腫瘍内不均一性は、神経膠腫を含む腫瘍の固有の特徴である。我々は、単核RNAおよびATACシーケンシング研究のために、新鮮な凍結したグリオーマ組織から単一核を単一核に分離するために、バッファーと勾配遠心分離の組み合わせを利用するシンプルで効率的なプロトコルを開発した。
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この記事について
サマリー
要約
成人びまん性神経膠腫は、腫瘍間および腫瘍内不均一性を示す。最近まで、大規模な分子プロファイリングの大部分は、脳腫瘍の分子分類につながったバルクアプローチに焦点を当ててきた。過去5年間で、単一細胞シーケンシングアプローチは、神経膠腫のいくつかの重要な特徴を強調してきました。これらの研究の大半は、フローサイトメトリーまたは抗体ベースの分離方法を使用して単一細胞を単一細胞に分離するために新鮮な脳腫瘍標本を利用している。今後、バイオバンクからの新鮮な凍結組織サンプルを使用すると、単一細胞の用途に対する柔軟性が向上します。さらに、単一細胞分野が進むにつれて、次の課題は、腫瘍の複雑性をより良く解明するために、単一の細胞または同じサンプル調製物からマルチオミックスデータを生成することです。したがって、単核RNAシーケンシング(snRNA-seq)や、高スループットシーケンシング(snATAC-seq)を備えたトランスポサーゼ対応クロマチン用単核アッセイなどの様々な方法のデータ生成を可能にするシンプルで柔軟なプロトコルが重要になります。
10xゲノムプラットフォームのようなアクセス可能なマイクロ流体機器と結合された単一細胞分野の最近の進歩は、研究室での単一細胞の適用を促進している。脳腫瘍の不均一性を研究するために、我々は新鮮な凍結神経膠腫からの単一核の単一の分離のための強化されたプロトコルを開発した。このプロトコルは、既存の単一セルプロトコルをマージし、均質化ステップに続いて濾過およびバッファー媒介勾配遠心分離を組み合わせます。得られたサンプルは、同じ核調製物から単一の核遺伝子発現およびクロマチンのアクセシビリティデータを生成するために使用することができる純粋な単一核懸濁液である。
概要
成人で最も一般的な原発性脳腫瘍であるびまん性低悪性神経膠腫(LGG)は、大脳半球でしばしば生じる浸潤性新生物である。LGGsは腫瘍間と腫瘍内の不均一性を示し、腫瘍集団によって駆動されるだけでなく、腫瘍の発達と進行に複雑に関与する非悪性細胞によっても1、2、3、4、5を示す。
過去10年間、神経膠腫の分野でゲノムデータが集まっていました。これらのデータは、主にバルク腫瘍シーケンシング研究から来て、分子特性評価に非常に貢献している、と脳腫瘍の現在の分類5、6、7、8、9、10、11。しかし、これらの....
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プロトコル
新鮮な凍結グリオーマサンプルは、ドイツのハイデルベルクにある国立腫瘍疾患センター(NCT)組織バンクから入手した。患者材料の使用は、ハイデルベルクの医学部の機関審査委員会によって承認され、インフォームド・コンセントは、研究に含まれるすべての患者から得られました。
1. 実験準備
- 氷上または4°Cですべてのステップを実行します。
- プレチルチューブ、食器、カミソリの刃、ドウンサー、害虫を4°Cに。
- すべてのバッファを事前に準備します。これらのバッファーは室温で安定しています。滅菌濾過は、特にスクロースのために、推奨されます。ストック準備は、コルセスら19. 表 1-7 を参照してください。
- 液体窒素または-80°C冷凍庫の貯蔵からサンプルを取り出し、ステップ2.1までドライアイスに保管してください。
2. 組織解剖と解離
- 新鮮な凍結組織サンプル(10〜60mg)を冷やされたペトリ皿に移します。氷の上の小片にカミソリの刃で新鮮な凍結組織をミンチ/チョップ。
- 冷蔵1.5mLチューブに500μLの冷蔵核リシスバッファーを加えます。核ライシスバッファーを含む1.5mLチューブに組織片を入れ、Douncer(....
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結果
単一核ゲノミクスは、限られたデータとプロトコルを持つ進化分野です。単一核アッセイの結果に影響を与える重要な要因は、純粋で無傷の核の単離である。我々は、2つの公表されたプロトコル(DroNc-seqおよびOmni-ATAC-seqプロトコル)を組み合わせて、新鮮な凍結グリオーマ組織ブロックから高品質で純粋な核を比較的短時間で分離し、トランスクリプトの安定性を維持した(図1)。
イオデキサノール/スクロース勾配を用いた勾配遠心分離と共に様々な濾過ステップを使用することで、大部分の破片が廃棄された純粋な核の単離が可能となる(図2)。同じ単離核製剤は、snRNA-seqおよびsnATAC-seqの両方に使用することができる。重要なことに、使用される核は同じサンプルから得られるので、生成されたデータは、クラスターを生成し、マルチオミックスのパースペクティブ25を提供するためにSeuratなどのパッケージを使用して共同埋め込むこ.......
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ディスカッション
腫瘍内の異質性の分野は、既存の知識に挑戦し、拡大するために新しいアッセイやプラットフォームが開発され、エキサイティングな段階にあります。腫瘍内不均一性は、神経膠腫28における疾患の進行および現在の治療モダリティに対する耐性に寄与する重要な因子である。脳腫瘍に関する最近の研究は、同じ腫瘍内の細胞異質性をより良く特徴付けるために単一細胞転写およびエピゲノムアッセイを用いて、この重要な側面に焦点を当てている29、30、31、32。脳腫瘍および他の固形腫瘍における単一細胞アッセイの現在のボトルネックの1つは、新鮮な臨床検体の入手可能性である。この問題を克服するために、様々な研究は、新鮮な凍結組織からの核を使用することは、新鮮な標本に代わり、細胞異質性18、33
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
ドイツがんセンター(DKFZ)のシングルセルオープンラボ(scOpenLab)に感謝します。この研究は、ドイツのがん援助、マックス・イーダー・プログラムの助成金番号70111964(S.T.)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2-メルカプトエタノール | Σ M6250 | ||
| sub>2 | Sigma | 21115-100ML | |
| ダウンス ホモジナイザー | アクティブ モチーフ | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 15 mL 円錐形遠心分離管 | Fisher Scientific | 352096 | |
| ヨウジキサノール (別名Optiprep) | 幹細胞技術 | 07820 | |
| MACs スマートストレーナー (30 & micro;m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers(100 & マイクロ;m) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| 核分離キット: 核EZ準備 | シグマ | NUC101-1KT | |
| フェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF) | Sigma | P7626 | |
| プレセパレーションフィルター (20 & micro;m) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| ワイドボアピペットチップ(1000 & micro;L) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| ワイドボアピペットチップ(200 µL) | テモ・フィッシャー・サイエンティフィック | 2069GPK |
参考文献
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell
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再版と許可
