方法論記事

外傷性脳損傷に対する神経炎症および血行動態応答のシステム解析

DOI：

10.3791/61504

⸱

2022年5月27日

 ,  ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、軽度の外傷性脳損傷に対する神経炎症性および血行力学的応答を特徴付け、部分最小二乗回帰を用いた多変量系分析の一部としてこれらのデータを統合する方法を提示する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

軽度の外傷性脳損傷(mTBI)は、重大な公衆衛生上の問題である。mTBIへの反復曝露は、累積的で長期的な機能的欠損につながる可能性がある。私たちのグループや他のグループによる多くの研究は、mTBIがサイトカイン発現を刺激し、ミクログリアを活性化し、脳血流と代謝を減少させ、脳血管反応性を損なうことを示しています。さらに、いくつかの研究は、これらの神経炎症および血行動態マーカーにおける狂乱と認知障害との関連を報告している。本明細書では、マウスにおけるmTBIに対する神経炎症性および血行動態組織応答を特徴付ける方法を詳述する。具体的には、mTBIの重量減少モデルを実行する方法、びまん性相関分光法と呼ばれる非侵襲的光学技術を用いて脳血流を縦方向に測定する方法、およびミクログリアおよび他の神経免疫細胞の活性に応答し調節するサイトカインおよび免疫調節リンタンパク質(例えば、MAPKおよびNFκB経路内)を定量するために、脳組織サンプルに対してルミネックス多重免疫アッセイを実行する方法について説明する。最後に、多変量システム分析アプローチを使用してこれらのデータを統合して、これらすべての変数間の関係を理解する方法を詳しく説明します。これらの生理学的変数と分子変数の関係を理解することで、最終的にはmTBIの原因となるメカニズムを同定することができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

概要
軽度の外傷性脳損傷(mTBI)は、年間約160万人から380万人のアスリートに影響を与えます1.副脳震盪および脳震盪傷害を含むこれらの傷害は、患者に一時的な身体的、感情的、心理的および認知的症状を残す可能性がある2。さらに、「脆弱性の窓」内で持続する反復的なmTBI(rmTBI)は、単一のmTBI単独の影響よりも長く続く認知的結果の累積的な重症度および持続時間をもたらし得3、そして最終的には機能の永久的な喪失につながることさえある4,5,6。多くの患者は比較的短い時間枠(<1週間)内に回復するが、患者の10〜40%はmTBIのより長い持続効果に1ヶ月>苦しみ、一部は1年まで持続する3、7、8、9。これらの傷害の高い有病率および永続的な結果にもかかわらず、傷害メカニズムはほとんど理解されてお....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物の手順は、エモリー大学施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドラインに従っています。

1. 軽度外傷性脳損傷の体重減少モデル

  1. ウェイトドロップ設定を準備します。1 mのガイドチューブ(内径2.54 cm)を垂直に揃えて平らな面に万力を取り付けます(レベルを使用して確認してください)。衝撃には54gボルト(本体基本直径0.95cm、頭部径2cm、長さ10.2cm)を使用してください。
  2. マウスに簡単に麻酔をかける。マウスを100%酸素中の4.5%イソフルランで45秒間誘導する。つま先のピンチ反応がないことで十分な深さの麻酔を確認する。
  3. 怪我を誘発する。
    1. マウスを麻酔から急速に取り除き、マウスを薄い膜(11.2 cm x 21.3 cm組織)の中心に置きます。
    2. 両手を使って、マウスが中央にかかりやすい状態で組織を緊張させます。マウスの尻尾を親指で固定します。マウスヘッドをガイドチューブの下に置きます(図2)。
    3. ガイドチューブの上部からマウスの頭の背側側面にボルトを落とし、目の後ろと耳の前面の間の衝撃を狙います。衝撃を受けると、マウスは組織に浸透し、首の周りの頭の急速な加速を可能にします(図2<....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以前に収集されたデータは、8匹のC57BL/6マウスのグループが1日1回間隔をあけて3つの閉鎖頭部外傷(図2)を受けた以前の研究から採取された11。この作業において、脳血流は、最後の傷害の4時間後にびまん性相関分光法を用いて測定した(図3、 図4)。傷害後のCBF評価後、動物を安楽死させ、免疫学的測定法によるサイトカインおよびリンタンパク質の定量のために脳組織を抽出した(図5)。また、ウエスタンブロットを介して貪食細胞/ミクログリア活性化マーカーIba1を定量した(11に記載の方法)。各マウス由来の脳組織を溶解し、BCAアッセイを用いて総タンパク質濃度を測定した。多重化サイトカイン定量は、ルミネックスMAGPIXシステムを用いて読み取られたミリプレックスMAPマウスサイトカイン/ケモカイン32-プレックスを.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本明細書では、反復的な軽度の外傷性脳損傷に対する血行動態および神経炎症反応の評価方法を詳述する。さらに、偏最小二乗回帰を使用した多変量システム分析の一部としてこれらのデータを統合する方法を示しました。以下のテキストでは、プロトコルに関連する重要な手順と制限事項のいくつか、および既存の方法に対する方法の長所/短所について説明します。

軽度の外傷性脳損傷の体重減少モデル。外傷性脳損傷誘発のこの方法は、スポーツ関連の頭部外傷において一般的に見られる急速な前後回転加速に続く鈍い衝撃を特徴とする点で有利である10,19。確かに、唐生脳マウスの脳は、ジャイロケファリックな人間の脳の複雑さを完全には再現していません。それにもかかわらず、このモデルは、反復傷害を伴う空間学習および記憶の持続的な欠損を含む、ヒトmTBIの同じ臨床的および行動的後遺症の多くを誘発する。さらに、その影響は本質的に軽度であるが(構造的/ニューロン的損傷なし、血液脳関門透過性.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロジェクトは、国立衛生研究所R21 NS104801(EMB)およびR01 NS115994(LBW / EB)およびアトランタジュニア教員フォーカスアワード(EMB)の小児医療によって支援されました。この研究は、米国国防総省によって、議会が指示する医学研究プログラムを通じて、賞番号の下でも支援されました。W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB).意見、解釈、結論および勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されるものではありません。この資料は、助成金番号1937971の下で国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムによって支援された研究に基づいています。本資料に記載されている意見、所見、結論または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映するものではありません。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
調整可能なピペット任意の調整可能なピペット
アルミホイVWR89107-726
Bio-Plex 細胞溶解キットC バイオ・ラッド171304012
ブランドプレート pureGrade マイクロプレート、非滅菌BrandTech781602 96
完全ミニプロテアーゼ阻害剤錠剤Sigma-Aldrich11836153001
脱毛クリームアマゾンナイール
DiH2OVWRVWRL0200-1000
96 ウェル平底板用ハンドヘルド磁気セパレーターブロック ミリポア シグマ カタログ40-285
ハードウェア オートコレクター ボードwww.correlator.comFlex05-8ch
イソフルラン 250 mLMED-VET INTERNATIONALRXISO-250
キムワイプ (11.2 x 21.3 cm)VWR21905-026
実験室用ボルテックスミキサーVWR10153-838
LabViewナショナルインスツルメンツLabVIEW
Luminex 200、HTS、FLEXMAP 3D、またはMAGPIX xPONENTソフトウェア搭載Luminex Corporation
Luminex Drive FluidLuminexMPXDF-4PK
Luminex シース液EMD ミリポアシース液
ミリプレックス MAP マウスサイトカイン/ケモカイン 磁気ビーズパネル - プレミックス 32 プレックス - 免疫学マルチプレックスアッセイミリポアシグマMCYTMAG-70K-PX32
ミリプレックス MAPK/SAPK シグナリング 10-Plex キットセル シグナリング マルチプレックスアッセイミリポアシグマ48-660MAG
Mini LabRoller ローテーターVWR10136-084
フッ化フェニルメチルスルホニルSigma-AldrichP7626-1G
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)VWR97064-158
プレート シーラーVWR82050-992
ポリプロピレン マイクロフュージ チューブVWR20901-547
ミニ LabRollerミリポア シグマZ674591
試薬リザーバーVWR89094-668
Rプログラミング言語RStudio
www.rstudio.com>
sonicator
力価プレートシェーカーVWR12620-926Tween20
グマアルドリッチP9416-50ML
1mアクリルガイドチューブMcMaster-Carr49035K85
4 光子計数雪崩フォトダイオードPerkin-ElmerSPCM-AQ4C-IO
400 um マルチモード ソース ファイバーThorlabs Inc.FT-400-EMT
54 g ボルトエース ハードウェア本体基本径 0.95 cm 本体径 2 cm ヘッド径 10.2 cm 長さ
780 nm シングルモード検出器ファイバーThorlabs Inc.780HP
852 nm長コヒーレンス長レーザーTOPTICA PhotonicsiBeam smart
ル シ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
  2. Iraji, A., et al.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

Luminex

関連記事