Method Article

CRISPR媒介ベース・エディタを用いた BRCA1 バリアントの機能評価

DOI:

10.3791/61557

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BRCA1突然変異を有する人々は、BRCA1変異体の機能の正確な評価を保証する癌を発症するリスクが高い。本明細書において、生細胞における標的C:GからT:A変換を可能にするCRISPR媒介シトシンベースエディタを用いたBRCA1変異体の機能評価用プロトコルについて説明した。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

最近の研究では、蛍光レポーターアッセイ、胚性幹細胞生存アッセイ、治療用薬物ベースの感受性アッセイなどの様々な機能評価方法を用いて 、BRCA1 遺伝子変異に関連するリスクを調査しています。彼らは多くの BRCA1 変異体を明らかにしているが、外因的に発現した BRCA1 変異体の使用を含むこれらのアッセイは過剰発現の問題に関連しており、転写後の調節には適用できない。これらの制限を解決するために、我々は以前、生細胞における標的ヌクレオチド置換を誘導するCRISPR媒介シトシン塩基エディタを介して BRCA1 変異体の機能分析方法を報告した。この方法を使用して、c.-97C>T、c.154C>T、c.3847C>T、c.5056C>T、c.4986+5G>Aなど、関数があいまいなままのバリアントを特定し、CRISPRメディア化された基本エディタが BR1の不確定な変異体の再分類に役立つことを確認しました。ここでは、CRISPRベースのシトシンベースエディタを用いた BRCA1 変異体の機能解析用プロトコルについて説明する。このプロトコルは、ターゲット・サイトの選択、機能分析、 および BRCA1 バリアントの評価に関するガイドラインを提供します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

乳癌タイプ1感受性遺伝子(BRCA1)は、広く知られている腫瘍抑制遺伝子である。BRCA1遺伝子はDNA損傷の修復に関連しているため、この遺伝子の変異は、個体1における癌発症のリスクが高くなる。乳癌、卵巣癌、前立腺癌、および膵臓癌はBRCA1遺伝子2の遺伝性機能喪失(LOF)突然変異に関連している。BRCA1変異体の機能評価および同定は、様々な疾患の予防および診断に役立つ可能性がある。BRCA1変異体の機能に対処するために、胚性幹細胞生存アッセイ、蛍光レポーターアッセイ、および治療用薬物ベースの感受性アッセイ3、4、5、6などのBRCA1変異体の病原性を調査するために、いくつかの方法が開発され、広く使用されている。これらの方法は多くのBRCA1変異体の機能を評価しているが、外因的に発現したBRCA1変異体を含む方法は、下流の調節、遺伝子投与量、およびタンパク質折りたたみ7に影響を及ぼす可能性のある過剰発現の点で制限をもたらす。さらに、これらのアッセイは、mRNAスプライシング、転写安定性、および非翻訳領域8,9の効果などの転写後の調節に利用することができない。

CRISPR-Cas9システムは、生きている細胞および生物10における標的ゲノム編集を可能にする。単一ガイドRNAを介して、Cas9は、エラーが起こりやすい非相同性末端結合(NHEJ)経路およびエラーを起こしやすい相同性指向修復(HDR)経路11の2つのDNA修復経路を活性化するために、特定のゲノム遺伝子座で染色体DNA中の二本鎖切断(DSB)を誘導することができる。HDR は、正確な修復メカニズムです。しかし、HDRのCas9ヌクレアーゼによって誘導されたDSBは、しばしば望ましくない挿入および欠失(indel)突然変異をもたらす。さらに、DNA損傷を修復するための相同なドナーDNAテンプレートが必要であり、効率が比較的低い。最近、Cas9ニッカーゼ(nCas9)は、C:GからT:Aの置換を標的とするシチジンデアミネーゼドメインと融合しており、相同なDNAテンプレートおよびDNA二重鎖破断12、13、14、15を必要としない。シトシンベースエディタを用いて、BRCA1バリアント16の機能解析のための新しい方法を開発しました。

本研究では、BRCA1変異体の機能評価を実施するために、効率的なC:GからT:A点突然変異を誘導するCRISPR媒介シトシンベースエディタBE314を用いて、いくつかのBRCA1変異体の機能を同定することに成功した(図1)。

figure-introduction-1
図 1: 機能評価のワークフローの概要(A) BRCA1の機能評価を示す回路図。 BRCA1 のLOFは細胞の生存率に影響を与えるので 、BRCA1 突然変異が病原性である場合、細胞は通過数が増加するにつれて死ぬ。(B) BRCA1の機能評価の段階 。ドット ボックスはオプションです。それは、プラスミドDNAを発現するgRNAとBE3の共トランスフェクションに置き換えることができる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注: 方法 1 (HAP1-BE3 セルラインの生成) はオプションです。BE3発現細胞株を構築する代わりに、BE3コード系プラスミドDNAをgRNAコードプラスミドDNAと共にトランスフェクトすることができる。BE4max のようなシトシンベースエディタの他のバリアントも、高効率なベース編集に使用できます。

1. HAP1-BE3細胞株の生成

  1. プラスミドDNAの構築
    1. レンチウイルス産生用レンチベ3ブラストプラスミドDNAを構築するために、高忠実度ポリメラーゼを用いたPCRによりpCMV-BE3(材料表)でBE3コード配列を増幅する。次のように、等熱アセンブリの(ステップ1.1.2から)消化されたベクターの重複する配列を含むPCRプライマーを設計します。
      プライマー F: 5'-TTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTCTAGA GCCGCCACCACCACCGAGッカガッカガグ-3',
      プライマー-R: 5'- カラガGTTGtTTTGCGGGATCCCCGCCCCCCCCCCCCCCCCCGCCCGCCCGCCCGCTTCCTCTTCTTGGG-3'
      注:下線付きのヌクレオチドは、消化されたベクターと重なり、これらの配列は、ユーザーが選択した宛先ベクトルに固有になります。
    2. 制限酵素を用いたプラスミドDNAをダイジェストlentiCas9ブラスト(材料表)、XbaIおよびBamHI(1μgあたり1単位)37°Cで1時間用いた。 0.8%アガロースゲルで消化された製品を実行し、市販のゲル抽出キット(材料表)を使用して適切なサイズのバンド(8.6 kb)を精製します。
    3. 等熱アセンブリキット(材料表)を使用して、増幅されたBE3 PCR産物と消化されたlentiCas9-Blastベクターをクローン化します。合計で0.02-0.5 pmolのDNA断片とベクターの1:3比を使用してください:insert.アセンブリ製品をDH5アルファコンピテントセル18に変換します。アンピシリン(100 μg/mL)を含む寒天プレートに形質転換体を加え、37°Cで一晩インキュベートします。
    4. いくつかのコロニーを選び、アンピシリン(100 μg/mL)を含むLB(リソジニーブロス)培地の4mLでそれらを接種し、180 rpmで振る培養器で培養を成長させます。
    5. メーカーのプロトコルに従って、市販のプラスミドDNA精製キット(材料表)を使用してプラスミドDNAを精製します。
    6. DNAクローニングの成功を確認するには、標準およびBE3特異的プライマー(補足表1)を用いたサンガーシーケンシング(補足表1)を用いて、精製されたプラスミドDNAのBE3配列(ステップ1.1.5から)を解析し、正確なクローンレンティBE3-ブラスト構築物を選択します。
      注: サンガーシーケンスの結果を分析するには、BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) や CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) などのツールを推奨します。
  2. HAP1-BE3細胞株の細胞培養および生成
    1. 健康な状態で、積極的に分割状態で細胞を維持します。イスコベの修飾されたダルベッコの培地中の

figure-protocol-1




figure-protocol-2



  1. figure-protocol-3

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルに記載された実験的アプローチは、CRISPRベースのシトシンベースエディタによって生成される内因性 BRCA1 変異体の機能評価を可能にする。 BRCA1 変異体の機能評価に適切な細胞株を選択するには、研究者は 、BRCA1 が標的細胞株に不可欠な遺伝子であることを確認する必要があります。例えば、まずCas9とgRNAをHAP1細胞株にトランスフェクトして BRCA1 を破壊し、標的深いシーケンシングによって突然変異周波数を分析しました。HAP1細胞株では経時の変異頻度が有意に減少することがわかった(図4A)。これらの結果は 、BRCA1がHAP1 細胞株における細胞生存率に不可欠な遺伝子であることを示した。C:G~T:A置換変異体が BRCA1の機能に影響を与えるかどうかを調べるため、各変異を誘導する可能性のあるプラスミドDNAコードGRNAをHAP1-BE3細胞株にトランスフェクトし、置換周波数を解析した。病原性変異体であるc.3598C>T(p....

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、CRISPR-瞑想されたシトシンベースエディタを用いた BRCA1 変異体の機能評価のための簡単な方法を説明する。プロトコルは、標的遺伝子座におけるgRNAの設計とそれらが発現するプラスミド・ドナの構築のための方法を記述する。シトシン塩基エディタは、活性ウィンドウでヌクレオチド変換を誘導する(BE3の場合、gRNA標的配列のPAM-遠位末端のヌクレオチド4〜8)。アクティブウィンドウ内のすべてのシトシンをチミンに置き換えることができるので、研究者は慎重にターゲット配列を選択する必要があります。さらに、ステップ5で説明したように、アクティブウィンドウ内の複数のシトシンを慎重に分析して BRCA1 バリアントの機能を評価する必要があります。

最も重要なステップの1つは 、BRCA1 機能評価の初期突然変異頻度に影響を与える標的細胞株におけるトランスフェクションである。初期突然変異頻度を改善するために、研究者は対象となる細胞株への送達方法を最適化すべきである。ステップ1で説明したように、細胞株を発現するBE3の生成は...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、韓国国立研究財団(助成金2017M3A9B4062419、2019R1F1F1F1057637、2018R1A5A2020732 Y.K.に支援されました)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHINEBR3136制限酵素
ブラストシジンサーモフィッシャーサイエンティフィックA1113903形質導入細胞選択薬
BsaINEBR0535制限酵素
DNeasy Blood &組織キットQiagen69504Genomic DNA prep. kit
Dulbecco'修正されたイーグル」s mediumGibco11965092Medium for HEK293T/17 cells Fetal
usvine serumGibco16000036Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection ReagentPromegaE2311Transfection reagent
Gibson Assembly Master MixNEBE2611LGibson assembly kit
Iscove'の修正ダルベッコ'Si 培地Gibco製 12440046HAP1細胞用培地
lentiCas9-BlastAddgene52962lentiBE3クローニング用プラスミドDNA
Lipofectamine 2000サーモフィッシャーサイエンティフィック11668027トランスフェクション試薬
Opti-MEMGibco31985070トランスフェクション材料
pCMV-BE3Addgene73021プラスミドDNAlentiBE3クローニング
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140細胞培養用サプリメタル
Phusion 高忠実度DNAポリメラーゼNEBM0530SQ高忠実度ポリメラーゼ
pMD2.GAddgene12259ウイルス調製用プラスミドDNA。
pRG2Addgene104174gRNAクローニングベクター
psPAX2Addgene12260ウイルス調製用プラスミドDNA。
QIAprep スピン ミニプレップキットQiagen27106プラスミドDNA調製キット
QIAquick ゲル抽出キットQiagen28704ゲル抽出キット
QIAquick PCR精製キットQiagen28104PCR製品調製キット
クイックライゲーションキットNEBM2200gRNAクローニング用リガーゼ
T7 エンドヌクレアーゼINEBM0302材料T7E1アッセイ
XbaINEBR0145制限酵素
用

References

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