ここでは、2000年代初頭にマルモラシュタイン、ピーチー、および同僚が最初に記述したDC-ERGとして知られている技術を用いて、マウスにおける網膜色素上皮(RPE)の光誘発電気応答を記録する方法を提示する。
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方法論記事
マウス網膜色素上皮の光誘発電気応答を記録するための直接結合電解電解(DC-ERG)
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
網膜色素上皮(RPE)は、網膜と絨毛キャピラリスの間に戦略的に位置する細胞の特殊な単層であり、光受容体の全体的な健康と構造的完全性を維持します。RPEは、極偏光され、アピカルに、そして基底位置の受容体またはチャネルを示し、水、イオン、代謝物、およびいくつかのサイトカインを分泌するベクター輸送を行う。
インビボでのRPE機能の非侵襲的な測定は、直接結合されたERG(DC-ERG)を使用して行うことができます。DC-ERGの背後にある方法論は、Marmorstein、Peachey、およびカスタマイズされた刺激記録システムを使用して、後に市販のシステムを使用して実証された研究グループによって開拓されました。DC-ERG技術は、ハンクの緩衝塩溶液(HBSS)で満たされたガラス毛細血管を使用して、感光体活性によるレリンタル空間の光誘発濃度変化から引き出されるRPEの遅い電気応答を測定する。長時間の光刺激とDC-ERG記録の長さは、それがドリフトやノイズに対して脆弱になり、使用できる録音の低収率をもたらします。ここでは、HBSSと電極ホルダーの外気に起因する気泡を減らす/除去するために真空圧を使用することにより、ノイズを低減しながら、記録の安定性を向上させる迅速で信頼性の高い方法を提示します。さらに、電源ラインのアーチファクトは、電圧レギュレータ/パワーコンディショナを使用して減衰されます。市販のERGシステムに必要な光刺激プロトコルと、C波、高速振動、光ピーク、オフレスポンスのDC-ERG成分の分析に必要な光刺激プロトコルが含まれています。記録の改善された容易さおよび急速な分析のワークフローのために、この簡易な議定書はRPE機能、疾患の進行、および薬理学的介入の評価の加齢に関連する変化を測定するのに特に有用である。
概要
網膜色素上皮(RPE)は眼の後部セグメントに並び、網膜恒常性1を維持するために重要な機能を発揮する特殊な細胞の単層である。RPEは、可視周期2と呼ばれるプロセスで光子捕捉視覚顔料を再生することによって、小屋外セグメント先端3の日経食類に参加することによって、光受容体と絨毛キャピラリ4,5との間の栄養素および代謝産物の輸送において光受容体を支持する。RPE機能の異常は、加齢黄斑変性症6、レーバーの先天性アマウロシス7、8およびベストビテッラ状黄斑ジストロフィー9のような多数のヒト網膜疾患の根下にある。ドナー眼組織は研究目的のためだけに得ることがしばしば困難であるので、遺伝子組み換えのある動物モデルは、10,11の疾患の発症を研究する別の方法を提供することができる。さらに、CRISPR cas9技術の出現と応用により、ゲノム導入(ノックイン)または欠失....
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プロトコル
このプロトコルは、国立眼科研究所の動物ケアおよび使用委員会によって承認された動物研究プロトコルで概説されている動物ケアガイドラインに従います。
1. DC-ERG用光刺激プロトコルのインポート
注: 以下の指示に従って、DC-ERG の光刺激プロトコルを ERG システム ソフトウェア (表) にインポートします。プロトコルは0.5分前刺激間隔で構成され、その後に7分間の光のステップ(10 cd/m2)が続き、1.5分のポスト刺激間隔で終了する。10 cd/m2の光強度(1ログ10 cd/m2)は、WTマウス18,21におけるDC-ERGの全成分に対する最大応答の約半分を呼び起こすため選択された。c波および高速振動は、これらの電気応答の起源が十分に特徴付けられるため特に興味深く、インビトロRPEモデル(例えば、iPSC-RPE)で分離および研究することができる。他の光強度の適用は、追加の情報を抽出することができ、例えば、オフ応答は、明るい光刺激で極性の逆転を受け、この反転が起こる強度で違いを示す可能性があります。ユーザーは、自分の裁量で光強度の設定を自由に変更することができます。
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結果
図2はmiR-204 ko/ko cre/+(条件付きKO)マウスと野生型(WT)マウスからのサンプルデータセットです。MiR-204 ko/ko cre/+は、網膜色素上皮におけるマイクロRNA204の条件付きノックアウトを有するマウスである。これらのマウスは、VMD2-CREマウス23を用いてフロックスmiR-204マウス(NEIGEFによって産生される)22を交流することによって生成される。MiR-204は、緊密な接合完全性を維持する上皮機能(例えばクローディン)に対して重要なタンパク質の発現を調節するRPEで高発現している(例えば、クローディン)、Kir 7.1カリウムチャネルの発現による恒常カリウムの維持、およびいくつかの視覚サイクル遺伝子の発現(例えば、LRAT、RPE65)24。
異常なRPEモルフォロジーは、マウスライン
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ディスカッション
重要なステップ
良好なDC-ERG記録は、アウトガスや温度変化に非常に敏感であるため、アーティファクトや不要なドリフトを作成する気泡から自由である安定した電極を必要とします。マウスの記録を進める前に、HBSSバス溶液に電極を配置する際に安定したベースラインを達成することが不可欠です。小さな気泡は、キャピラリー電極の基部またはシリコンガスケットの周りに集まりがちで、電極ホルダーが完全に組み立てられると見えにくくなります。気泡が少ない場合は、ホルダーを軽くフリックすると、除去のためにそれらを解放します。気泡が多すぎる場合や、ドリフトやノイズを除去できない場合は、電極を分解して、プロセスの各ステップで慎重に気泡を検査しながら最初からやり直す方が良い場合が多いです。
変更とトラブルシューティング
DC-ERG の録音の忠実度を向上させるために、次のカスタマイズをセットアップ (材料表
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作品はNEIの壁内資金によって支えられた。著者らは、シェルドン・ミラー博士の科学的指導、技術的助言、RPE生理学と疾患の専門知識について心から認めている。著者らは、マウスコロニーを管理してくれたメーガン・コペラと動物ケアスタッフ、タルン・バンサル博士、レイモンド・ジョウ博士、元王博士に技術支援を求めた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Ag/AgCl(口) 電極 | WPI Inc | EP1 | マウス用口参照電極 |
| セラミックタイル | サッター器具 | CTS | ガラスキャピラリーチューブを適切なサイズに切断するために使用される |
| コットンチップクリーニングスティック | ピューリタンメディカル製品 | 867-WC 接着剤なし | 電極ホルダーアセンブリのフィット感を向上させるためのスペーサーとして使用する |
| 網膜電図(ERG)システム | Diagnosys LLC | E3システム | 視覚研究および薬物試験における眼科の状態を診断する視覚電気生理学システム |
| ブンゼンバーナー | Argos Technologies | BW20002460 | または炎の下でガラスを形作ることと同等 |
| ガラス毛細管(1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | HBSSを充填し、角膜ハンクに接触させるため |
| 緩衝塩溶液(HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | 市販品。RT |
| インラインフィルター | Whatman | 6722-5001 | エアロゾルから真空ポンプを保護するため |
| マイクロ電極ホルダー用低ノイズケーブル | WPI Inc | 5372 | ケーブルと電極ホルダーアセンブリの長さと配置を改善するために提案 |
| 磁気ボールジョイント | WPI Inc | 500871 | ステージ上の電極ホルダーアセンブリを磁気的に位置決めするため |
| MatLab | Mathworks | MatLab: 解析ソフトウェアの編集用 | |
| MatLab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (解析ソフトウェアの編集にのみ必要) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (解析ソフトウェアの編集と再リリースにのみ必要) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | 分析ソフトウェアの実行に必要: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| マイクロ電極ホルダー (45 度) | WPI Inc | MEH345-15 | キャピラリーを保持するため |
| ニードル (25 ga) | Covidien | 8881250313 | キャピラリーチューブに HBSS |
| ニードル (アース) 電極 | Rhythmlink | 13mm - 1 つのエルクトロード | マウス用皮下針電極(アース)(長さ13mm、針径0.4mm、リード線1.5m) |
| レギュレーター/パワーコンディショナー | ファーマン | P-1800 | または同等の電力線を介して導入されたノイズからDCオフセットを除去する |
| シリンジ(12mL) | モノジェクト | 1181200777 | HBSS |
| Tクリップ | コールパーマー | 06852-20 | 電極ホルダー組立用 |
| 真空デシケーター | Bel-Art | 420120000 | 透明なポリカーボネートの底とカバー |
| Pharmacological処置 | |||
| 潤滑剤アイジェル | アルコン | 0078-0429-47 | 角膜表面を潤滑し、毛細管電極との電気的接触を維持するのに役立ちます |
| フェニレフリン塩酸塩2.5% | Akorn | 17478-201-15 | 短時間作用型散瞳点眼薬(瞳孔拡張用) |
| プロパラカイン塩酸塩0.5% | Akorn | 17478-263-12 | 科点眼用局所麻酔薬 |
| トロピカミド0.5% | Akorn | 17478-101-12 | 時間作用型散瞳点眼薬(瞳孔拡張用) |
| キシラジン | AnaSed | sc-362949Rx | 鎮痛および筋弛緩薬 |
| ゼタミン(ケタミンHCl) | VetOne | 501072 | 筋肉内注射用麻酔薬 |
参考文献
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in....
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再版と許可
