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方法論記事

凍結と飛行行動を研究する新しいパブロビアン恐怖コンディショニングパラダイム

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DOI:

10.3791/61536

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2021年1月5日

 , 
1Department of Psychology, Tulane University, 2Tulane Brain Institute, Tulane University

この記事について

サマリー

防御的な行動応答は、脅威の強度、近接性、および暴露のコンテキストに依存します。これらの要因に基づいて、個々の被験者内の条件付き凍結と飛行行動の間の明確な移行を引き出す古典的なコンディショニングパラダイムを開発しました。このモデルは、不安、パニック、心的外傷後ストレス障害に関与する病理を理解するために重要です。

要約

恐怖と不安関連の行動は、生物の生存に大きく寄与する。しかし、知覚された脅威に対する誇張された防御的な反応は、米国で最も一般的な精神疾患である様々な不安障害の特徴である。防御行動を担う神経生物学的メカニズムを発見することは、新たな治療介入の開発に役立つ。パブロビアン恐怖コンディショニングは、恐怖関連の学習と記憶を研究するために広く使用されている実験室のパラダイムです。伝統的なパブロビアンの恐怖コンディショニングパラダイムの主な制限は、凍結が監視される唯一の防御行動であるということです。私たちは最近、個々の被験者内の条件付き凍結と飛行(エスケープとも呼ばれる)行動の両方を研究することを可能にする修正されたパブロビアン恐怖コンディショニングパラダイムを開発しました。このモデルは、より高い強度のフットショックと、条件付き刺激と無条件刺激の間のより多くの組み合わせを採用しています。さらに、この条件付き飛行パラダイムは、純粋なトーンとホワイトノイズ聴覚刺激の連続提示を条件付き刺激として利用する。このパラダイムのコンディショニングに続いて、マウスはトーン刺激に応答して凍結行動を示し、ホワイトノイズ中の飛行応答を示す。このコンディショニングモデルは、生存に必要な行動応答間の迅速かつ柔軟な遷移の研究に適用することができる。

概要

恐怖は、即時の脅威1,2に対する進化的に保存された適応応答である。生物は脅威に対する先天的な防御的反応を持っていますが、学習された関連は、危険の刺激予測に対する適切な防御応答を引き出すために重要です3.防御応答を制御する脳回路における調節不全は、心的外傷後ストレス障害(PTSD)、パニック障害4、および特異的恐怖症5、6のような複数の衰弱性不安障害に関連する不適応反応に寄与する可能性がある。米国における不安障害の有病率は成人19.1%、青年期の31.9%である。これらの病気の負担は、個人の毎日のルーチンに非常に高く、彼らの生活の質に悪影響を及ぼします。

過去数十年にわたり、パブロビアン恐怖コンディショニングは、恐怖関連の学習と記憶9、10、11の基礎となる神経メカニズムに関する多大な洞察を得るための強力なモデルシステムとして機能してきました。パブロビアン恐怖コンディショニングは、条件付き刺激(CS、聴覚刺激など)と非調節的な無条件刺激(米国、例えば、電気的フットショック)12を組み合わせたりすることを伴う。凍結は標準的なパブロビアンコンディショニングパラダイムで呼び起こされ、測定される支配的な行動であるため、脱出/飛行応答などの積極的な防御行動の神経制御メカニズムはほとんど未踏のままです。これまでの研究では、飛行などの防御行動の異なる形態は、脅威の強度、近接性および文脈13、14に応じて呼び起こされることを示している。脳がさまざまなタイプの防御行動を制御する方法を研究することは、恐怖および不安障害で調節不全である神経細胞プロセスの理解に大きく寄与する可能性がある。

この重要なニーズに対処するために、我々は凍結15に加えて、飛行と脱出ジャンプを引き出す修正されたパブロビアンコンディショニングパラダイムを開発しました。このパラダイムでは、マウスは純粋なトーンと白いノイズからなる連続化合物刺激(SCS)で条件付けられます。強い電気フットショックとSCSをペアリングした2日間の後、マウスは、ホワイトノイズ中のトーン成分と飛行に応答して凍結を示す。条件付き凍結と飛行動作の間の行動の切り替えは、迅速かつ一貫しています。興味深いことに、マウスは、以前に提供されたフットショック(コンディショニングコンテキスト)と同じコンテキストでホワイトノイズCSが提示された場合にのみ飛行挙動を示しますが、中立的な文脈では示されません。代わりに、凍結応答は、トーンに比べてホワイトノイズに応答して凍結の有意に高いレベルで、この中立的な文脈で支配します。これは、防御応答強度を調節する際の文脈の役割と、従来の脅威調整パラダイム16,17に見られる恐怖関連の学習および記憶における文脈情報の調節的役割と一致している。このモデルでは、コンテキスト固有の方法で複数の防御動作を対象範囲内で直接比較できます。

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プロトコル

以下の手順/手順は、トゥレーン大学の施設動物管理・使用委員会の承認を受けて、制度上のガイドラインに従って実施されました。

1. マウスの準備

  1. 3~5ヶ月の間に老化した雄および/または女性の成人マウスを使用してください。本研究では、ジャクソン研究所から得られた雄型C57BL/6Jマウスを用いたが、評判の良いサプライヤーからのマウス株を使用することができる。
  2. 実験の少なくとも1週間前に、研究全体を通して12:12 hの明暗サイクルですべてのマウスを個別に収容する。マウスに食べ物や水への アクセスをアドリビタム を提供します。
  3. 光サイクル中に、すべての行動実験を行います。個々のコホート内で同じ時間にすべてのセッションを実行します。たとえば、1 日目の午前 9 時に実験を開始する場合は、実験が完了するまでその時点から開始します。

2. 教材の作成

  1. 研究のコンテキスト
    1. 実験を実行する 2 つの異なるコンテキストを選択します。
    2. 明確なプレキシグラス(直径30cm)で構成された円筒形のチャンバをコンテキストAとして、滑らかなプレキシグラスの床で使用してください。チャンバーの高さは、脱出を防ぐために十分でなければなりません(少なくとも30センチメートルの高さ)。
    3. コンテキストBの場合は、交流のフットショックを提供するために使用される電気グリッドの床と長方形のエンクロージャ(25 cm x 30 cm)を使用してください。このチャンバーの高さは非常に重要であり、少なくとも35センチメートルの高さでなければなりません。または、透明な屋根を使用します(この素材を通してビデオを録画できることを確認してください)。
      注:簡単に洗浄することができる滑らかな壁面とチャンバーを使用してください。
    4. コンテキストをクリーニングするには、別の洗浄液を使用してください。例えば、1%の酢酸を有するクリーンコンテキストAと、70%エタノールを有するコンテキストBを有する。最初のセッションを開始する前、個々のマウスをテストする前、およびその日のセッションの完了後にコンテキストをクリーンアップします。これは、以前のマウスから嗅覚の手がかりを取り除くために不可欠です。徹底的な洗浄はまた、コンディショニングセッションを損なうショックグリッド上の尿スケーリングを防ぐのに役立ちます。
      注:洗浄液は嗅覚キューとしても機能するため、特定のコンテキストで同じ洗浄液を使用します。
    5. それぞれの学習セッション中に、コンテキストAまたはコンテキストBを音減衰ボックスに配置します。
  2. オーディオジェネレーター
    1. 75 dBで聴覚刺激を提供するためにコンテキストの上にオーバーヘッドスピーカーを取り付けます。
    2. プログラム可能なオーディオジェネレータを使用して、事前に定義されたスケジュールで聴覚刺激を生成します。7.5 kHzの純粋なトーンは正弦波波形を持つ音であり、ホワイトノイズは1〜20,000 Hzの範囲の異なる周波数で等しい強度を持つランダムな信号です。
    3. TTLパルスを使用して、聴覚刺激と衝撃信号を時間的な精度で提供します。
      注:実験を開始する前に、dBメーターを使用して、各チャンバ内の取り付けられたスピーカーからの音強度出力を測定してください。
  3. ショッカー:ショッカーを0.9 mA ACショックを供給するために使用される電力網の床とショッカーを接続します。コンピュータ プログラムでの衝撃の頻度、発症、および持続時間を定義します。各 SCS の最後に各 SCS の最後に 1 秒の間、各衝撃刺激を提供し、コンディショニング セッションごとに 5 つの SCS ショックペアを合計します。

3. コンピュータプログラムとビデオトラッキングの準備

  1. ソフトウェア プログラムでコーディングを使用して動作プロトコルを生成します。
  2. プログラムでは、シリアル複合刺激SCSを定義します。この刺激は10秒の純粋なトーン(各ピップは、7.5 kHzの周波数と1 Hzのレートで500ミリ秒)と10秒のホワイトノイズ(1 Hzで500ミリップ)のシリアルプレゼンテーションです。
  3. 各試行に続いて提示される試行間間隔(ITI)を疑似ランダムに定義します。
  4. スタディ中に、すべてのマウスの動作をビデオに記録して、以降の分析を行います。
    注:市販の恐怖調節ボックスは、トップマウントカメラを介して動作を記録するために設定されていない場合があります。記録されたビデオは、動物が移動する水平方向の動き、速度、および総距離を計算するために使用されるため、これは非常に重要です。
  5. ソフトウェアトラッキングを設定するには、関連する各コンテキストにテストマウスを配置し、輪郭トラッキング感度を調整し、重心を定義します。これにより、相対位置で信頼性の高いデータを取得できます。さらに、サブジェクトにアクセスできるコンテキスト領域全体を定義します。
    注: 両方のコンテキストのコンター サイズの調整は、異なるコンテキストでの明るさの変化が輪郭のサイズを変更するので重要です。
  6. チャンバの既知のサイズと速度(cm/s)を計算するために使用できるカメラのピクセル寸法を使用して、キャリブレーション係数を決定します。
  7. データ取得コンピューターのタイムスタンプ イベントをリアルタイムの発生に同期します。

4. 行動実験

  1. コンピュータ、恐怖コンディショニングボックスコントローラ、ショッカー、ビデオとタイムスタンプの記録ソフトウェア:すべての機器をオンにします。楽器が適切な順序でオンになっていることを確認します。
  2. トーン、ホワイトノイズ、衝撃配信を含むすべての機能をチェックし、データ取得用のシステムを設定します。
  3. 動物を保管室からコンディショニングルームに運ぶ。少なくとも10分間、順応してください。
  4. 家のケージから動物を取り出し、それぞれのコンテキストにそっと置き、すぐにコンピュータプログラムをアクティブにします。
    メモ:恐怖調節システムとデータ収集(タイムスタンプ、マウス追跡、ビデオ録画)ソフトウェアの初期化は、TTLパルス仲介アクティベーションを使用して同期することができます。
  5. プレコンディショニング/プレエクスポージャー
    1. 1 日目に、対象をコンテキスト A (中立コンテキスト) に配置します。チャンバーに3分間順応し(ベースライン期間)、20の合計持続時間のSCSの4回の試験に曝露する(図1A-1B)。
    2. 90 s の平均擬似ランダム ITI (範囲 80 - 100 s) を維持します。各事前公開セッションの合計時間は 590 s です。
  6. 恐怖コンディショニング
    1. 2 日目と 3 日目に、主題をコンテキスト B に配置します。3分のベースライン期間の後、被験者を1 s,0.9 mA ACフットショックで共存する5つのペアリングにさらします。
    2. 120 s の平均擬似ランダム ITI (範囲 90 から 150 s) を維持します。各コンディショニングセッションの持続時間は合計820 sになります (図1A)。
    3. 実験の目的に応じて、4日目にマウスをリコール試験(ステップ4.7を参照)または絶滅を恐れる(ステップ4.8参照)。。
  7. 恐怖のリコール(コンテキスト依存性をテストする)
    1. 4日目に、主題をコンテキストAに配置します。3分ベースライン期間後、590s以上のフットショックのないSCSの4回の試験を提示する。
    2. 90 s の平均擬似ランダム ITI (範囲 80 - 100 s) を維持します。
  8. 恐怖の絶滅
    1. 4日目に、主題をコンテキストBに配置します。3分ベースライン期間に続いて、1910年代を超えるフットショックのないSCSの16回の試験を提示する。
    2. 90 s の平均擬似ランダム ITI (範囲 60 - 120 s) を維持します。
  9. 動物を自宅のケージに戻し、すべての動物のために手順を繰り返します。

5. 行動の定量化

  1. 自動凍結検出器のしきい値を使用して凍結動作のために記録されたビデオを実験スコアに見えない観測者にし、ピクセルの変化をフレーム単位で分析します。
    注:他のソフトウェアパッケージを使用して、2つのカメラシステムを使用して自動的に凍結を計算することもできます。また、観測者が手動で凍結動作をスコア付けすることも可能です。
  2. 呼吸に必要なもの以外は、身体の動きの完全な停止として凍結を定義します。
  3. 4本の足すべてが床から出るとスコアが跳ね上がり、垂直および/または水平の動きが生じます。
  4. マークされたファイルを、フリーズ、ジャンプ、イベントマーカーでエクスポートします。
  5. 各試行に対して、定義された期間(例えば、SCS前、トーン、ホワイトノイズの10 s期間)から関連イベント(凍結とジャンプ)を抽出します。
  6. 抽出された開始終了期間をスプレッドシート ファイルで使用して、終了時刻から開始時間をそれぞれの試用期間から差し引いて、フリーズ期間を計算します。
  7. すべての試験から凍結期間を合計して、このデータを試行的または日単位で表します。
    注:調査の目的に応じて、飛行または凍結行動は、試験セッションから任意の試行/期間から採点および計算することができます。
  8. 特定の試用期間からのジャンプの合計数を合計します。
  9. マウスの重心のフレームX-Y軸の動きによってフレームからマウス追跡座標によって生成されたファイルを抽出し、マウスの速度(cm/s)を計算します。
    注: 速度データは cm/s またはピクセル/s 形式で存在する場合があります。そのテストコンテキストのビデオで定義されたインチまたはcm/ピクセル値を使用して、ピクセル/s単位をcm / sに変換します(セクション3.6を参照してください)。
  10. フレーム移動によるフレームごとの速度データを抽出した後、ビデオのフレームレート(好ましくは30フレーム/s)に基づいて、特定のフレーム番号ブラケット内の動物の平均速度を計算します(開始時間と終了時間を30で乗算して開始フレーム数と終了フレーム番号を取得します)。
  11. 各 SCS の平均速度を 10 s プレ SCS (ベースライン、BL) の平均速度で割り、各エスケープ ジャンプ (speedCS/speedBL + # のジャンプ) に 1 ポイントを加算して、フライト スコアを計算します。したがって、フライト スコアが 1 の場合、SCS 以前の期間からのフライト動作の変化は示されません。
  12. 必要に応じて、リアーイングやグルーミングなどの他の動作に対して、ビデオを手動でスコア付けします。

6. 統計分析

  1. 統計解析ソフトウェアを用いて、統計的有意性に関するデータを分析する。すべての検定において、統計的有意性の定義はP<0.05です。
  2. シャピロ・ウィルク正規性検定(α=0.05)を使用して、正規分布のデータをチェックします。
  3. キューの効果をテストするには、適切なパラメトリック(ペア t検定)または非パラメトリック(Wilcoxon符号付きランク検定)検定を使用してペアワイズ比較を実行します。
  4. 因子の双方向相互作用を評価するには(キューX試行)、2ウェイANOVAを実行し、続いてポストホックテストを行います(例えば、ボンフェローニの多重比較テスト/Tukeyの検定)。

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結果

図 (図 1A)で説明したように、セッションは事前公開 (1 日目) から始まり、次に恐怖の調整 (2 日目と 3 日目) が続き、次に消滅または検索 (Day 4) が続きます。

曝露前(1日目)セッションにおけるSCSのプレゼンテーションは、マウスにおける飛行または凍結応答を引き出さなかった(図2A-2B)。コンディショニング中の行動分析(2日目および3日目)は、SCSのトーン成分が、SCS前の凍結と比較して有意に凍結を増強することを明らかにした(図2B,2E)。フライトスコアはセッション間で大幅に変更されました(1日目から3日目、n = 20;図 2A)。マウスは、トーンに比べてホワイトノイズキューに、より高速でジャンプが多く、したがって飛行スコアが大きいことを示しました(...

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ディスカッション

記述された音と衝撃のパラメータは、このプロトコルの重要な要素です。したがって、実験を開始する前に衝撃振幅と音圧レベルをテストすることが重要です。恐怖コンディショニング研究は、通常、70-80 dBの音圧レベルと0.1-1 mA衝撃強度18を使用します。したがって、記述されたパラメータは、伝統的な恐怖条件付けパラダイムの範囲内にあります。以前のCSのみ(フットショックなし)制御実験では、マウスの飛行や凍結応答を観察せず、15に記載したとおりに提示した場合に聴覚刺激が回避されないことを示した。80 dBを超えるホワイトノイズのdBレベルを上げると、先天的な嫌悪感を誘発する可能性があります。しかし、75dBで提示されたノイズ刺激は、マウス19における抑制された行動活性の形態でストレスを引き起こすわけではない。

SCSを構成する聴覚刺激は慎重に選択されなければならない。以前の研究では、ホワイトノイズを使用した単一CSコンディショニングは、純粋なトー...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、ルイジアナ州リージェンツ理事会(LEQSF(2018-21)-RD-A-17)と国立衛生研究所の国立 精神衛生研究所 の賞番号R01MH122561を通じて支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ニュートラルコンテクプレキシガラスシリンダー30 X 30 cm 
恐怖条件ボックスMed Associates, Inc.VFC-00825 X 30 X 35 cm寸法
オーディオジェネレータ メッド・アソシエイツ・インクANL-926 
ショッカーメッドアソシエイツ株式会社ENV-414Sステンレス製グリッド
スピーカーメッドアソシエイツ株式会社ENV-224AM純音・ホワイトノイズ対応 
C57/BL6Jジャクソン研究所、米国6643-5ヶ月齢
Cineplex ソフトウェア (エディター/スタジオ)PlexonCinePlex Studio v3.8.0ビデオ追跡および行動スコアリング分析用
MedPCソフトウェア VMed Associates, Inc.SOF-736
NeuroexplorerPlexonで採点された凍結データの抽出に使用
バージョン8分析ソフトウェア
ストマウス PlexonEditor GraphPad Prism 8 GraphPad Software, Inc.統計

参考文献

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