このプロトコルは、低コストのマイクロインジェクションシステムの構築、深部脳構造への立体的移植、および目覚めおよび拘束されていないラットにおけるテトロドトキシンの時回マイクロ注射の手順を記述する。目標は、その神経活動を阻害することによって排卵の調節における視床下部構造の関与を明らかにすることです.
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方法論記事
テトロドトキシンマイクロインジェクションによる可逆不活性化による排卵調節におけるラット脳の離散領域の役割の解明
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
多くの実験的なアプローチは、排卵の調節における脳の役割を研究するために使用されてきた。例としては、ニューロン群の病変および耳障りなことが挙げられるが、これは両方とも標的領域の完全性を永久に損なう侵襲的方法である。これらの方法は、急性および時間的調節メカニズムの分析に影響を与える可能性のある担保効果を伴う。特定の脳領域を対象としたガイドカニューレの立体的移植は、回復期間が続き、研究者が手術の望ましくない影響の消失後に異なる薬物をマイクロインジェクトすることを可能にする。テトロドトキシンは、一過性のナトリウム依存作用電位を阻害し、標的領域における全ての神経活動を遮断するため、多様な生理学的過程における複数の脳領域の役割を決定するために用いられている。このプロトコルは、この方法を、エストルースサイクルおよび排卵の評価のための戦略と組み合わせて、エストルースサイクルの特定の段階の特定の時間における排卵調節における離散脳領域の役割を明らかにする。目覚めと拘束されていないラット (ラタス・ノルベギカス) は、麻酔薬やストレスホルモンが排卵に及ぼす遮断効果を避けるために使用されました。このプロトコルは、他の種、脳標的および薬理学的薬剤に容易に適応して、異なる生理学的プロセスを研究することができる。この方法の将来の改善には、ガイドカニューラの代わりに小径のガラス毛細血管を使用したマイクロインジェクションシステムの設計が含まれます。これは、移植中に損傷を受けた組織の量を減少させ、注入された薬物が標的領域外に広がることを減少させる。
概要
排卵は、1つ以上の成熟した卵母細胞が一度毎エストラル/月経周期から1回卵巣から放出されるプロセスである。すべての哺乳類種は繁殖する配偶子の生産に依存しているので、排卵を調節するメカニズムの理解は、生物医学、家畜産業、絶滅危惧種の維持に至るまでの分野で大きな影響を与えます。排卵は視床下部下垂体-卵巣軸によって調節され、いくつかの視床下部および視床外領域、下垂体前葉座のゴナドロープ、および卵母細胞および顆粒球細胞と共に卵巣卵胞を形成する卵巣卵胞を形成する1。
卵巣卵胞は成長し、成長し、最終的には卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンの強壮性および精神病分分に応答して排卵する、ゴナトロープによって分泌される2つのゴナドトロピン。ゴナドトロピン分泌のパターンは、適切な濾胞の発達と排卵のために極めて重要であり、それは性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)1、2によって調節される。この神経ペプチドは、基底の全脳症に散在するニューロンによって合成され、視床下部と下垂体前を結びつける門脈管系に分泌される。GnRH-ニューロンの分泌活性は、多様な脳構造から生じるシナプス入力によって変調される。これらの構造は、食物の入手可能性、光周期の長さ、血液中のホルモン濃度など、生物の外部および内部環境の状態に関する情報を伝える。この意味で、....
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プロトコル
動物に関する手続きは、UNAMの学部エスタジオス・スペリオルテス・サラゴサの倫理委員会によって承認されました。この機関は、動物の取り扱いのためのメキシコの規則に厳密に従って動作します, 公式ノルム: NOM-062-ZOO-1999, 国際ガイドラインに同意します.
1. 二国間カニューレの建設
- 圧力ピンセットを使用して23G皮下注射針のハブからステンレスシャフトを抽出し、メスブレードを使用して残りの接着剤を取り除きます。
- 細かい永久マーカーでシャフトの鈍い端から離れて15ミリメートルの線を描きます。切削ピンセットを使用して、ベベの端を取り除く。
- 細かい止まり止まりで15 mmのセグメントを保持し、チューブの14ミリメートルセグメントが得られるまで、回転工具に取り付けられたカットオフディスクで垂直に押します。このステップはシャフトの閉塞部分を除去するために行われ、開いた、鈍い端を作成する。最後に、30Gの針をセグメントに通して挿入して、内部の障害物を除去します。
- 脳アトラス27の助けを借りて、脳の左右半球における目的の構造間の距離を決定する。くすぶる粘土を使用して、2つの14 mmセグメントを顕微鏡スライドに取り付け、両方が同じ水平レベルであることを確認します。眼マイクロメーター(10x)を通して観察し、目的の距離が得られるまで細かいピンセットでセグ....
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結果
上述のプロトコルは、単一のTTXまたは車両(人工脳脊髄液)の効果を評価することによってテストされた。ACSF)ラットの排卵調節に関与することが知られている2つの異なる核のうちの1つへのマイクロインジェクション:対症核および円弧核。この二大円球核は、哺乳類の中央概日ペースメーカーが含まれているために選択された。これは、ゴナドトロピンの分泌として周期的なイベントの規制に関与しています。アークエルト核は、エストルーサイクルのほとんどの間にGnRH分泌を刺激するエストラジオール受容体を発現するニューロンの集団を含んでいるために選択されました。マイクロインジェクションは、ゴナドトロピンの排卵前放出を調節する多くの中心的なメカニズムの発生に起因する「クリティカルウィンドウ」として知られている期間であるプロエストラス段階の14:00時間に行われた。治療後、膣の塗抹標本は毎日採取され、ラットは発情の予測日の09:00時間に安楽死させられ、これは発情の膣塗抹標本と一致した。追加の対照群として、エストラスの段階で安楽死させた5匹の無傷のラットが使用された。手術後のサイクリング動物の割合と各群の排卵ラット(排卵ラット/n)の割合を、フィッシャーの正確な確率検.......
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ディスカッション
この記事では、一時的に不活性化する方法について説明します, 任意の時点で, 目を覚ますと、拘束されていないラットの脳内の離散領域.彼らのエストルースサイクルを追跡し、排卵を評価するための簡単な方法も提供されています。このプロトコルは、TTX処理動物の排卵結果と車両処理動物の排卵結果を比較することによって排卵を促進するメカニズムに対する特定の脳領域の寄与を簡単に分析することを可能にする。神経科学の実験室で一般的である立体的な器械およびマイクロ注入ポンプを除いて、この方法は高価な材料を要求しない。この種の実験では、市販のカニューラとマイクロインジェクターが通常の選択肢ですが、ここで説明する簡単な構築システムはコストを下げ、結果は区別できません。このプロトコルと、この記事に付随する表に記載されている材料を使用することで、10匹の動物のための商業キットが費用がかかるのと同じ金額を費やすことによって、10倍のカニューレを製造することができます。10の両側カニューレの建設は、研究に必要なカスタマイズに関係なく、数時間で行うことができる。また、すべてのコンポーネントが再使用可能で、コスト効率が向上します。
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開示事項
著者は、この記事に関連して開示するものは何もありません。
謝辞
ワシントン大学のレイモンド・サンチェスは、原稿編集における貴重な支援と、ジョージナ・コルテス M.Sc とシンティア・ハビエル M.Sc の技術支援に感謝しています。私たちはまた、ファカルタード・デ・エストゥディオス・サラゴサ:MVZで獣医サービスのメンバーに感謝しています。アドリアナ アルタミラノ、 MVZ.ロマン・エルナンデスとMVZ。実験動物の優れたメンテナンスとケアのためのドロレス-エリザベス・グスマン。このプロトコルで説明されている実験は、DGAPA-PAPIIT認可番号(IN216015およびCONACyT助成金番号:ロベルト・ドミンゲスに236908)で支持されました。カルロス・カミロ・シルバは、プログラム・デ・ドクマド・エン・シエンシアス・バイオメディカ、大学ナシオナル・エウトノマ・デ・メヒコ(UNAM)の博士課程の学生で、コンセホ・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジア(グラント番号:294555)によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10 μL ハミルトン シリンジ | ハミルトン | 80314 | |
| 21 G x 1インチ ステンレス鋼 ヒプダーミック ニードル | BD | 305165 | |
| 23 G x 1 インチ ステンレス ハイプダーミック ニードル | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2 インチ ステンレス ハイプダーミック ニードル | BD | 305106 | |
| 人工脳脊髄液 | BASi | MD-2400 | |
| ボーン トリマー | ファインサイエンスツール | 16152-12 | |
| マイクロドリル用バリ | ファインサイエンスツール | 19007-05 | |
| ッパー | ウォール | ||
| カットオフディスク | ドレメル | SM5010 | |
| カッティングピンセット | トゥルー | パー17367 | |
| ノクリレート接着剤 | Kola loka | K-1 | |
| 歯科用セメント | Nicトーン | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| 超微細ボンはさみ | ファインサイエンスツール | 14084-08 | |
| フェイスマスク | ランセタHG60036 | ||
| グレーフ鉗子 | ファインサイエンスツール | 11050-10 | |
| ヘマトキシリン | シグマ | H3136 | |
| 止血ファイン | サイエンスツール | 13008-12 | |
| ホットビーズ滅菌器 | ファインサイエンスツール | 18000-45 | |
| 酸 | シグ | マ | |
| ヒプロメロース人工涙液ソ | フィアラボ8950015 | ||
| イソフルラン | ピサAgropecuaria | ||
| メロキシカム | アランダ | 1183 | |
| マイクロインジェクション ポンプ | KD サイエンティフィック | 788380 | |
| モノマー | ニック トーン | ||
| モトツール | ドレメル | 3000 | |
| ニトリル手袋 | ランセタ HG | 69028 | |
| ノンラプチャー イヤーバー | デビッド コップフ インスツルメンツ | 855 | |
| ポリLリジン | シグマ | P4707 | |
| ポビドンヨード | ダーモダイン | ||
| ポビドンヨードと石鹸 | ジェルミシンエスプーマ | ||
| 圧力ピンセット | トゥルーパー | 17371 | |
| ラット麻酔マスク | デビッド・コフ・インスツルメンツ | モデル906 | |
| 生理食塩水 | PISA | ||
| メス | ファインサイエンスツール | 10004-13 | |
| ブレード | ファインサイエンスツール | 10015-00 | |
| トバルビタールナトリウム | ピサアグロペクアリア | ||
| 標準電極ホルダー | デビッドコップフインスツルメンツ | 1770 | |
| ステンレス鋼線 | アメリカ矯正 | 856-612 | |
| 定位固定装置 | デビッドKopfインスツルメンツ | モデル900LS | |
| 外科用はさみ | ファインサイエンスツール | 14001-12 | |
| テフロンコネクタ | Basi | MD-1510 | |
| テフロンチューブ | Basi | MF-5164 | |
| テトロドトキシン | Alomoneラボ | T-500 | |
| 気化器 | ケント科学 | VetFlo |
参考文献
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. Conn, M., Freeman, E.....
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再版と許可
