有害刺激センシングのための定量的行動読み出しとしてのプラナリアンスクランチング

サマリー

淡水プラナリアンは、定量的行動分析によって区別できる3つの歩行(滑空、蠕動、およびスクランチ)を示す。我々は、様々な有害刺激、その定量、および蠕動および滑空との区別を用いてスクランチを誘導する方法を記述する。遺伝子ノックダウンを用いて、定量的表現読み出しとしてスクランチングの特異性を実証する。

要約

淡水のプラナリアンは、通常、腹側の毛様体の推進力を通って滑らかに滑空します。しかし、特定の環境条件は、運動性主導の移動形態である蠕動またはスクランチを誘発する可能性がある。蠕動は毛様体欠損から生じるが、スクランチは繊毛機能から独立しており、切断、有害温度、極端なpH、エタノールを含む特定の刺激に対する特異的な反応である。したがって、これら2つの筋肉駆動の足取りは、機械学的に異なっている。しかし、質的に区別することは困難です。ここでは、様々な物理的および化学的刺激を用いてスクランチを誘導するためのプロトコルを提供します。自由に利用できるソフトウェアを用いて、蠕動や滑空と区別するために使用できるスクランチングの定量的特徴について詳しく説明します。スクランチは、特徴的な種固有の違いはあるものの普遍的なプラナリアン歩行であるため、このプロトコルは、適切な考慮事項を使用する場合、すべての種のプラナリアンに広く適用することができます。これを実証するために、行動研究で使用される2つの最も人気のあるプラナリアン種、 ドゥゲシア・ジャポニカ と シュミテア・メディテラニアの反応を、物理的および化学的刺激の同じセットと比較する。さらに、スクランチングの特異性により、このプロトコルをRNA干渉および/または薬理学的暴露と組み合わせて使用して、関係する分子標的および神経回路を解剖し、ノシセプションおよび神経筋コミュニケーションの重要な側面に対する機械的な洞察を提供する可能性がある。

概要

^,幹細胞や再生^,研究^1、2、32に人気の他¹に、淡水プラナリアンは、比較的大きなサイズ(長さが数ミリメートル)、簡単で低コストの実験室のメンテナンス、および観察可能な行動の広いスペクトルを利用して、行動研究^34、5で長い間使用されてきました。⁵コンピュータビジョンと自動追跡をプラナリアン行動研究⁶⁷6、7、8、9、10、11に導入すると、行動型の定量的分化が^8,9,10,11可能になりました。^,,動物の行動は、神経機能の直接の読み出しです。プラナリアン神経系は中規模で複雑であるが、脊椎動物の脳^{12、13、1413,14}と共に保存された重要な要素を共有するため、プラナリアンの行動を研究することは、より複雑な生物で直接探査するのが難しいニューロン作用の保存されたメカニズムに関する洞察を提供することができる。¹²したがって、プラナリアンは、比較神経生物学研究^,,,88、12、15、16、17、18、19、20、21^,12,15,16の貴重なモデルです。^,2119,201718さらに、水生環境は、再生および成人プラナリアンにおける脳機能への影響を研究するために化学物質への迅速かつ容易な暴露を可能にし、神経毒性^学22、23、24、25、26のための人気のシステムにする。^,23,24,25,26

プラナリアンは、滑空、蠕動、スクランチと呼ばれる3つの異なる足取りを持っています。各歩行は、特定の状況下で展示されています:滑空はデフォルトの歩行であり、毛様体機能^が損なわれると蠕動が起こり^、27シリア機能から独立したエスケープ歩行である - 特定の有害な刺激に応答して^7。我々は、スクランチングは、極端な温度またはpH、機械的損傷、または特定の化学的誘導物質を含む特定の化学的または物理的手がかりの感覚によって引き起こされ、したがって一般的なストレス応答^{77、28、2928,29}ではないことを示している。

このプロトコルを使用して容易に定量化することができるその特異性およびステレオタイプのパラメータのために、スクランチングは、研究者が行動^25、28,28の感覚経路および神経制御を解剖する機械学的研究を行うことを可能にする強力な行動表現型である。さらに、スクランチングは^,、神経毒性学研究22、24、25、30における神経系の発達および機能に対する^22,24,有害な化学的影響をアッセイする敏感なエンドポイントであることが示されている。²⁵³⁰いくつかの異なる感覚経路が様々なメカニズム²⁸を通してしゃがみを誘発するために収束するように見えるので、様々だが特定の刺激を使用して異なる神経回路を解剖し、異なる信号がどのように統合され、異なるシグナルタイプを産生するかを研究することができるので、スクランチは他のプラナリアン行動とは異なる。

重要なことに、種の違いは存在し、ある化学物質はあるプラナリアン種でスクランチを引き起こすかもしれないが、別のプラナリアン種では異なる行動反応を引き起こす可能性がある。例えば、アナンダミドは、平面種ドゥゲシア・ジャポニカでスクランチを誘発するが、シュミネア地中海²⁸で蠕動を誘発することを発見した。この例では、異なる分子機構の明白な現れであるため、異なる歩行を確実に区別できることの重要性を強調しています。しかし、両足歩行は筋力主導であり、質^{的類似性,}を共有するため、蠕動性と蠕動の区別は、質的観察データを使用して困難^である。したがって、歩行を区別するには、繊毛イメージングまたは定量的行動研究を行う必要があり、これは特性パラメータ^77,2828に基づく区別を可能にする。繊毛イメージングは実験的に困難であり、高倍率の化合物顕微鏡や高速カメラ^77、2828などの特殊な装置を必要とするため、定量的行動分析ほど研究者が普及することは不可能です。

ここでは、(1)様々な物理的(有害温度、切断、近紫外線)および化学(アリルイソチオシアネート(AITC)、シナアルデヒド)刺激を用いたスクランチの誘導と(2)自由に入手可能なソフトウェアを用いたプラナリアン行動の定量分析のためのプロトコルを提示する。4つのパラメータ(身体長振動の周波数、相対速度、最大振幅、および体伸びと収縮の非対称^性)を定量化することにより、スクランチングは、ヘビ様移動運動15やてんかん¹⁵などの文献で報告される滑空、蠕動、その他の行動状態と区別することができる。¹⁵さらに、スクランチングは、異なるプラナリアン種⁷の間で保存されているが、各種は、独自の特徴的な周波数と速度を有する。したがって、種の滑空速度とスクランチ速度が決定されると、速度だけでは滑空および蠕動²⁹とスクランチを区別する手段として使用することができる。このプロトコルは、計算画像解析や行動研究における事前の訓練を前提としないため、学部レベルの教育研究室の文脈におけるプラナリアン行動実験にも適用することができます。プロトコルの適合を容易にするデータの例は補足資料に記載されている。

プロトコル

1. 定量的プラナリアン行動アッセイ

1. 実験用セットアップ
   1. 薄暗い LED パネルを平らな面に置きます。LEDパネルは、(1)均一な白色の背景を提供し、(2)適切なコントラストを得るために調整可能な光源として使用する2つの目的を果たします。LEDパネルの上に100 mmのペトリ皿アリーナを設置します。
      注: スループットを向上させるために、マルチウェル プレートをアリーナ^23、24として使用できますが^、24大きなアリーナは、自動画像解析を容易にします。
   2. アリーナの上のリングスタンドにカメラを取り付けます(図1A)。必要に応じてカメラの位置、高さ、フォーカスを調整して、アリーナ全体が視野の中央に配置され、フォーカスが合うようにします (図 1B)。
      注: カメラの解像度は、LED パネルによって提供される同種の背景からプラナリアンを明確に区別するのに十分な高さである必要があります。
   3. 適切な露出媒体(プラナリアン水または化学溶液)を半分の最大体積(これはお風呂と呼ばれます)でアリーナを埋めます。これは100mmペトリ皿の約25 mLに相当します。LEDパネルをオンにし、記録品質に悪影響を及ぼす可能性のある他の光源(つまり、アリーナにまぶしさを生み出す近くの光源)をオフにします。
      注意:完全な個人的な保護具(PPE)を着用し、必要に応じてヒュームフードに実験セットアップを移動することにより、適切に危険な化学ソリューションを管理します。廃棄物処理に関する連邦および州の規制に従ってください。
   4. トランスファーピペットを使用してアリーナの中心に向かってプラナリアンをドロップします。録音を開始します。データをネイティブフィジー³¹ 形式(TIFF、GIF、JPEG、PNG、DICOM、BMP、PGM、または FITS)で画像シーケンスとして記録します。
      注: 外部刺激に対する行動や感度は個々のプラナリアンによって異なるため、技術的な複製を実行することに加えて、十分に多くの生物学的複製に関するデータを収集することが重要です。100mmのペトリ皿で、最大10の中型(4~7mm)のプラナリアンと一度に取り組んできました。時間効率は高いが、ペトリ皿の複数のプラナリアンは、プラナリアンが道を渡る可能性があるため、データ分析をより困難にする。
      1. 滑空実験の場合は、1 秒あたり少なくとも 1 フレーム(FPS)を使用して記録します。スクランチング/蠕動性実験の場合は、プラナリアン種のスクランチング/蠕動頻度の少なくとも2倍のFPSを使用して記録します。プラナリアン種が未知のスクランチング/蠕動頻度を有する場合は、出発点として10 FPSを使用し、必要に応じて増減する。
      2. 化学溶液を使用する場合は、化学溶液の濃度が大きく変化しないように、できるだけ少ないプラナリアン水を使用してプラナリアンを移送します。
   5. 滑空実験では、1~2分間の滑空動作を記録します。スクランチ/蠕動性実験の場合は、直線で発生する少なくとも3つの連続振動をキャプチャするのに十分な長さ記録します。実験が完了したら、記録を終了します。
      注:スクランチング/蠕動性実験の場合、プラナリアンが反復間で一貫する必要があり、刺激に基づいて経験的に決定される一定期間内に終了基準を満たしていない場合は、記録を終了し、別のプラナリアンをテストします。
      1. プラナリアンが終了基準を満たさずにアリーナの境界に達した場合は、プラナリアンをアリーナの中心に戻します。
         注: 個人の動作が変わる可能性があるため、録音のために個人のピペット処理を繰り返さないようにしてください。
   6. 競技場からプラナリアンを取り除き、適切な廃棄物容器にプラナリアン水または化学溶液を処分する。プラナリアンの水の中にいたプラナリアンは、自宅の容器に戻すことができます。
      注:異なるメディアに異なるアリーナを使用してクロス汚染を避けてください(すなわち、プラナリアン水実験での滑空は、以前は化学物質暴露によるスクランチング/蠕動実験に使用されていたアリーナでは実行しないでください)。
      1. 25 mLのプラナリアン水で満たされた3つのクリーンな100 mmペトリ皿の化学溶液にさらされた連続的にプラナリアンを洗浄し、化学物質を徹底的に希釈します。スクランチまたは蠕動が誘発された場合は、これらのプラナリアンを別の容器に入れます。ほとんどの細胞がその時間¹までにひっくり返っていたので、プラナリアンは1ヶ月後に自宅のコンテナに戻すことができます。
         注: 同じ平面図の集団に対して複数の異なる実験が必要な場合(例えば、RNAiの人口のために)、次の実験を実行する前に、プラナリアンが24時間回復することを可能にします。最も侵襲性の低い実験が最初に、最も侵襲的な実験(例えば切断)が最後に実行されるような実験を注文する。
      2. 同じアリーナで複数の実験を行う場合は、バス溶液を適切に処分し、ランニングの間にペーパータオルでアリーナを拭き取ることによって粘液を取り除きます。
         注: プロトコルはここで一時停止することができます。
2. プラナリアン行動の定量的分析
   1. セクション1.1に記載されているように、プラナリアン行動アッセイを実行する。
   2. フィジーで実験の生のイメージ シーケンスを開き (ファイル/読み込み/画像シーケンス)、イメージ シーケンスの最初のイメージを選択します。[シーケンス オプション] ウィンドウで、[名前を数値で並べ替える] チェック ボックスをオンにし、[OK] をクリックします。イメージ シーケンスが読み込まれたら、イメージ シーケンスを 8 ビット(Image> Type > 8 ビット) に変換し、イメージ スタックの下部にある矢印ツールまたはスライダーを使用して、イメージ シーケンスを見たり、画面移動します。
      注: 滑空実験では、記録全体で平面がはっきりと見える限り、すべてのデータを使用できます。しかし、通常は、以下に説明するように、関連する部分を抽出することによって、アリーナの中央で自由な動きを分析するだけで十分です。
   3. 対象となる期間と領域を抽出するには、矩形ツールを使用して、平面の完全なパスを含む対象領域を描画します (図 2A, 2B)。イメージ スタックを右クリックし、[ 複製..] を選択し、[ 重複スタック] のチェック ボックスをオンにして、対象となるシーケンスの最初と最後のフレームを入力して 、[OK]をクリックします。複数のプラナリアンが同時に画像化された場合は、アリーナ内の各プラナリアンに対してこの領域の選択と複製の手順を繰り返し、アリーナにプラナリアンがいるのと同じ数のオープンイメージスタックが存在するようにします。次の手順 (手順 1.2.4~1.2.10) は、各イメージ スタックに対して 1 つずつ実行する必要があります。
      1. 滑空実験の場合は、平坦な移動が少なくとも 2 倍の体長の滑空期間を抽出します。
         注: 平坦化ごとに抽出されるグライダーデータが多ければ多いほど、データの信頼性は高くなります。平滑図解析では、直線で移動する必要はありません。
      2. スクランチング/蠕動性実験では、プラナリアンが直線で最低3回連続(理想的にはそれ以上)の身体振動を受けた場合にインスタンスを抽出し、完全な振動が正確に周波数を決定するために必要であるため、各振動が完全な伸び縮みサイクルであることを確認します。
         注: より多くの振動を抽出できるほど、データの信頼性が高くなります。正確な長さの測定が行われなくなるので、平面が回転するシーケンスは使用しないでください。
   4. イメージを二項化し、背景から平面を抽出するには、複製したイメージ スタックにしきい値を適用します (Image > 調整 |しきい値) 。必要に応じてスライドバーを調整し、プラナリアン全体が赤色でハイライト表示されるようにします。正確な値は、イメージング品質に依存します。 [背景の濃い]、[ 履歴をスタック]、および [ 範囲をリセットしない] の 各ボックスはオフのままにします。イメージ スタックをスクロールして、良好なしきい値範囲 (つまり、スタック全体でプラナリアンが背景から十分に分離されていることを確認します) をクリックし、[ 適用] をクリックします。
   5. [ スタックをバイナリに変換 ] ウィンドウで、[メソッド] を [既定] に、[背景] を [ライト] に設定します。このウィンドウのすべてのボックスのチェックを外し 、[OK]をクリックします。白い背景に黒い平面図を示す二項化された画像が表示されます (図 2C)。イメージ シーケンスのすべてのフレームで、プラナリアン全体が表示されていることを確認します。
      注: 平坦化されたイメージ シーケンス内の不要なオブジェクトのうち、そのオブジェクトが平面よりも小さいか大きい場合は、サイズ フィルターを使用して後続の分析で除外できます (図 2Ciii)。
   6. [分析] > [計測値の設定] をクリックして、測定を設定します。 [面積]、[ 重心]、[ 重なりの位置]、[ 楕円に合わせる ] の各チェック ボックスをオンにして 、[OK]をクリックします。
      注: これらのパラメータはフィジーセッションごとに1回だけ設定する必要があります。
   7. 開いているイメージ スタックを選択し、[ 解析] → [パーティクルの解析] を選択します。
   8. [ パーティクルの解析] ウィンドウで、[ 表示] > [マスク ] を選択して、選択したパラメータで検出されたすべてのオブジェクトを表示する新しいスタックを開きます。これは、プラナリアンの測定値のみが取得されていることを視覚的に確認するために使用できます。このステップでは、用意された空間に平面図の近似領域(ピクセル² 単位)を入力して不要なノイズを除去するために、サイズフィルタを設定できます。 [結果を表示 ] および [ 結果をクリア] のチェック ボックスをオンにし 、[OK]をクリックします。
      注: [結果 ] ウィンドウで、インデックス (最初の列) がすべての行のスライス番号と同じでない場合、追跡されたオブジェクトが多すぎるか、または少なすぎることを意味します。この不一致の 1 つの可能性は、平面以外の他のオブジェクトの存在、または特定のフレームでプラナリアンが追跡されなかったことです。
   9. パネルの下部にあるスライダーを使用して、マスクイメージスタックをパンします。ノイズが発生した場合や、平面を欠いたフレームがある場合は、[ 結果] ウィンドウとマスク イメージ スタックを閉じます。平面以外のオブジェクトのみを削除するようにエリアフィルタを調整して、手順1.2.7~1.2.8を繰り返します。
      注: マスク内のフレームにプラナリアンが欠落している場合は、エリアフィルタの下限が高すぎることを示唆しています。
   10. [ 結果 ] ウィンドウで、[ ファイル] → [名前を付けて保存] を使用してデータを保存します。ファイル名に .csv 拡張子を追加して、データをコンマ区切り値で保存します。イメージ スタックのデータを保存したら、それぞれのイメージ スタックと [結果 ] ウィンドウと [マスク ] ウィンドウを閉じます。
   11. データをインポートし、任意のスプレッドシートソフトウェアやフリーウェアを使用してさらに分析します。滑空速度を計算するには、セクション 1.3 を参照してください。スクランチング/ペリスタルシスのフルパラメータセットを計算するには、セクション1.4を参照してください。
       注: プロトコルはここで一時停止することができます。
   12. ピクセルから実際の長さへの変換を決定するには、参照長 (アリーナの直径など) を持つ画像をフィジーで開きます。線ツールを選択し、既知の長さに沿って線を引きます。
   13. [ 分析] > [尺度の設定] をクリックして、ピクセル単位を標準の長さの単位に変換します。[ 既知の距離 ] ボックスにイメージに描画される線分に対応する長さを入力し、[ 長さの単位] を ピクセル から選択した標準長の単位に変更します。変換係数は、スケール の横に書き込 まれます。
       注: セクション 1.3 および 1.4 での滑空解析やスクランチング/蠕動解析には、ピクセル変換値は必要ありません。
3. 滑空速度の計算
   1. セクション 1.2 で保存したデータ ファイルを使用して、重心 (COM) の x 座標と y 座標と長軸データを読み込みます。データをカンマ区切り値ファイルとして保存する場合、これらのリストはそれぞれ「XM」、「YM」、「メジャー」の各列に対応します。
   2. 「XM」および「YM」データ列を使用して、次のフレームに対して、各フレームの平坦な質量の中心の変位 (d) を計算します。変位 (d)は 次の式で与えられます。
      
      ここで、x₁ と y₁ は 1 つのフレームの COM 座標 (XM、YM) を参照し、x₂ と y₂ は後続のフレームの COM 座標 (XM、YM) を参照します。
   3. 「メジャー」列の⁹⁵ パーセンタイルとして、平面の体の長さを設定します。プラナリアンは壁の嗜好行動³²を示すので、これは計算された平面の体長が、平面が²⁴に伸びる時を表すであることを保証する。
   4. フレームあたりのピクセル変位を平面体の長さ (l)で割ることにより、平面体の長さによって変位を正規化します。正規化された変位 (d_n)は 次の式で指定されます。
      
   5. 正規化された変位をフレーム当たりの経過時間(記録されたFPSの逆)で割って、正規化された速度のリストを生成します。正規化された滑空速度_{(s n}) は、次の式で指定されます。
      
   6. 正規化された速度リストの平均を取ることによって、平坦化の正規化された滑空速度を計算します ( s_n)。標準偏差は、平面の不確定測定として使用できます。
   7. 分析する各プラナリアンについて、ステップ 1.3.1 ~ 1.3.6 を繰り返します。すべての平面図の滑空速度の平均と標準偏差を取り、それぞれ平面集団の滑空速度と関連する不確実性を得る。
4. フルパラメータセットを用いたスクランチングと蠕動性の区別
   1. セクション 1.2 から保存したデータ ファイルから、主軸データ リストを読み込みます。データをコンマ区切り値ファイルとして保存する場合、これは メジャー 列に対応します。
   2. [メジャー ] 列の各データ ポイントに 0 から番号を付け、リストを作成します。記録された FPS で割って、このリストをフレームごとの経過時間に変換します。
   3. メジャー列データを経過時間に対してプロットして、スクランチング/蠕動振動プロットを生成します (図 3A)。振動プロットを使用して、データを少なくとも3つの連続した直線振動にトリミングします(図3Bi)。ローカルピーク(振動の最大伸び)またはトラフ(最小振動の伸び)で開始および終了するデータをトリミングします。
      注意: 局所極値がほぼ等しくない場合(高さがピーク/トラフによって大きく異なる)、振動が直線ではないことを示唆しています(図3Bii)。少なくとも3つの連続した直線振動の別のシーケンスを抽出します。セクション1.2を参照してください。
   4. 時間に関してトリミングされた メジャー データを再印刷して、対象の振動シーケンスが適切に抽出およびトリミングされていることを確認します。このトリミングされたデータリストは、以降のすべての計算に使用します。
   5. 振動周波数(ν_m)を計算するには、振動数(O_n)を、トリミングされた長軸データ リスト(N)のデータ ポイントの総数で除算します。FPS にこの値を掛けて、1 秒あたりの振動数を求めます。
      
   6. 最大伸びを計算するには(|Δε|_max)を指定し、絶対最大体長(l_max)から絶対最小ボディ長(l_min)を引きます。絶対最大体長で除算して、細長いボディ長に正規化します。
      
   7. ボディ長さあたりの速度を計算するには(v^*_m)、計算された最大伸びに振動周波数を掛けます。
      
      注:速度だけでは、スクランチとペリスタルシスの足取り⁷を区別するために使用することができます。
   8. 伸長に費やされた時間の割合を計算するには(f_elong)、時間に関してトリミングされた長軸データリストの微分を取ります。正のデータポイントの数 (つまり、微分が >0 (n_p)の場合は、長軸データ リストのデータ ポイントの総数 (n_t) で除算します。
      
      注:スクランチプラナリアンは、蠕動を行うプラナリアンが7を伸縮するために等しい^時間を費やすのに対し、伸びるのに費やす時間の非対称的な割合を示す。
   9. 分析する各プラナリアンについて、ステップ 1.4.1 ~ 1.4.8 を繰り返します。各パラメータの平均と標準偏差を求めることで、設定された平面母集団パラメータを計算します。
      注: パラメータセットは、振動動作が周期的な体形の変化を伴う振動、蠕動、または他の形態の移動性であるかどうかを判断するために使用できます。スクランチングと蠕動性の両方は、与えられた種⁷の固定パラメータを有し、スクランチングパラメータは一般的に蠕動パラメータ⁷よりも大きい。パラメータの1つが種特異的範囲外に落ちる可能性がありますが、以前に化学誘導²⁸で観察したように、観察された行動は、蠕動またはスクランチのいずれかに分類される4つの公表されたパラメータのうち少なくとも3つに同意する必要があります。

2. スクランチング誘導

1. 物理的刺激(有害温度、UV光、切断)
   1. すべての物理的な刺激実験については、実験のセットアップのためのセクション1.1を参照してください。
      注:ピペットやカミソリの刃を操縦するためのより多くのオープンスペースを可能にするために物理的な刺激実験のために、100ミリメートルペトリ皿などの大きなアリーナを使用することをお勧めします。
   2. 有害温度でスクランチを誘発するために、ガラスビーカー(テストするプラナリアンあたり少なくとも100 μL)の熱平板水をホットプレート上で65°Cに加熱します。
      1. アリーナの中央にプラナリアンを配置します。プラナリアンが直立して滑空を開始するまで待ちます。録音を開始します。
      2. P-200ピペットを使用して、65°Cプラナリアン水のピペット100 μLを後咽頭にプラナリアンの尾端にゆっくりとピペットしてスクランチを誘発する。
         注:加熱されたプラナリアンウォーターが65°Cにとどまることを確認してください。 必要に応じて、別の実験を開始する前に、水を65°Cに再加熱します。圧力もスクランチを誘発することができるので、ゆっくりとしたピペットが必要です。実験と同様に室温水をピペット化することは、制御および練習の選択肢として役立つことができる。
      3. しゃがみなくなったら録音を停止します。プラナリアンを回収容器に入れ、より多くの実験を行う場合は、シャーレのメディアを新鮮な室温のプラナリアンウォーターと交換します。
   3. 切断を介してスクランチを誘発するには、プラナリアンをアリーナの中心に移し、プラナリアンが直立して滑空を開始するまで待ちます。録音を開始します。
      1. きれいなカミソリの刃を使用してプラナリアンを切断します。切断は、切断場所が実験間で一貫している限り、プラナリアンに沿ってどこでも行うことができます。
         注:スクランチングパラメータは、前部片から抽出されます。したがって、後端から接近してカットを適用する際に、プラナリアンのこの部分のカメラの視界を妨げないようにします。プラスチックカバースリップも切断のためにうまく機能し、特に教職の設定で、より安全なオプションです。
      2. 前部の部分がしゃがみなくなったら録音を停止します。両方の部分を取り出し、別の容器に入れ、7日間再生させます。切断されたプラナリアンは、再生後にホームコンテナに再組み込むことができます。
   4. 近紫外線を使用してスクランチを誘発するには、カメラレンズに適切なフィルタ(例えば、ロスコラックスフィルター)を取り付けて、カメラが収集する反射された近紫光の量を減らし、プラナリアンの応答を撮影するのを妨げる可能性があります。LEDパネルを使用してアリーナを下から照らす代わりに、プラナリアンが無神経なアンビエントレッド照明を使用^{してください。}
      1. 100 mm ペトリ皿アリーナにプラナリアンウォーターを充填し、アリーナの中央に単一のプラナリアン (5~9 mm) を配置します。10 FPS から録画を開始します。
      2. クラス II の UV レーザー ポインター (405 ± 10 nm、出力電力 <5 mW) を持ち、アリーナから約 30 cm 離します。レーザーポインターを滑空平面から45°の角度に置き、咽頭の後端と尾端の中間に5〜10秒間レーザーポインターを照らし、スクランチを誘発します。
         注: レーザー ポインターのパワーは、UV に近い電力計を使用して測定できます。
      3. プラナリアンが再び滑空を開始するのを待ってから、同じ個体にさらに2つの刺激を試みて反応の再現性をテストします。プラナリアンが同じ動作を示し続ける場合は、記録を停止し、そのコンテナーに戻すプラナリアンを置きます。刺激の間で動作が変化した場合、追加のテストでは、どの応答が最も顕著であるかが示されます。
         注:プラナリアンは、ほぼUV光に鈍感になり、反応を停止します。連続した刺激は8-10秒の休息期間を必要とする。
2. 化学刺激(AITC)
   1. 化学物質を用いてスクランチを誘導するために、例えば、TRPA1アゴニストAITC²⁸は、プラナリアンが理想的には、化学物質の浴に浸漬される。必要に応じて、ピペット処理はセクション2.1.2.3に記載されているように適用することができます。
      注意:AITCは可燃性、急性毒性、皮膚および眼の刺激、呼吸および皮膚感作を引き起こす可能性があり、水生生物に危険である。AITCオイルはヒュームフードで取り扱う必要があります。AITCのストックソリューションを製造する前に、適切なPPE(ニトリル手袋とラボコート)を着用し、適切な固体および液体有害廃棄物処理容器を設置してください。
   2. ヒュームフードで、50 mL遠心チューブにプラナリアンウォーターでAITCの10 mMストック溶液を作ります。このストックソリューションは、4°Cで保存すると最大1ヶ月間使用できます。
      1. このストックから、50 mL遠心分離管内のプラナリアン水に100 μM AITCの25 mLの作業ソリューションを準備します。この100 μM AITCソリューションは、プラナリアンのスクランチを誘発するために使用されます。
         注:100 μM AITC は 、D. ジャポニカ と S. 地中海 プラナリアン²⁸で一貫したスクランチを誘発します。他の水生プラナリアンの場合、100 μMは開始濃度として機能し、それに応じて調整することができます。
      2. 実験用セットアップをセットアップします(セクション1.1を参照)。アリーナに AITC の作業ソリューションを入力し、セカンダリ コンテナーに配置します。セカンダリ コンテナは、アリーナの少なくとも 2 倍のボリュームを保持する必要があります。
         注:実験は、余分な安全性のためにヒュームフードの内側で行うことができます。
      3. アリーナの中心に最大10のプラナリアンを転送し、記録を開始します。
      4. プラナリアンが鈍感になり、しゃがみなくなると、録音を停止します。AITC ソリューションからプラナリアンを削除し、すいすりします (セクション 1.1 を参照)。適切な廃棄物容器に固形および液体のAITC廃棄物を処分する。
      5. 標準プロトコルに続く TRPA1²⁸ に対する RNAi を使用して AITC に対する応答の特異性を確認します。

結果

S.地中海プラナリアンにおける外眼近紫外知覚はTRPA1依存性であり_、H2O2リリース¹⁷にリンクすることが提案₂されている。H_2O2露光はS.地中海およびD.ジャポニカプラナリアン²⁸でTRPA1依存的なスクランチを誘発するので、セクション2.1.4のステップは、近紫外光暴露が両方の種でスクランチを誘発するかどうかをテストするために使用することができる。D.ジャポニカプラナリアンは、ほぼUV光にさらされると(10/10)しゃがむが、S.地中海のプラナリアンは、前述の¹⁷のように尾間引き(7/10)を示すか、応答なし(3/10)を示す(図4A,4B)。セクション1.4で概説されているように、少なくとも3つの連続した直線スクランチ...

ディスカッション

このプロトコルを使用すると、物理および化学的刺激^,7、28、29または遺伝子操作(RNAi)28、29のプラ^28,29ナリアン移動の影響を定量的に研究することができます。⁷²⁸²⁹空間解像度を最大限に高めるには、アリーナ全体が視野に入っていることを確認しながら、カメラをできるだけアリーナの近くに移動することをお勧めします。スループットを向上させるために、複数のプラナリアンを同時に記録することで、複数のプラナリアンの動作を一度にスクリーニングできます。1つのアリーナで複数のプラナリアンをスクリーニングする場合、フィジーで関心のある地域を描き、ここで説明するように個々のプラナリアンを隔離するか、より高度なマルチオブジェクト追跡を採用することができます。同じアリーナに複数のプラナリアンを持つことの1つの問題は、彼らがパスを横断できることです。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アリルイソチオシアネート、95%(AITC)	Sigma-Aldrich	377430-5G	注意: 可燃性で急性毒性;適切なPPEを備えたヒュームフードでハンドルします。
カメラレンズ 2/3 25mm F/1.4	タムロン	23FM25SP
細胞培養プレート 6ウェル 組織培養処理済み	Genesee Scientific	25-105
遠心分離チューブ、50 mL ポリプロピレン、滅菌	MedSupply パートナー	62-1019-2
シンナムアルデヒド、>95%	Sigma-Aldrich	W228613-100G-K
調光可能 A4 LED トレーサー ライトボックス	Amazon	B07HD631RP
Flea3 USB3 カメラ	FLIR	FL3-U3-13E4M
耐熱手袋	フィッシャーサイエンティフィック	11-394-298
ホットプレート	フィッシャーサイエンティフィック	HP88854200
インスタント オーシャン シー ソルト、脱イオン水で調製	インスタント オーシャン	SS15-10	0.5 g/L の脱イオン水で調製します。
モンジüミリQ水で調製されたic塩	Sigma-Aldrich	種々	ミリQ水で1.6 mM NaCl、1.0 mM CaCl<サブ>2、1.0 mM MgSO<サブ>4、0.1 mM MgCl<サブ>2、0.1 mM KCl、1.2 mM NaHCO<サブ>3で調製し、HClでpHを7.0に調整します。
シャーレ、100 mm x 20 mm、滅菌ポリスチレン	Simport	D210-7
ペット、20-200 μL レンジ	レイニン	17008652
PYREX 150 mL ビーカー	Sigma-Aldrich	CLS1000150
カミソリ刃、0.22 mm	VWR	55411-050
Roscolux カラーフィルター: Golden Amber	Rosco	R21	または、3つのカラーフィルターがすべて含まれているRoscolux Designer Color Selector(Musson Theatrical製品 #SBLUX0306)を購入してください。
Roscoluxカラーフィルター: ミディアムレッド	Rosco	R27
Roscolux カラーフィルター: Storaro Red	Rosco	R2001
Samco トランスファーピペット、62 & マイクロ;L 大口径	サーモフィッシャー	691TS
サポートスタンド	フィッシャーサイエンティフィック	12-947-976
温度計	VWR	89095-600
UVレーザーポインター	アマゾン	B082DGS86R	これはクラスIIレーザー(405nm±10nm)出力電力<5mWです。