このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

単核RNA-seqおよびATAC-seqのための新鮮な凍結脳腫瘍からの核分離

12.9K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/61542

⸱

2020年8月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurology Clinic and National Center for Tumor Diseases, University Hospital Heidelberg, 2Bioinformatics and Omics Data Analytics, German Cancer Research Center (DKFZ), 3Clinical Cooperation Unit Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), 4Division of Experimental Neurosurgery, Department of Neurosurgery, University of Heidelberg, INF 400, Heidelberg, Germany

この記事について

サマリー

腫瘍内不均一性は、神経膠腫を含む腫瘍の固有の特徴である。我々は、単核RNAおよびATACシーケンシング研究のために、新鮮な凍結したグリオーマ組織から単一核を単一核に分離するために、バッファーと勾配遠心分離の組み合わせを利用するシンプルで効率的なプロトコルを開発した。

要約

成人びまん性神経膠腫は、腫瘍間および腫瘍内不均一性を示す。最近まで、大規模な分子プロファイリングの大部分は、脳腫瘍の分子分類につながったバルクアプローチに焦点を当ててきた。過去5年間で、単一細胞シーケンシングアプローチは、神経膠腫のいくつかの重要な特徴を強調してきました。これらの研究の大半は、フローサイトメトリーまたは抗体ベースの分離方法を使用して単一細胞を単一細胞に分離するために新鮮な脳腫瘍標本を利用している。今後、バイオバンクからの新鮮な凍結組織サンプルを使用すると、単一細胞の用途に対する柔軟性が向上します。さらに、単一細胞分野が進むにつれて、次の課題は、腫瘍の複雑性をより良く解明するために、単一の細胞または同じサンプル調製物からマルチオミックスデータを生成することです。したがって、単核RNAシーケンシング(snRNA-seq)や、高スループットシーケンシング(snATAC-seq)を備えたトランスポサーゼ対応クロマチン用単核アッセイなどの様々な方法のデータ生成を可能にするシンプルで柔軟なプロトコルが重要になります。

10xゲノムプラットフォームのようなアクセス可能なマイクロ流体機器と結合された単一細胞分野の最近の進歩は、研究室での単一細胞の適用を促進している。脳腫瘍の不均一性を研究するために、我々は新鮮な凍結神経膠腫からの単一核の単一の分離のための強化されたプロトコルを開発した。このプロトコルは、既存の単一セルプロトコルをマージし、均質化ステップに続いて濾過およびバッファー媒介勾配遠心分離を組み合わせます。得られたサンプルは、同じ核調製物から単一の核遺伝子発現およびクロマチンのアクセシビリティデータを生成するために使用することができる純粋な単一核懸濁液である。

概要

成人で最も一般的な原発性脳腫瘍であるびまん性低悪性神経膠腫(LGG)は、大脳半球でしばしば生じる浸潤性新生物である。LGGsは腫瘍間と腫瘍内の不均一性を示し、腫瘍集団によって駆動されるだけでなく、腫瘍の発達と進行に複雑に関与する非悪性細胞によっても1、2、3、4、5を示す。

過去10年間、神経膠腫の分野でゲノムデータが集まっていました。これらのデータは、主にバルク腫瘍シーケンシング研究から来て、分子特性評価に非常に貢献している、と脳腫瘍の現在の分類5、6、7、8、9、10、11。しかし、これらの研究は、神経膠腫に関連する広範な分子景観を明らかにしたにもかかわらず、治療介入に関する進歩の残念な欠如がまだある。脳腫瘍における治療抵抗性の障害の1つは、腫瘍内不均一性である。この問題に対処するために、様々な研究は、ゲノム、トランスクリプトーム、プロテオミクス、および単一細胞レベル12、13、14、15、16、17で腫瘍内に存在するエピジェネティックな異種性に焦点を当ててきました。

ここ数年、単一細胞分野で顕著な技術進歩がありましたが、主な制限要因の1つは、細胞を単離し、これらの実験を行うために必要な新鮮な標本の入手可能性です。この制限を克服するために、凍結組織からのsnRNA-seqおよびsnATAC-seqのようなアッセイを、細胞18、19ではなく核を用いてアッセイを行う上で成功した試みがいくつか行われている。これらの方法の大部分は、蛍光活性化細胞選別(FACS)または濾過戦略のいずれかに依存しています。単一細胞と単一核アプローチの両方に長所と短所があります。単一細胞のアプローチは、ミトコンドリアの転写物を維持し、有益であるかもしれないが、その豊富さのためにトランスクリプトームのカバレッジを減らすことができる。単一核単離アプローチは、ミトコンドリア画分の高い割合を排除し、それによって核転写物20のより詳細なカバレッジを可能にする。

RNA-seqやATAC-seqを含む単一細胞ゲノミクスデータのアッセイに近年使用されている様々な市販のプラットフォームがあります。最も顕著なプラットフォームの1つは、単一細胞遺伝子発現および単一細胞ATACプロファイリングのための10xゲノミクスクロムプラットフォームである。プラットフォームはマイクロ流体室の助けを借りて動作するように、任意の破片や凝集物は、データ、試薬、および貴重な臨床サンプルの損失につながるシステムを詰まらせる可能性があります。したがって、単一細胞研究の成功は、単一細胞/核の正確な単離に大きく依存する。

ここで示すプロトコルは、DroNc-seqとOmni-ATAC-seqプロトコルのわずかに変更された組み合わせであり、snRNA-seqを利用してヒト脳18、19、21、22、23、24の神経疾患および神経細胞タイプを理解する最近の研究と同様のアプローチを利用している。このプロトコルは、凍結サンプルの酵素/機械的解離の組み合わせを使用し、その後ろ過および勾配遠心分離を行い、新鮮な凍結グリオーマ組織からの単一核の迅速かつ正確な単一の分離を可能にする。我々は、このプロトコルを使用して、脳腫瘍標本から同じ核調製物からsnRNA-seqおよびsnATAC-seqデータを生成することに成功した。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

新鮮な凍結グリオーマサンプルは、ドイツのハイデルベルクにある国立腫瘍疾患センター(NCT)組織バンクから入手した。患者材料の使用は、ハイデルベルクの医学部の機関審査委員会によって承認され、インフォームド・コンセントは、研究に含まれるすべての患者から得られました。

1. 実験準備

  1. 氷上または4°Cですべてのステップを実行します。
  2. プレチルチューブ、食器、カミソリの刃、ドウンサー、害虫を4°Cに。
  3. すべてのバッファを事前に準備します。これらのバッファーは室温で安定しています。滅菌濾過は、特にスクロースのために、推奨されます。ストック準備は、コルセスら19. 表 1-7 を参照してください。
  4. 液体窒素または-80°C冷凍庫の貯蔵からサンプルを取り出し、ステップ2.1までドライアイスに保管してください。

2. 組織解剖と解離

  1. 新鮮な凍結組織サンプル(10〜60mg)を冷やされたペトリ皿に移します。氷の上の小片にカミソリの刃で新鮮な凍結組織をミンチ/チョップ。
  2. 冷蔵1.5mLチューブに500μLの冷蔵核リシスバッファーを加えます。核ライシスバッファーを含む1.5mLチューブに組織片を入れ、Douncer(材料表)に移す。
    注:2つのDounceホモジナイザー害虫があります:初期サンプル還元のための「緩い」または「A」害虫と完全なサンプル均質化のための「タイト」または「B」害虫。
  3. 摩擦が減少するまで、約20ストロークの「緩い」害虫で組織片を捨てる。破片が存在する場合、試料は100mmストレーナーで濾過することによって予めクリアされ得る。
  4. 完全な組織均質化を達成するために20ストロークのための「タイトな」害虫でダウンス。
  5. ホモジネート(約500μL)を冷やした2mLチューブに移します。冷やしたライシスバッファーを1 mL加えます。やさしく混ぜ、氷の上で5分間インキュベートします。広孔ピペットチップを軽く混ぜ、インキュベーション中に1~2回繰り返します。
  6. 30 μm のストレーナー メッシュを使用してホモゲネート全体をフィルターし、15 mL ファルコン チューブに集めて、新しい冷やされた 2 mL チューブに戻します。単一のストレーナーは、典型的には、全体のホモジネートのために十分です。
  7. 軽い顕微鏡で大きな破片の除去と核膜の無傷性を確認します。核は丸くする必要があり、核膜は歪んではなりません。破片が存在する場合、核を再濾過することができる。
  8. ベンチトップ遠心分離機で4°Cで5分間500xgで核を遠心する。上清を取り除き、核を含むペレットで〜50μLの後ろに残します。別の1 mLの核リシスバッファーでペレットを徐々に再懸濁し、氷上で5分間インキュベートします。
  9. 4°Cで5分間500xgで核を遠心分離する。 ペレットを乱さずに上清を取り除き、500mLの1x均質化バッファー(HB)(表4)を加え、再中断することなく5分間インキュベートする。次いで、1x HBの別の1.0mLで核を再懸濁する。
  10. 4°Cで5分間500xgで核を遠心分離する。 上清を取り除き、1x HBの200 μLの核を新しい2.0 mLチューブに静かに再懸濁します。

3. グラデーション遠心

  1. 200 μLの 50% イオデキサノール溶液 (表 5) を加え、25% イオデキサノールの最終濃度を与える。300mLにピペットセットを10回よく混ぜます。
  2. 29%のイオジキサノール溶液(表6)の300μLを25%混合物下に加える。P1000の細かい先端を使用して、層の混合を避けてください。
  3. 300 μlの35%のイオデキサノール溶液(表7)を29%混合物下に加える。P1000の細かい先端を使用して、層の混合を避けてください。
    注意: このステップでは、過度の体積変位を避けるために、ピペットの間にピペットチップを徐々に除去する必要があります。
  4. サンプルを振るバケツの遠心分離機に入れ、ブレーキをオフにして4°Cで3,500 x g で20分間回転します。
  5. 揺れることなくサンプルを静かに取り出し、光の下で観察します。純核95%の透明な白色帯は、第2層と第3層の間に見えるべきである(図1)。

4. 核の単離

  1. 29%〜35%の間相で白核帯まで最上層を吸引する。
  2. 200 mLのボリュームで核バンドを収集し、20 μmのフィルター(材料表)で新鮮なチューブとフィルターに移します。
    注: 核はろ過する前に再懸濁する必要はありません。
  3. 軽い顕微鏡で大きな破片の除去と核膜の無傷性を確認します。核は丸くする必要があり、核膜は歪んではなりません。
  4. 血球計上のトリパンブルー染色とsnRNA-seq/snATAC-seqのアリコート核を使用して核を数えます。

5. 単核RNAとATACセク

  1. 単一細胞遺伝子発現および単一細胞ATAC試薬キット(材料表)を用いて核を直ちに処理する。
    注:10xゲノミクス系の核サンプル濃度は、snRNA-seqの場合はμLあたり1500-3000核、snATAC-seqの場合は1μLあたり3500-7000核です。核は、1x PBSを用いて希釈することができる。
  2. 生成されたライブラリーをゲノミクス・コア・ファシリティでシーケンスします。
  3. データの品質管理分析を実行します。核は、一意分子識別子(UMI)>1000、>500の遺伝子数、ミトコンドリア遺伝子の割合<5%を含み、UMIおよび遺伝子の平均+3つの標準偏差内にある場合、さらなる分析のために含まれています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

単一核ゲノミクスは、限られたデータとプロトコルを持つ進化分野です。単一核アッセイの結果に影響を与える重要な要因は、純粋で無傷の核の単離である。我々は、2つの公表されたプロトコル(DroNc-seqおよびOmni-ATAC-seqプロトコル)を組み合わせて、新鮮な凍結グリオーマ組織ブロックから高品質で純粋な核を比較的短時間で分離し、トランスクリプトの安定性を維持した(図1)。

イオデキサノール/スクロース勾配を用いた勾配遠心分離と共に様々な濾過ステップを使用することで、大部分の破片が廃棄された純粋な核の単離が可能となる(図2)。同じ単離核製剤は、snRNA-seqおよびsnATAC-seqの両方に使用することができる。重要なことに、使用される核は同じサンプルから得られるので、生成されたデータは、クラスターを生成し、マルチオミックスのパースペクティブ25を提供するためにSeuratなどのパッケージを使用して共同埋め込むこ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

腫瘍内の異質性の分野は、既存の知識に挑戦し、拡大するために新しいアッセイやプラットフォームが開発され、エキサイティングな段階にあります。腫瘍内不均一性は、神経膠腫28における疾患の進行および現在の治療モダリティに対する耐性に寄与する重要な因子である。脳腫瘍に関する最近の研究は、同じ腫瘍内の細胞異質性をより良く特徴付けるために単一細胞転写およびエピゲノムアッセイを用いて、この重要な側面に焦点を当てている29、30、31、32。脳腫瘍および他の固形腫瘍における単一細胞アッセイの現在のボトルネックの1つは、新鮮な臨床検体の入手可能性である。この問題を克服するために、様々な研究は、新鮮な凍結組織からの核を使用することは、新鮮な標本に代わり、細胞異質性18、33

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

ドイツがんセンター(DKFZ)のシングルセルオープンラボ(scOpenLab)に感謝します。この研究は、ドイツのがん援助、マックス・イーダー・プログラムの助成金番号70111964(S.T.)によって支援されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-メルカプトエタノールΣ M6250
sub>2Sigma21115-100ML
ダウンス ホモジナイザーアクティブ モチーフ40401
EDTA (0.5 M)Thermo ScientificR1021
Falcon 15 mL 円錐形遠心分離管Fisher Scientific352096
ヨウジキサノール (別名Optiprep)幹細胞技術07820
MACs スマートストレーナー (30 & micro;m)Miltenyi Biotec130-098-458
MACS SmartStrainers(100 & マイクロ;m)Miltenyi Biotec130-098-463
Mg(Ac)2Sigma63052-100ML
NP-40Abcamab142227
核分離キット: 核EZ準備シグマNUC101-1KT
フェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)SigmaP7626
プレセパレーションフィルター (20 & micro;m)Miltenyi Biotec130-101-812
Safe lock tubes 1.5 mLEppendorf0030120086
Safe lock tubes 2.0 mLEppendorf0030120094
Single Cell ATAC10x Genomics
Single Cell Gene Expression10x Genomics
SucroseSigmaS0389
ワイドボアピペットチップ(1000 & micro;L)Themo Fisher Scientific2079GPK
ワイドボアピペットチップ(200 µL)テモ・フィッシャー・サイエンティフィック2069GPK
CaCl<

参考文献

  1. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
  2. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  3. Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
  4. Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
  5. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
  6. Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
  7. Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
  8. Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
  9. Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
  10. Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
  11. Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Cancer Research. 69 (24), 9157-9159 (2009).
  12. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
  13. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  14. Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
  15. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  16. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  17. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  18. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  19. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  20. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
  21. Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
  22. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  23. Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19(2020).
  24. Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
  26. Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
  27. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  28. Bready, D., Placantonakis, D. G. Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma. Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).
  29. Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
  30. Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
  31. Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
  32. Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
  33. Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201(2019).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

新鮮凍結組織シングルニュークリアスATAC-seq密度勾配遠心分離イオジキサノール溶液核溶解バッファーろ過工程血球計数器による計数トリパンブルー染色
単核RNA-seqおよびATAC-seqのための新鮮な凍結脳腫瘍からの核分離
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。