植物における空間的および時間的組織特異的な遺伝子発現解析のためのレーザー捕捉マイクロ解離RNAシーケンシング

Summary

ここに示されているのが、植物組織のレーザー捕捉マイクロ解剖(LCM)のプロトコルです。LCMは、汚染のない方法で組織の領域を単離するための顕微鏡的な技術です。手順は、組織固定、パラフィン埋め込み、切片、LCMおよびRNA抽出を含む。RNAは、下流組織特異的な、一時的に分解されたトランスクリプトムの分析に使用される。

Abstract

複雑な多細胞生物の開発は、異なる転写プロファイルを有する異なる細胞タイプによって支配される。発達過程を支配する転写調節ネットワークを同定するには、これらの個々の細胞タイプの空間的および時間的遺伝子発現プロファイルを測定する必要がある。したがって、生物学的および発達過程がどのように調節されているかを理解するためには、遺伝子発現の時空間的制御に関する洞察が不可欠である。ここでは、発芽中の時間経過に伴い、少量の細胞を3つの大麦胚器官から分離し、転写プロファイリングを行うレーザー捕捉マイクロ解剖(LCM)法について述べた。この方法は、組織固定、組織処理、パラフィン埋め込み、切片、LCMおよびRNA抽出に続いて、リアルタイムPCRまたはRNA-seqで構成されています。この方法により、さまざまな数の細胞(数十~数百)から種子臓器転写体の空間的および時間的プロファイルを取得することができ、典型的なバルク組織分析よりもはるかに大きな組織特異性を提供することができました。これらのデータから、転写調節ネットワークを定義および比較し、個々の組織の候補調節転写因子を予測することができました。この方法は、最小限の最適化で他の植物組織に適用できる必要があります。

Introduction

植物の開発と成長は、複雑な細胞環境に存在する異なる細胞内の転写調節ネットワークの協調作用を伴う。これらの制御ネットワークの活動を理解するためには、発達段階を越えた異なる細胞型における空間的および時間的遺伝子発現に関する知識が必要である。しかし、遺伝子発現の分析は、少数の細胞を隔離して分析するという技術的な課題により、臓器全体またはバルク組織サンプルでより一般的に行われます。ここで説明する方法により、LCMとRNA-seqを結合させることにより、空間的および時間的組織特異的な転写法を得ることが可能になった。

LCMは20年前にエマート・バックと同僚によって開発されました¹.この技術により、研究者は狭いビームレーザー¹による直接的な顕微鏡的視覚化と操作を使用して、単一細胞または細胞のクラスターを環境から正確に分離することができました。それ以来、この方法は癌生物学と病理^22,3において広く用^いられている。多くの植物研究グループはまた、異なる植物種と異なる組織^,,タイプ^{44、5、6、7、8、9、10、115,6,7,8}で使用するためにLCM^10を11適応させました。⁹最近では、いくつかの論文はまた、種子の発達と発芽^{10、12、13,12}の間に胚、胚および他の種子構造を研究するために、ユージコットおよびモノコット種子にLCM^を13使用している。マイクロピペット、細胞選別、磁気分離、マイクロ流体プラットフォームなどの他の一般的に使用される単細胞分離法のほとんどは、細胞を解離するために酵素消化または機械的均質化に依存します。これは、遺伝子発現を摂動させ、データ解釈^14,15,15を混乱させる技術的なアーティファクトを導入する。これらの方法では、解き分けされた細胞を空間的位置と真の細胞タイプに関連付けるために、各細胞タイプのマーカー遺伝子に関する以前の知識も必要です。さらなる一群の技術は、例えばINTACT(細胞型でタグ付き核の単離)およびTRAP(リボソーム親和性精製の翻訳^)16,17,17など、細胞全体の代わりに細胞内構造の親和性に基づく単離に依存する。しかし、原子核やリボソームの親和性の標識と精製は、確立された変換プロトコルを持たない植物種では技術的に困難です。LCMは、正常な組織/器官コンテキスト内の細胞を直接可視化することによって、迅速な組織固定を利用して転写レベルおよび従来の組織学的同定を維持し、離散細胞を短期間^18、19,19で単離することを可能にする。

ここで提示されるプロトコルは、特定の細胞または細胞タイプを穀物種子の組織セクションから分離するための最適化された方法であり、組織学的に同定できるほとんどの細胞に適用することができる。LCMは細胞の分離の接触のない方法を提供し、汚染を大幅に減らし、回収されたRNAの完全性を高める。さらに、この方法は、少量の生物材料から始まる大規模ゲノムワイド研究におけるLCMの力を示す。また、下流転写/転写分析のための十分な入力材料を生成するためのRNAの線形増幅についても説明する。

このLCM RNA-seqプロトコルには、組織サンプルの固定、脱水、パラフィン浸潤、埋め込み、切除、LCM、RNA抽出、RNA増幅、RNA定量およびqRT-PCRおよび/またはRNA-セク法を含む、空間的および時間的組織特異的な転写術のための10の主要なステップがある(図1)。

図1:LCMのフローチャートに続いてRNA-seqまたはqRT-PCRが続く。LCMは、顕微鏡の視覚化の下でレーザービームを使用して固定組織セクションから細胞を収集する空間的に正確で、接触のない技術です。このプロセスは、組織サンプルの固定から始まり、次いでエタノールとキシレンの勾配シリーズを用いた脱水を行い、パラフィン浸潤で終了する。プロセスはティッシュのプロセッサを使用して完全に自動化することができる。組織にパラフィンを浸透させたら、埋め込みステーションを使用して溶融パラフィンを用いた型に埋め込まれる。断面化は、所望の厚さに設定されたミクロトームを用いて行われる。スライドは、RNAが捕捉された細胞から抽出される直前に調製され、LCMを行う。RNA抽出は、qRT-PCRおよび/またはRNA-セクの前に2ラウンドのRNA増幅を直接行います。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

最終製品はRNAであるため、RNasesでの作業を汚染しないように注意してください。手袋を着用することは必須です。ジエチルパイロカーボネート(DEPC)-処理水、緩衝液などを使用してください。オートクレーブバッファーとベークガラス製品を使用する前に。

1. 組織固定

1. 種や組織の種類に応じて選択の固定剤を準備します。大麦種子の, 使用ファーマーズ固定剤 (75% エタノール, 25% 氷酢酸 (v/v)).
2. 組織を収穫する前に氷の上で固定剤を冷やしてください。
3. 目的の植物材料を収集し、必要に応じて、選択した埋め込み金型に収まるように適切なサイズの部分にそれを解剖します。大麦の種子の場合は、固定溶液の浸透を助け、埋め込み型に収まるように、種子を半分の縦方向に切ります。
4. 組織を氷冷固定液の少なくとも10倍の体積に沈めます。大麦の種子の場合は、セクキュアに半分に切った種子を水没します。
5. 真空浸潤を使用して固定剤の浸透を加速します。組織は、固定剤の真空浸潤後に沈む必要があります。大麦の種子の場合は、真空浸潤の30分を使用してください。
6. 固定剤を交換し、4°Cでインキュベートして、固定剤が組織に完全に浸透できるようにします。大麦の種子については、サンプルを一晩(〜12〜16時間)インキュベートします。
   注:薄いまたは小さな組織は、組織への固定の高い拡散率のために、より短い固定時間を必要とします。
7. 固定剤から組織を取り除き、カセットに組織を移し、組織処理を開始します。
   注:葉のティッシュのような小さいか壊れやすいティッシュは固定の間に損傷を与えないことを保障するために固定のためのカセットに置くことができる。生検袋、パッドまたはラップは、組織固定および組織処理工程中にカセットの内部に組織をしっかりと保持するために使用することができる。

2. 組織処理

1. ステップ 2 で、最低 10 個の溶液チャンバと 2 つの加熱パラフィンチャンバーを使用する自動組織プロセッサを使用します ( 材料表を参照)。
2. 各チャンバに十分な量の溶液があることを確認してください。ティッシュプロセッサの数回の使用の後にソリューションを交換してください。
3. カセットとティッシュを入れて金属かごに入れます。金属バスケットをチャンバー1の上のホルダーに取り付けます。ホルダーは、指定されたプログラムに従って、カセットを回転させてチャンバーに「ダンクアンドディップ」します。
4. 各チャンバの時間の長さを設定する必要がある組織プロセッサのコントロールパネル上のボタンクリックを実行することにより、プログラムを設定します。
5. [開始] ボタンを押して、処理プログラムを開始します。次のプログラムは大麦の種子のために設計され、一晩実行されます (〜18 時間)
   1. カセットをエタノールの勾配シリーズ(75%、85%、100%、100%、100%エタノール)でそれぞれ1時間30分間浸漬して脱水を行います。
   2. エタノールを使用してクリアを行う:75:25、50:50、25:75(エタノール:キシレン%、v/v)でそれぞれ1時間30分間のキシレン勾配。その後、カセットを100%キシレンをそれぞれ1時間30分間浸し、100%キシレンを浸します。
   3. 溶融パラフィンで1時間30分間55〜60°Cでパラフィン浸潤を行います。
      注:パラフィンヒーターチャンバーの温度は、ティッシュプロセッサの背面に設定することができます。
6. 翌朝、カセットを組織処理装置から取り出し、パラフィン埋め込みに進みます。
   メモ:プログラムの時間は、異なる組織の種類によって異なる場合があります。真空および/または攪拌は、組織処理のコントロールパネルの「V」および/または「攪拌」ボタンを押すことによって、選択した溶液の浸潤を加速するために、組織処理中に使用することができます。

3. パラフィン埋め込み

1. この手順では、埋め込みマシンを使用します (「 資料表」を参照)。
2. 埋め込み機は、埋め込み前に少なくとも数時間前にオンにして、貯水池のパラフィンが完全に溶ける時間を確保するように設定します。
3. 始める前に冷たいプレートをオンにします。
4. サンプルを細かい鉗子で固定し、溶融パラフィンを金型に分配することで、サンプルを金型に埋め込みます。実験目的ごとにサンプルの適切な向きを確認します。大麦シードの場合、シード縦方向を切断方向に向けて縦断面を得る。
   注: 埋め込み金型のサイズは異なります。サンプルを適切に配置して埋め込むには、適切なサイズを選択します。サンプルの向きは、実験のニーズに応じて考慮する必要があります。縦方向のセクションが必要な場合、サンプルは切断方向に縦方向に向け、横断セクションではサンプルを切断方向に平行に向ける必要があります。
5. カセットをカセットに入れるため、カセット全体を十分に覆う十分なパラフィンを金型に置きます。
6. 金型をコールドプレートに置き、パラフィンを完全に(10〜20分)セットしてから、ブロックを金型から解放します。
7. 切り離しに進むか、4 °Cに保管のためにブロックを移します。
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。埋め込みブロックは、最大3ヶ月間4°Cで保存することができます。

4. ポリエチレンナフタレート(PEN)膜スライドの調製

1. 3 sのRNase不活性化溶液に沈むPEN膜スライドは、スライド上のRNasesを除去するためにDEPC処理水中に2回の短いスリングが続きます。37°Cインキュベーターでスライドを乾燥させて、残った溶液を取り除きます。
2. 30分間の層流キャビネットにUVランプを使用してスライドをUV処理し、パラフィン接着性を向上させる親水性特性を高めます。

5. 断面化

1. 断面化のステップでミクロトームを使用します (「 材料表」を参照)。
2. ナイフホルダーに新しい刃を入れ、積極的に切断しないときには常にナイフをガードしてください
   注意:ミクロトームブレードは非常に鋭く、不適切に取り扱うと重大な損害を引き起こす可能性があります。
   メモ:ミクロトームには2つのロック機構があり、1つは機械の側面にあり、もう1つは車輪のハンドルにあります。どちらも積極的に断面化していない場合に従事する予定です。
3. ナイフブロックを、触れることなくできるだけサンプルに近づけるように調整します。マイクロトームアームがマイクロトームに壊滅的な構造的損傷を引き起こすので、マイクロトームアームがナイフブロックに完全に接触しないようにしてください。
4. 始める前に冷たいプレートをオンにします。切り離し前にパラフィンブロックを冷たいプレートに保管し、切り離し時に必要に応じてブロックを再冷却してブロックが柔らかくなるのを防ぎます。
5. DEPC処理水で水浴を満たし、開始する前に42°Cに加熱します。
6. ミクロトームを使用して、希望の深さ(興味のあるセクション)にブロックをトリミングし、希望の厚み(6〜10 μm)でパラフィンブロックを切ります。よく切り離されたブロックは、ブレードの端に「リボン」を形成します。大麦シードの場合、8 μmの厚さのセクション。
7. 細かい塗料ブラシや細かい鉗子を使用して、マイクロトームからウォーターバスにリボンを穏やかに移し、リボンが水面に平らであることを確認します。
8. 上向きの動きを使用して、45°の角度でスライドを保持し、スライドに水からリボンを持ち上げ、慎重に糸くずのない組織で余分な水を除去します。
9. 37°Cで30分間ドライスライドし、パラフィンの下の残りの水を除去します。
10. 脱水状態で閉じた箱に4°Cでパラフィン除去または保存に進みます(数日以内に使用します)。
11. スライド3xをキシレンで20sずつ洗浄し、続いて30sの2x洗浄を100%(v/v)エタノールで20s、30sの2x洗浄を70%(v/v)エタノールで除去します。
12. パラフィンを取り除いた後、すぐにレーザー捕捉マイクロディシスセクションに進みます。
    注意: 凍結断面は LCM と正常に結合された別の方法です。凍結切除のサンプル準備は異なります。

6. レーザーキャプチャマイクロディシブ

1. レーザーキャプチャマイクロディスセクション顕微鏡( 材料表を参照)を使用して、脱パラフィン化および乾燥組織切片から細胞をマイクロディス分離します。
2. 3 つの使用可能なスロットにスライドをロードします。
3. 収集サンプルを収集するために、収集管の特殊な接着剤キャップを使用してください。液体(乾燥した」コレクション)なしで捕獲することはRNase活動を最小にする。使用可能なスロットにコレクションチューブをロードします。
4. ステージを移動して、切り取る必要があるサンプルの領域を見つけます。これは、LCMマシンのマウスまたはジョイスティック、またはキーボードの矢印キーを使用して行うことができます。
5. 切断速度、切断エネルギーと焦点、レーザー圧カタパルト(LPC)エネルギーとフォーカスを最適化するために、最初に膜スライド上の組織のない空白のセグメントに切断します。大麦シードの場合、切削速度= 18、カットエネルギー = 52 カットフォーカス = 63、LPCEnergy = 78、LPC フォーカス = 10 倍倍率で 61。
   注:カットフォーカスとエネルギーは、異なるスライド、異なる組織、および捕獲領域のために調整する必要がありますが、一般的なルールは、カタパルト力が切断力よりも高く、レーザーはカタパルトのために焦点を外す必要があります。対物レンズの倍率が高いほど、レーザーの焦点が小さくなり、エネルギーが高くなります。
6. [描画] ツールを使用して、対象領域のアウトラインを使用してセルを選択します。
7. 上記の黒いセグメントをカットして得られた最適化されたパラメータに基づいて、接着キャップに細胞をカタパルトする機能ツールバーから RoboLPC機能 を選択します。
   注:LCMパラメータは、組織の種類だけでなく、セクションの厚さ、組織硬度および対物レンズの間で異なります。したがって、実際のサンプルを切断する前に、組織標本のない平野膜領域上の各スライドを最適化することが最善です。
8. [フラグ] ツールを使用して、要素リストからそのフラグを選択して、関心のある領域をすぐに見つける領域をマークします。
9. 「CapCheck」ボタンで確認し、接着剤のキャップを検査してサンプルが取り込まれたことを確認します。典型的には、1キャップあたり10〜15セクション(〜200細胞)のLCMがRNA抽出に必要とされる。
10. 捕獲したサンプルを氷の上に置いておきなさい。RNAの分解を避けるために、すぐにRNA抽出に進みます。
    注意:一部のLCM顕微鏡は蛍光灯を備え、蛍光マーカーで標識された細胞を捕捉することができます。

7. RNA抽出

1. LCM後のRNA抽出には、低入力RNA分離( 材料表を参照)キットを使用してください。このようなキットは、10個未満の細胞から一貫して高品質の総RNAを回収するように設計されています。
2. オンカラムDNase処理を含むメーカーの指示に従って、キャプチャされた細胞タイプから総RNAを分離します。
   注: チューブが反転してフリックされる RNA 抽出の最初のステップは、蓋のキャプチャされたサンプルが、追加された抽出バッファーと接触していることを確認するために重要です。

8. RNA増幅

1. インビトロ転写によって抽出されたRNAからaRNA増幅用のアンチセンスRNA(aRNA)増幅キット (材料表を参照) を使用して、RNA-seqライブラリ合成に十分なaRNAを生成します。
2. メーカーの指示に従ってaRNA増幅キットを使用して2ラウンドの増幅を行います。
   メモ:サーモサイクラーと蓋を、キットの指示温度( 材料表を参照)のメーカーに予熱することが重要です。RNA増幅の代わりに別のアプローチは、抽出されたRNAから直接ライブラリを合成するために低入力ライブラリ調製キットを使用することです。

9. RNA定量

1. 自動電気泳動システムを使用してaRNAを定量化し、修飾します( 材料表を参照)。
   注:自動化された電気泳動システムは、必要なサンプル(1~2 μL)が少なく、個々のサンプルにゲル状の画像とエレクトロフェログラムを提供するため、好ましいです。

10. qRT-PCRおよび/またはRNA-セク

1. qRT-PCR 用の aRNA から cDNA を合成するか、標準の RNA-seq ライブラリ キットを使用して RNA-seq ライブラリを作成します。

Results

LCM RNA-seq プロトコル¹⁰を使用して、発芽中に大麦の種子から空間的および時間的組織特異的な転写を生成しました。この研究は、発芽中の48時間の時間経過(0-48時間、7時間ポイント)にわたって、3つの胚器官(プルプル、ラジクル先端、スクテル)からの少数の細胞にLCM RNA-seqを適用することによって行われた(図2A,B)。

図2:LCMによって大麦の種子から採取された細胞。(A) 大麦の種の縦断面と、細胞が捕獲された領域を示す拡大漫画。青 = プルル、マゼンタ = ラディクル、緑 = スクテルム。(B

Discussion

多くの組織特異的遺伝子発現研究は、時間がかかり、労働集約的であるサンプルの手による解剖によって制限されており、汚染のリスクが高く、人間の手術者が収穫に十分に器用であるサンプルのみを利用することができます。LCMは顕微鏡視覚化の下で機械操作のレーザービームを使用して固定組織セクションから細胞を集める精密で、無接触の技術である。

LCM では、サンプルの準備が重要です。このプロセスは、組織形態とRNAの完全性とのバランスを良好に保つために、サンプルの適切な固定と埋め込みに依存しています。ここに示すプロトコルは、より長い固定時間と固定剤の真空浸潤を含む大麦種子のための最適化された固定および埋め込みステップを提供する。異なる組織や種の分析は、通常、組織間で異なるように、条件の最適化を必要とします。このプロトコルのもう一つの重要な側面は、RNA-seqライブラリ構築のために十分な量のRNAが生成されることを保証するRNA増幅ステップです。RNA増幅は高品質のライブラリを生じるが、代わりに低い入力ライブラリ調製方法が²⁵を採用するかもしれないこと...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
酢酸100%ACS / R。	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 opaque	Zeiss	415190-9181-000
クリアベースモールド 8 X 10	ライカ	3803015
ジエチルピロカーボネート	Sigma-Aldrich	40718-25ML
高感度 RNA ScreenTape	Agilent	5067-5579
低 & 恥ずかしがり屋;プロファイル表示ブレード DB80LS	ライカ	14035843489
MembraneSlide 1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000
MessageAmp II aRNA Amplification Kit	Ambion (ThermoFisher)	AMB17515
On-Column DNase I Digestion Set	Sigma-Aldrich	DNASE70
Ovation RNA-Seq System V2	NuGen (Integrated Science)	7102-08
パラフィン(Surgipath Paraplast)	Leica	39601006
PicoPure RNA Isolation Kit	ABI (ThermoFisher)	KIT0214
RNaseZap RNase Demaintenance	Solution Ambion (ThermoFisher)	AM9780
Xylene	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC28975.360
Leica Benchtop Tissue Processor	Leica Biosystems	TP1020
ライカ 加熱パラフィン埋め込みモジュール	ライカバイオシステム	EG1150H
ライカコールドプレート	ライカバイオシステムズ	EG1150C
Safemate クラス2 生物学的安全キャビネット	LAF Technologies Pty Ltd	Safemate 1.5
ライカ全自動ロータリーミクロトーム	ライカバイオシステム	RM2265	PALMRobo v 4.6 ソフトウェア
ツァイス PALM マイクロビーム LCMシステム	ツァイス ミスクロスコピー
TapeStation	Agilent	TapeStation 2200