方法論記事

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

DOI：

10.3791/61563

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2021年1月13日

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1Department of Biology, The Johns Hopkins University

この記事について

サマリー

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ここで提示される、インタクト組織における超解像ライブ細胞イメージングのためのプロトコルである。我々は、そのネイティブ組織環境で非常に敏感な成体幹細胞集団をイメージングするための条件を標準化しました。この技術は、生きた組織における生物学的現象の直接観察を可能にするために、時間的および空間的分解能のバランスを取ることを含む。

要約

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イメージングにおける空間的解像度と時間的解像度の間には、長い間重要なトレードオフがありました。光の回折限界を超えるイメージングは、従来、強力な蛍光シグナルで標識された組織外の固定サンプルまたは生細胞にのみ使用することが制限されてきました。現在の超高解像度ライブセルイメージング技術では、特殊な蛍光プローブ、高い照明、取得後処理を伴う複数の画像取得、またはしばしばこれらのプロセスの組み合わせを使用する必要があります。これらの前提条件は、この技術を適用できる生物学的サンプルおよびコンテキストを大幅に制限します。

ここでは、超分解能(〜140nm XY分解能)の蛍光生細胞イメージングをその時点で行う方法について説明する。この技術はまた、低蛍光強度、例えば、低発現遺伝子で内因的にタグ付けされたEGFPまたはmCherryと互換性がある。原理実証として、ショ ウジョウバエ 精巣の複数の細胞下構造を可視化するためにこの方法を用いてきた。組織の準備中に、細胞構造と組織形態の両方が解剖された精巣内で維持される。ここでは、この技術を用いて、微小管ダイナミクス、微小管と核膜の相互作用、セントロメアへの微小管の付着を画像化します。

この技術は、試料の調製、サンプルの取り付けおよび固定化に特別な手順を必要とします。さらに、標本は、細胞機能および活動を損なうことなく解剖後数時間維持されなければならない。ショ ウジョウバエ の男性生殖細胞幹細胞(GSC)および解剖精巣組織の前駆細胞における生きた超解像イメージングの条件を最適化しましたが、この技術は様々な異なる細胞タイプに広く適用されます。空間的または時間的な解像度を犠牲にすることなく、生理学的条件下で細胞を観察する能力は、細胞生物学における重要な問題に取り組む研究者にとって非常に貴重なツールとして役立ちます。

概要

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光の回折限界を超える分解能を持つ生細胞における細胞下構造およびタンパク質ダイナミクスの可視化は、典型的には1-3という非常に困難である。確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、光活性化局在化顕微鏡(PALM)、刺激放出破壊(STED)4、5、6顕微鏡検査などの複数の超解像技術が開発されている一方で、検体調製の合併症、および生きている生き物の生存率と活性を維持する必要性、ライブイメージング用の従来の超解像顕微鏡の使用が制限されています。従来の共焦点顕微鏡は、〜230 nmのXY解像度を超える空間解像度に達することができず、複雑な細胞下構造5,6を観察するには不十分であることが多い。しかし、最近の共焦点顕微鏡法の開発では、Airyscan超解像イメージングは、約140nm(XY解像度)7、8を達成することができ、ライブイメージングと互換性のある比較的簡単なサンプル調製物を有する。この撮像検出システムは、長い取得時間を必要とするため、その高い空間分解能は....

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プロトコル

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1. 生細胞イメージングカクテル(生細胞培地)の調製

  1. 15%のウシ胎児血清(FBS)と0.6xペニシリン/ストレプトマイシンとシュナイダーの ショウジョウバエ 培地を補う。pH を約 7.0 に調整します。
  2. 培地を使用する直前に、インスリンを200 μg/mLの最終濃度に加えます。
    注:この培地は、タイムラプスイメージング10、14の間に正常な細胞分裂およびショウジョウバエ精巣の発達を維持するために重要です。

ガラス底細胞培養皿の調製

  1. ショウジョウバエの精巣に直径35mmのポリL-リジンコーティングガラス底細胞培養皿を使用してください。皿の内側の井戸は直径23 mmのガラス底と1mmの高さの側面がある(図1A-a)。
    注:より短い作業距離、より大きな数値絞り、および高い倍率の目的を可能にするガラス底皿を選択してください。これらの機能は、超解像度のイメージを取得するために重要です。
  2. ガス交換を可能にする透析膜(MWCO:12~14kD)を使用します。膜を小さく切ります。
    注:膜片は、皿のガラス部分よりも小さい....

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結果

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ショウジョウバエ組織の回折限界を超えた生細胞イメージングは、特にGSCの場合、細胞周期進行の文脈における細胞内事象のダイナミクスを調査する機会を提供する。最近、このプロトコルを利用した研究では、母中心と娘の中心点での微小管活動がGSC10において時間的に非対称であることを示している。母心部は、有糸の開始の約4時間前に微小管を発するが、娘のセントロソームは、有糸分裂の発症時にしか微小管を発する。母心管からの非常に活性な微小管は核膜と相互作用し、偏極核エンベロープブレークダウン(NEBD)を誘導する。地元のNEBDはハブに近く、母親の中心から微小管が核に入り、より強い姉妹キネトコレと姉妹セントロメアに優先的に付着して、将来の幹細胞に分離することを確実にします。これらの観察は、微小管、核膜、キネトコレ、およびセントロメアが、最終的に10、11、12の適切な非ランダム染色体分離を確実にするために.......

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ディスカッション

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超解像顕微鏡法は、ナノメートル4、5、6の10sの高い空間分解能を提供する。STORMおよびPALM顕微鏡法では、最大20~50nm(XY解像度)の分解能が可能で、STED顕微鏡は20~100nm(XY解像度)の分解能を実現します。SIM顕微鏡の空間分解能は100〜130 nm15に制限されています。しかし、高光子密度と長い取得時間のため、これらの技術をライブセルイメージングに使用することは非常に困難です。

細胞骨格、染色体、組織内の生きた細胞の細胞内の細胞下構造、細胞質細胞のイメージングでは、高い空間分解能を持ちながら超高感度と非侵襲性の両方を持つ技術が必要です。ここで紹介する Airyscan 超分解技術は、コンフォーカルイメージングと 0.2 Airy Unit ピンホール、およびピクセルの再割り当てとデコンボリューションを組み合わせたものである。この技術は、従来の共<.......

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開示事項

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著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

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著者らは、ジョンズ・ホプキンス大学の統合イメージング・コア施設に、顕微鏡とデータ分析ソフトウェアに感謝したいと考えています。J.スネデカーとQ.E.ユーに校正と提案、X.Cラボメンバーに有益な議論や提案を感謝します。NIGMS/NIH R35GM127075、ハワードヒューズ医学研究所、デビッドとルシルパッカード財団、ジョンズホプキンス大学のスタートアップファンド(X.C.)

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Adobe Illustrator CS6 (フィギュア作成ソフト)AdobeN/A
透析膜Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membraneカタログ番号 08-67121
FBSThermo Fisher Scientificカタログ番号26140079 15% (V/V)
Fiji (解析ソフト)NIHN/A画像蛍光強度定量化
ガラス底細胞培養ディッシュ(FluroDish)株式会社ワールド・プレシジョン・インスツルメンツFD35PDL-100
Imaris (画像再構成ソフトウェア)ビットプレーンN / A3D画像再構成
イマージョンオイルツァイス イマーソール 518F/30 >C
インスリンシグマ猫。No. 15550200 µg/ml
ペニシリン/ストレプトマイシンInvitrogenカタログ番号 - 15140-1220.6x
Schneider Drosophila mediaInvitrogenカタログ番号 - 11720-034
63倍ツァイス対物レンズ(1.4 NA)を使用した、エボルブカメラ(フォトメトリクス)を搭載したスピニングディスク共焦点顕微鏡イスN/A
ティッシュペーパーKimwipeN/A湿潤チャンバーを形成する
LSM 800 共焦点顕微鏡 AiryScan超解像モジュールZeissN/A63倍ツァイス対物レンズ(1.4 NA)を使用した高感度GaAsP(ガリウムヒ素リン)検出器を搭載した
イメージングソフトウェア)ZeissN/A
ツァ。ツァイスN/A ZENS(

参考文献

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  1. Breedijk, R. M. P., et al. A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores. Scientific Reports. 10 (1), 5312(2020).
  2. Maddox, P. S., et al. Imaging the mitotic spindle. Methods in Enzymolo....

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タグ

Airyscan

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