。各サンプルの消化されたペプチド(400 μg)を1つのTMT-6plexチャネルで標識し、プールして脱塩した。このリンペプチドをさらにIMACステージチップを用いて濃縮し、精製されたリンペプチドをHp-RPステージチップによって8つの分画に分画した。各画分を90分LC勾配分析で分析した。生ファイルは、 シロイヌナズナのthaliana データベースに対する検索エンジンを使用して検索されました。
6,852の局所リン酸化部位(クラスI、局在化確率>0.75)を有する3,630リン酸化タンパク質に対応する11,077個のユニークなリンペプチドが同定され、シロイヌナズプシス.......
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ディスカッション
植物プロテオームとホスホプロテオームのダイナミックレンジと複雑さは、依然としてホスホプロテオミクス分析の深さに対する制限要因です。10,000リン酸化部位21、22を同定するLC-MS/MS分析の単回実行の能力にもかかわらず、植物全体のホスホプロテオームのカバレッジは依然として限られている。そのため、環境ストレスに対応した植物信号ネットワークのグローバルな視野をプロファイリングする際には、高感度かつ優れた分離効率を提供するホスホプロテオミクスワークフローが必要とされています。市販の高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムベースクロマトグラフィーは、MS分析23,24の前にペプチドの複雑さを低減する一般的な方法である。しかし、サンプル収集の手順や大溶出量は、感度とスループットの点でHPLCベースの方法の主要な課題です。stage tip は、ペプチドの事前分画または濃縮を実行して、高感度で高スループット.......
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開示事項
著者らは利益相反を宣言しない。
謝辞
この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム、グラントXDB27040106によって支えられた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 mLチューブ | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind、1.5 mL、PCRクリーン、無色、100チューブ |
| 200 µLピペットチップ | ギルソン | F1739311 | |
| 2-クロロアセトアミド | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| 酢酸 | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| アセトニトリル | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| 水酸化アンモニウム | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| リン酸アンモニウム monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCAタンパク質アッセイキット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 23227 | |
| 鈍い針 | ハミルトン | 90516 | Kel-F ハブ (KF)、ポイントスタイル 3、ゲージ 16 |
| C18-AQ ビーズ | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 & マイクロ;m | |
| C8 エンポールディスク | 3 M | 2214 | 47 mm |
| 遠心分離機 | エッペンドルフ | 22620444 | |
| クロロホルム | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| データ解析ソフトウェア | Perseus 1.6.2.1 | ||
| https://maxquant.net/perseus/ エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| ギ酸酸性 | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | SPEカートリッジ用フリット |
| グアニジン塩酸塩 | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 塩化鉄(III) | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | サーモフィッシャーサイエンティフィ | Velos Pro | |
| 質量分析計 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| メタノール | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| ナノ LC | サーモフィッシャーサイエンティフィック | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA スピンカラム | Qiagen | 31014 | |
| N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩 | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| プランジャー | ハミルトン | 1122-01 | プランジャー アセンブリ N、RN、LT、LTN モデル 1702 用 (25 μl) |
| 検索エンジンソフトウェア | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK カートリッジ 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| d-odium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| 重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液 | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| トリフルオロ酢酸 | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩 | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma 塩酸塩 | Sigma-Aldrich | T3253 |
参考文献
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperatur....
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