このプロトコルでは、蛍光活性化細胞選別(FACS)のための骨細胞調製に加えて、新生児dmp1-topazマウス頭蓋冠の解剖と、細胞消化と分画による緑色蛍光タンパク質を発現する骨細胞の単離について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
骨細胞は、かつては機械的負荷を感知する舞台裏の機能を与えられて骨の受動的な常駐であると考えられていましたが、今では脚光を浴びており、細胞外マトリックスを積極的に修飾し、それを囲むラクノカナキュラー系で内分泌器官を形成し、離れた部位にメッセージを送信するなど、複数の主要な機能を持っていることが示されています。初代骨細胞を単離して骨細胞様細胞株までin vitroで骨細胞を試験することが可能になった方法のおかげで、骨細胞は現在、構造と機能に関する大きな関心と知識の急増を経験しています。骨細胞の生物学や他の分子成分との相互作用の多くの側面はまだ発見されていません。このプロトコルでは、骨細胞で緑色蛍光タンパク質を発現するdmp1-topaz新生児マウス頭蓋冠からの初代骨細胞の効率的な単離について、細胞分画とその後のFACSによる初代骨細胞の培養の取得によって詳細に説明します。
概要
骨細胞は、それらの分泌マトリックス1に埋め込まれるようになった骨芽細胞前駆細胞からの最終分化細胞である。それらは骨細胞集団の中で最も豊富で最も長生きする細胞です。それらは裂孔内に存在し、樹状突起が小管と呼ばれるチャネルを通って伸びる特徴的な星状形態を有し、周囲の環境および骨表面との通信および代謝交換の広範なネットワークを形成する2。骨細胞は、骨リモデリングにおける骨芽細胞および破骨細胞の両方の役割を振り付け、それらは機械的負荷3への適応を付与する主要な機械感覚細胞であり、リン酸恒常性4 および骨基質石灰化5に関与し、ラクノカナリキュラー系とともに、遠方組織6にシグナル伝達する内分泌器官として作用する。
骨細胞は石灰化マトリックス内に位置するため、アクセスが制限され、単離が困難になり、in vitro調査が妨げられます。最初の単離方法の1つは、後にPHEX(X染色体上のエンドペプチダーゼと相同性を有するPHosphate調節遺伝子)8の鳥変異体であることが知られる骨細胞特異的モノクローナル抗体(OB7.3)7
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プロトコル
すべての動物の手順と動物の世話は、東北大学の規則と規則に従って行われました。
1. 新生児dmp1-トパーズマウス頭蓋冠の解剖
- このプロトコルでは、C57BL/6-Tg(Dmp1-トパーズ)1Ikal/Jマウスの6〜6日齢の子犬を使用します。5%イソフルラン吸入でマウスを安楽死させ、次に子犬を70%エタノールに移します。
- 安楽死させた子犬を未処理の培養皿に移します。
- はさみとピンセットを使用して、頭蓋骨の付け根の皮膚をつかみ、切開します。
- 最初の切開を出発点として、耳の前の頭蓋骨の両側を切り取り、皮膚を取り除き、頭蓋冠を露出させます。
- 鼻梁から頭を持ち、ラムドイド縫合糸に沿って頭蓋冠を切ります。頭頂骨の外側の縁に沿って切り、前部を含むように伸ばします。
- 下にある脳組織から頭蓋冠を分離します。
注意: 軟部組織の付着を最小限に抑えたきれいな骨の頭蓋冠を確保するために、骨の奥深くまで切り込まないでください。参考までに、骨の下のハサミの影が見えるはずです。 - 頭蓋冠をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、プロトコル全体でpH 7.4)に移します。凹面部分が上を向いていることを確認してください。
2. 新生マウス頭蓋冠の分画
- 5 mLの2 mg/mLコラゲナーゼ溶....
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結果
このプロトコルの目的は、dmp1-topaz新生児マウス頭蓋冠から初代骨細胞の培養物を得るプロセスを実証することです コラゲナーゼを使用してコラーゲンマトリックスを分解し、EDTAを使用してカルシウムキレート化を行う分画プロセスを通じて、その後、FACS用に細胞を調製して骨細胞を他の細胞集団から分離します。
新生児マウス頭蓋冠から初代骨細胞を得るための方法は、しばしば選別のための画分(1〜128)の使用を説明する23。この方法の効率をテストするために、画分1から8までの1つのdmp1-topazマウス頭蓋冠から得られた骨細胞の収量を比較しました。画分1〜128を別々に選別して、各画分からの骨細胞の割合および収量を決定した。選別後、96ウェルプレート上で骨細胞を24時間培養し、播種した細胞の密度を比較した。画分2〜125の骨細胞の密度は画分1よりも高く、画分6、7、8では骨細胞の密度が著しく減少し始めます(図1A)。
すべ.......
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ディスカッション
最初に単離された骨細胞は、(OB7.3)またはPHEXの鳥類変異体を使用して単離されたニワトリ頭蓋冠7 からのものでした。しかしながら、この方法は、種特異的でもある骨細胞特異的抗体を製造しなければならないので、実行可能な抗体の利用可能性によって制限される。研究者らは、マウスおよびラットの長骨から骨細胞を得るために、連続酵素プロセスの異なる改変を使用した。これらの培養物の報告された純度は約70%9に設定されました。creマウスモデルの開発により、表面にGFPを発現する骨細胞を改変することが可能になりました。このマウスモデルは、FACSと共に、初代骨細胞20の純粋な培養物を得るために使用された。
画分1および画分6〜6〜28は、これらの画分で少量の骨細胞が剥がれるため、使用を省略します。画分2〜2〜5を使用すると、最短の処理時間で骨細胞の可能な限り最高の収量が得られます。これにより、骨細胞の取り扱い時間が制限され、分画中に細胞が受けるストレスの.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
本研究の一部は、日本学術振興会のJSPS科研費(日本学術振興会)の助成を受けて行われました(第19K10397号、第18K09862号)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BD FACSDiva ソフトウェア | BD Biosciences | データ収集と分析 | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μmナイロンメッシュ。 |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| コラゲナーゼ | 和光、大阪、日本 | 034-22363 | 0.2% (w/v), C. histolyticumから供給される粗コラゲナーゼ混合物。 |
| EDTA | 同人堂、熊本 | 5mM EDTA 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal wevine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| アイソレーションバッファー | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM ソルビトール, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) グルコースおよび 25 mM HEPES | ||
| Millex 滅菌フィルターユニット | メルクミリポア、アイルランド | SLGV033RS | 0.22μm |
| ナイロンセルストレーナー | FALCON, NY, US | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| &α;-MEM | Wako, Osaka, Japan | 10% Fetal Bovine serum, 100 IU/ml Penicillin G, and 100 μg/ml ストレプトマイシン |
参考文献
- Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
- Bonewald, L. F. Osteocy....
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再版と許可
