方法論記事

マウスモデルにおける虚血再灌流損傷後の幹細胞の筋内内出産の遅延

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DOI：

10.3791/61546

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2020年9月3日

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1Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic, 2Department of Radiology and Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS), Stanford University School of Medicine

この記事について

サマリー

幹細胞は、心筋損傷を有する個人の潜在的な治療法として継続的に調査されるが、損傷した組織内での生存率および保持率の低下は、長期的な有効性に影響を与える可能性がある。本稿では虚血再灌流傷害のマウスモデルにおける幹細胞送達の代替方法を述べる。

要約

心筋損傷を有する個人における心機能回復のための幹細胞(SC)の使用に大きな関心がある。最も一般的には、心筋幹細胞療法は、心筋損傷の誘発と同時にSCを送達することによって研究される。しかし、このアプローチは2つの大きな制限を提示する:初期の敵対的な炎症促進虚血環境は移植されたSCの生存に影響を与える可能性があり、それはSCが使用される可能性が高い亜急性梗塞シナリオを表すものではありません。ここでは、虚血再灌流傷害の誘導および間葉系幹細胞(MCs)の送達のための2部構成の一連の外科的処置について説明する。幹細胞投与のこの方法は、初期免疫応答を回避することによって損傷した組織の周りに長い生存率および保持を可能にし得る。間葉系幹細胞の送達を伴うマウス(3.0 x105)で虚血再灌流傷害のモデルを誘発し、構成的に発現したCMVプロモーターの下でレポーター遺伝子ホタルルシファーゼを安定的に発現し、7日後に心内に発現した。動物は、それぞれ細胞の傷害および注射の確認のために超音波および生物発光画像を介して画像化した。重要なことに、SC配信に対してこの2つの手順アプローチを実行する場合、合併症率は追加されなかった。この幹細胞投与方法は、最先端のレポーター遺伝子の利用と共に、臨床的に一般的に見られる慢性虚血の状況における移植SCの生存率および保持のインビボ研究を可能にし、同時に初期の炎症反応を回避することができる。要約すると、我々は、損傷した組織の再生を促進する潜在的な新しいアプローチとして使用することができる心筋への幹細胞の遅延送達のためのプロトコルを確立した。

概要

心血管疾患は、世界的に罹患率と死亡率の最も一般的な原因であり続けています。心臓虚血性事象は心筋および周囲の細胞1の全機能に有害であることが分かった。心筋細胞の̴0.45~1.0%だけが、心筋損傷が起こった後、毎年再生する。治療の開発に対する需要の高まりと本質的な焦点にもかかわらず、負傷した組織の再生を助ける治療法は確立するのが困難であり、さらに最適化33、4、54,5を必要としている。幹細胞療法は、虚血性のイベントの後に損傷した組織を若返らせるための代替パスとして導入されています。しかし、これらの治療法の進歩は、細胞の限られた生存と保持によって、傷ついた領域6に挑戦されてきた。

虚血性イベント後の心臓の微小環境は、低酸素、酸化促進、および炎症促進として特徴付けることができ、生存のために適応する治療幹細胞に対する敵対的な条件を提示する7,8。8免疫応答が傷害に続いて引き起こされると、ナイーブリンパ球、マクロファージ、好中球および肥満細胞は、死にかけている細胞を除去し、組織改修のためのプロセスを調節することによって損傷を修復しようと99,10, 11.,11虚血後の最初の3日以内に、炎症は、領域10、12,12に好中球および単球の数が多い炎症が炎症のピークに達する。7日後、炎症の多くが沈静化し、修復細胞への移行が始まり、再造りカスケードが完了するまで続き、マウス13では約14日である。私たちの外科的方法は、虚血再灌流傷害後のピーク自然免疫応答をバイパスするために、心筋への生物学的製剤の導入に対する潜在的な代替アプローチである。同時に、急性心筋梗塞と比較して考慮すべき異なる変数がある亜急性/慢性虚血の状態での任意の治療法の研究を可能にする。

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プロトコル

実験は、雌のC57BL/6マウス、10〜12週齢および20〜25g体重に対して行った。すべての動物の手順は、実験動物のケアと使用のためのガイドに記載されている基準に準拠しました (実験動物資源研究所, 米国科学アカデミー, ベセスダ, MD, 米国) メイヨークリニック医科大学施設動物ケア使用委員会によって承認されました (IACUC).

1. 準備と挿管

  1. 手術前に手術器具をすべてオートクレーブ。1回のセッションで複数の手術を行う場合は、各動物の後に器具を清掃し、ホットビーズ滅菌器を使用して再殺菌します。
  2. 誘導室の1 L/分O2 で3.5-4%のイソフルランでマウスを麻酔します。
  3. ブプレノルフィンSRを皮下(鎮痛)皮下1mg/kg(鎮痛)に投与し、動物の重量を量り、人工呼吸器に重量を入力する。
  4. 胸骨から肩のレベルまで胸の左側を剃り、余分な毛皮を取り除くために脱毛クリームを塗ります。
  5. 虚血再灌流手順については、2cmH2Oで人工呼吸器上の正の終止め圧力(PEEP)を維持2する。細胞の遅延注入の場合、肺崩壊を防ぐためにPEEPを3cmH2Oに変更する。
  6. 20G気管チューブを使用して動物を挿管し、35〜37°Cの体温を維持するために制御された加熱パッドに移す。
  7. 左に頭蓋端、右側に尾端を持つ横方向の換気装置にマウスを置きます。
  8. 残りの手順については、1 L/分O 2で2-2.5%イソフルランで麻酔を維持します。
  9. ポビドネヨウ素とアルコール綿棒の間で交互に手術領域を3回スクラブし、両眼に眼科軟膏を適用する。

2. 虚血再灌流障害

  1. #10刃のメスを使用して、視野の左端の乳首の右に2.5mmの垂直切開を行います。
  2. 肋間筋と肋骨が見えるまで、表面筋層を切り裂くはさみを使用する。
  3. リブと周囲の組織を持ち上げながら、4番目と5番目の肋骨の間の肋間空間を切り取り、眼瞼レトラクタをオープンスペースに挿入します。
  4. 湾曲した鉗子を使用して心膜を引き込み、肺を上方に動かして視界から外に出す。
  5. LAD動脈を視覚化し、9-0ナイロン縫合糸を使用して、左大介管に遠位動脈2.5mm遠位の心筋を通過し、緩い正方形の結び目を結びます。
  6. ポリエチレンチューブ1cmを切り、ゆるい結び目の中に置きます。
  7. チューブの周りに縫合を固定し、虚血を確認し、35分後に放出します。
    注:パーラーと心室性不整脈によって虚血を確認してください。
  8. 結紮を解除してチューブを除去した後、5分間待って心筋の再灌流を確認します。
  9. 24 G I.V. カテーテルチューブを胸腔に入れ、開口部の右側に1つの肋間空間を置きます。
  10. 単純な中断パターンで6-0吸収可能な縫合糸で肋間切開を閉じます。
  11. 連続した縫合線パターンで6-0吸収性縫合糸で筋肉層を閉じます。
  12. 表面筋層を閉じた後、胸管を1mLの結核シリンジを用いて胸腔から空気を抜き取りしながら取り出す。
  13. 連続的な水平マットレスパターンの6-0の吸収性の縫合糸で皮膚切開を閉じる
    注:ナイロン縫合糸と不連続縫合パターンもスキン層に使用することができます。
  14. 1.5mLの温かい生理食液を皮下に投与し、感染を予防するために切開部位にトリプル抗生物質軟膏を塗布する。
  15. イソフルランをオフにし、動物が助けを借りずに連続して呼吸できるようになるまで、100%O2の人工呼吸器を通して呼吸できるようにします。2
  16. 完全に回復するまで、35〜37 °Cの温度で暖かいパッド上の寝具のないケージまたは覆われた寝具(ペーパータオルまたはドレープ)付きのケージにマウスを移します。

3. 間葉系幹細胞の分娩

注:処置に使用されるマウスの株は近交系であり、遺伝的に同一とみなされます。間葉系幹細胞は同じ株の動物から得られ、プロトコル設計により、免疫抑制は誘導されなかった1。

  1. 最初の手順で前に行った手順を完了します。
  2. はさみと鉗子を使用して、皮膚層から縫合糸を取り除きます。
  3. メス#10で、前の手術と同じ場所で切開を行います。
  4. 筋肉層縫合糸が見えるまで、メスを使って瘢痕組織を切断し続ける
  5. はさみと鉗子を使用して縫合糸を取り除き、筋肉層を切り開きます。
  6. リブを一緒に保持している縫合糸を視覚化して取り除き、前の切開から肋間筋を切断し続けます。
    注:肺が胸壁に付着している可能性があり、これが発生した場合は、鈍いまたは湾曲した鉗子を使用して慎重に分離し、それらを解放します。
  7. 眼瞼レトラクタを肋間空間に配置し、前の結紮の領域を配置します。
  8. 間葉系幹細胞(3.0 x 105)をロードし、20μL PBSに懸濁し、30Gインスリン注射器に、適切な角度を注入するために必要に応じて針をわずかに曲げます。
    注:間葉系幹細胞(MCS)は、4-6週齢のC56BL/6マウスの脂肪組織から単離した。初期の通路細胞(p3)は、生体内細胞の生存率モニタリングを可能にするCMVプロモーター下でホタルルシファーゼ遺伝子を発現するベクターを用いて導入した。脂肪由来マウスMSCはフローサイトメトリーを特徴とし、細胞はCD44、CD29、CD90およびCD105について陽性であったが、造血マーカーCD4514については陰性であった。注射に先立ち、MSCは解凍プロセスからの細胞の損失を避けるために少なくとも1つの通路のために培養した。
  9. 心臓の基部に向かって頂点から方向に移動すると、針の開口部が心筋の内側に完全に入るまで、シリンジを梗塞後の領域に挿入します。
  10. 中にゆっくりと心筋に細胞を注入し、3 s待ってから針を取り除きます。
  11. 心室細動などの細胞に異常な反応がないことを確認するために、3分間心臓を注意深く観察してください。
  12. 24 G IV カテーテルチューブを胸腔に入れ、開口部の右側に 1 つの肋間スペースを置きます。
  13. 肋間、筋肉、および皮膚層を閉じ、最初の手順と同じ方法で胸管を取り除きます。
  14. 1.5mLの温かい生理食液を皮下に投与し、感染を予防するために切開部位にトリプル抗生物質軟膏を塗布する。
  15. イソフルランをオフにし、動物が100%O2で人工呼吸器を通2して呼吸できるようにし、助けを借りずに連続して呼吸できるようにします。
  16. 完全に回復するまで、35〜37 °Cの温度で暖かいパッド上の寝具のないケージまたは覆われた寝具(ペーパータオルまたはドレープ)付きのケージにマウスを移します。

4. 両方の手順に従った術後のケア

  1. 自発的な呼吸、胸骨の不順、正常な動きが確立されるまで、動物を継続的に観察してください。
  2. 手術当日に少なくとも3時間、15〜30分ごとに観察を続けます。
  3. マウスの創傷脱ヒスジェンスまたは異常な痛みを1日1回5日間、週2~3回チェックします。
  4. 動物が痛みの徴候を示す場合(すなわち、アーチ型の背中、最小限の動き、悲しみ、または不器用な毛皮)72時間後に、ブプレノルフィンSR鎮痛薬の追加用量を提供する。

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結果

0日目にマウスで虚血再灌流傷害を誘発し、続いて幹細胞移植の前日に術後心エコー図と心電図を行った。超音波および心電図分析は梗塞を確認し、心室収縮機能を低下させた(図1A-D)。さらにデータを調べると、虚血性損傷を受けたマウスでは駆出率および分数短縮率が減少し、期末拡張期および収縮期の体積が増加した(表1)。正常なマウス心臓(図2A)と比較して、外傷後7日目の心筋組織のマッソントリクローム染色(図2B)は、左心室壁のコラーゲン沈着および薄化の増加を示した。2番目の手順は、傷害の7日後に行われた。マウスは間葉系幹細胞の心筋内注射(3.0 x 105 in 20 μL PBS)を与えられ、構成的に発現したCMVプロモーター下でレポーター遺伝子ホタルルシファーゼを安定的に発現させた。インビボ生物発光画像(BLI)は、幹細胞注入の翌日に完了し、注射に成功したことを確認した。MCの正常...

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ディスカッション

世界中で8500万人以上の人々が心血管疾患の影響を受けています3.これらの虚血性事象の高い有病率は、損傷した組織の再生を促進するための代替療法のさらなる開発および拡大を保証する。従来の方法は、治療剤1のその後の投与を伴う急性の設定で虚血再灌流手順を利用する。炎症反応は、心臓虚血性イベントを開始してから3〜4日間のピークにあり、好中球、マクロファージ、および増加したサイトカインシグナル10、12,の浸潤を伴う。死細胞分離のこの期間の後、一次免疫応答は、リモデリング相13に向かって沈静化および移行し始める。さらに、臨床現場で提示されたのと同じシナリオで治療を調査することが重要です。本稿では、核血性マウスから得られた代表的な結果を示し、MSCの注射が遅れた二重外科的処置の実現可能性および安全性を実証している。このアプローチは、心筋虚血動物モデルだけでなく、炎症が重要な役割を果たす可能性...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9% NaCl 灌漑、USPBaxter0338-0048-04
11x12" プレス n' シール外科用ドレープ、オートクレーブ可能なSAI Infusion TechnologiesPSS-SD
24G 3/4" IV カテーテル チューブJelco4053
28G x 1/2" 1mL アレルギー注射器BD305500鎮痛剤
の注射 30G x 1/2" 3/10cc インスリン注射器Ulticare08222.0933.56幹細胞の注入
6-0 S-29、12インチ Vicryl 縫合EthiconJ556G肋間、表在筋、皮膚層切開閉鎖
9-0 BV100-4、5インチ エチロン縫合Ethicon2829GLAD動脈の結紮
吸収性アンダーパッドサーモフィッシャーサイエンティフィック14-206-64動物の
下用アルコール準備パッド、2層、中Coviden6818
防曇フェイスマスクHalyard49235
ボン斜視はさみ、湾曲、鈍いファインサイエンスツール14085-09
ブプレノルフィン HCL SR LAB 1mg/ml、5 mlZooPharm Pharmacyブプレノルフィン麻薬性鎮痛薬 吸収を遅らせるポリマーで配合され、作用の持続時間を延長します (72 時間の持続時間アクティビティ)。
Castroviejoニードルホルダー、湾曲ファインサイエンスツール12061-01
リティ滅菌ガーゼスポンジCoviden397310
縫合タイイング鉗子、45角度曲げファインサイエンスツール11063-07
カミソウォール毛皮除去
イソフルラン100mlカーディナルヘルスPI23238麻酔薬
白衣
Monoject 1 mL 皮下注射器Coviden8881501400
Moria 虹彩鉗子、湾曲、鋸歯状 (x2)Fine Science Tools11370-31
Moria speculum retractorFine Science Tools17370-53
マウス気管内挿管キットKent Scientific
Nair脱毛クリームジョンソン &ジョンソン毛皮の取り外し
Optixcareの目の潤滑油Aventix滅菌眼の潤滑油
Physiosuiteの人工呼吸器ケント科学
的なPolyEのポリエチレンの管ハーバードの器具72-0191LADの動脈の一時的な圧縮
Povidone-ヨードの綿棒PDIS41125
メス、10ブレードバードパーカー371610
インチ綿チップアプリケーターディナルヘルスC15055-003
6インチテーパーコットンチップアプリケーターピューリタン25-826-5WC
滅菌手袋ディナルヘルスN8830
ポーチメドラインMPP100525GS
手術キャップ
手術用顕微鏡ライカM125
縫合糸結束鉗子、ストレート (x2)ファイン サイエンス ツール10825-10
トランスポア サージカル テープ3M1527-1
トリプル 抗生物質軟膏G&W Laboratories11-2683ILNC2感染を防ぐための局所アプリケーション
Vannas-Tübingen スプリングはさみ、湾曲ファインサイエンスツール15004-08
Vetflo 気化器ケントサイエンティフィック
糸 糸 キュ繊細な電気リ滅菌3カー滅菌カー滅菌

参考文献

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