マウス心臓における毛細血管、細動脈、および周囲細胞の動的測定とイメージング

サマリー

ここでは、中隔動脈がカニュール化および加圧されるように、動脈灌流圧および流れを維持する動脈灌流圧および流れのex vivoモニタリング、ならびに毛細血管床および周囲細胞を含む血管樹木成分のエキビボモニタリングによって、生きているマウス心臓組織における冠状微小循環を研究するためのプロトコルである。

要約

毛細血管の開閉と共に冠状動脈の緊張は、一定の灌流圧で心筋細胞への血流を主に決定する。しかし、心臓全体の冠状動脈と毛細血管の動的変化を監視することは困難である, 主にその動きとノンストップの鼓動.ここでは、マウス右心室の乳頭筋における動脈灌流速度、圧力、および動脈および毛細血管の直径変化をモニタリングできる方法について述べている。マウス中隔動脈は、一定の流れまたは圧力でカニューレ化され、他の動的に測定される。蛍光標識レクチン(例えば、アレクサ・フルオール-488または-633標識ウィート・ゲルム・グルチニン、WGA)で灌流した後、右心室の乳頭筋および中隔の動脈および毛細血管(および他の血管)を容易に画像化することができた。血管径の変化は、心臓収縮の有無において測定することができる。遺伝子組み換え蛍光タンパク質が発現した場合、特定の特徴を監視することができた。例えば、NG2-DsRedを発現したマウス心臓でペリサイトを可視化した。この方法は、心臓の毛細血管のペリサイトの生理機能を研究するための有用なプラットフォームを提供してきた。血管/毛細管径と動脈の光圧を同時に測定することで、心臓の血流に対する試薬の効果を研究するのにも適しています。この調製物は、最先端の光学画像システムと組み合わせることで、ほぼ生理学的条件下で心臓の細胞および分子レベルで血流とその制御を研究することを可能にする。

概要

適切な冠状動脈圧流制御は、その代謝要求を満たすために心臓に十分な血液供給を保証^{する 1}.しかし、過去数十年間に生体内およびインビトロで行われてきた広範な研究にもかかわらず、冠状動脈圧流が心臓でどのように動的に調節されているかは、最近になってようやく明らかになりました。その理由の一つは、心臓の絶え間ない鼓動によるこのような研究のための生理学的作業モデルの確立の難しさである。いずれにせよ、生体組織や動物における冠状動脈微小血管の観察には種々の方法が確立されているが、これらの方法のいずれも、圧力、流れ及び微小血管径の測定と一定/安定的な焦点を達成できなかった^2,3。心臓を鼓動する冠動脈微小血管の直接可視化は数十年前に^導入されました^4,3, 小血管の直径の測定は困難であり、微小循環に関連する多くの特殊な細胞タイプの特定の機能は同様に厄介でした.ストロボスコピック法と浮遊目的システムでさえ、上記の情報を同時に提供できませんでした⁵.それにもかかわらず、前述の技術を用いてかなりの量の貴重な情報が得られ、冠状血流の調節に関する理解を深めるのに役立^{っています。}この論文で説明する方法は、冠状動脈、細動脈および微小血管系の成分が刺激および代謝要求に対してどのように反応するかを調査し、詳細に理解するのに役立つ。

これらの研究を追求するために確立した作業モデルは、前作のWesterhofらの²に基づいて構築された。マウス心臓の中隔動脈のカヌル化後、生理食塩水は、筋細胞および心臓組織の他の成分を栄養を保つためにその動脈を浸透させるために使用された。動脈灌流圧、流れ及び血管径は、適切な蛍光指標を用いて他の生理学的機能の中でモニターした。この方法により、生体組織の生理的圧力下で冠状動脈性微小血管床を可視化し、初めて微小循環調節の基盤となる細胞機構を研究することが可能になります。

プロトコル

すべての動物ケアは、メリーランド大学ボルチモア校のガイドラインに従い、制度的動物ケアと使用委員会が承認したプロトコルに従っていました。

1. ソリューションの準備

注: 事前にソリューションを準備してください。実験には、(1)浴過性の生理食塩水(PSS)と(2)ルーメンパーフューズ剤のタイロードの溶液の2種類の基本的なソリューションが使用されています。PSSのpHを維持するために_CO2 による連続バブリングが必要です。HEPES緩衝タイローデの溶液は、気泡が血管に入るのを避けるためにPSSの代わりに内腔で使用され、気泡は内皮細胞⁷ を損傷し、流れを閉塞させる。

1. PSS ソリューション: PSS ソリューションの式と構成を表 1に示します。Ca²⁺フリーでグルコースフリーのPSSストックソリューションを10 Lにし、室温で保管します。1時間は、任意の手順の前に、5%CO2(74%N2および21%O2)で1Lのストック溶液と気泡を取り出し、溶液のpHを〜7.4に保つ。 1.8 g のグルコースと 1.8 mL CaCl₂ (1 M ストック)⁸を追加します。
   注:pHが〜7.4のときにバブリングした後にのみCa²⁺ を追加し、そうでなければ、Ca²⁺ が沈殿します。
2. タイロードの解決策: Tyrodeのソリューションの公式と構成を表 1 に示します。ソリューション(0.22 μm)をフィルターし、4 °Cで保存して、将来の使用^{のために9.}
3. タイロードの溶液をBDM(2,3-ブタネジオン単軸)と共に:BDMを可逆筋形筋糸阻害剤として添加して、筋細胞¹⁰の収縮を防止する。600 mg の BDM を量り、タイローデの溶液の 200 mL に追加します。.完全に溶解するまで、BDMで溶液をかき混ぜます。それ以上のろ過は必要ありません。
4. 将来の使用のために4 °CでBDMを含むタイロードの溶液を保管してください。

2. チャンバーの準備

1. メーカーの指示に従って、事前に解剖室と実験室の両方をポリジメチルシロキサン(PDMS)でコーティングしてください。
2. BDMを含むタイロードの溶液で解剖室を充填します。
3. 手順の1時間前にチラーをオンにします。温度を4°Cに設定します。

3. カニューレの準備

1. マイクロピペットの引き手をオンにします。製造元の指示に従って設定を選択します。
2. きれいなホウケイ酸ガラス管を取る(使用したガラス管の外径と内径はそれぞれ1.2mmと0.69mmであった)。
3. U字型のプラチナ加熱フィラメントを使用して、サッターピペットプーラーの溝付きクランプにガラスチューブを挿入します。
4. 引き手をアクティブにして、それぞれに長い薄い先端を持つ2つのカニューレを作ります。
5. 解剖顕微鏡の下で細かいハサミを使用して各カニューレの先端を切り取り、先端の最終直径を100〜150μm前後にします。
6. 火はカットカニューレの先端を磨き、鋭いエッジをわずかに丸めます。
7. 先端から約2mmのシャフトの側面に位置するプラチナワイヤー(細かい制御で加熱)を使用して、シャフトに沿ってカニューレを曲げます。カニューレの曲げ角度は約45°でなければなりません。
8. カニューレの開いた端を圧力ミオグラフ室のホルダーに差し込み、フィッティングを締めます。タイロードの溶液を充填した5 mLのシリンジを継ぎ手の反対側に接続します。カニューレをチャンバーに取り付けられたマイクロマニピュレータに接続します( 図1 および 図2を参照)。
9. シリンジ(5 mL)を使用してチローデの溶液でカニューレを充填し、それをフラッシュし、空気泡のチューブとコネクタ。
10. カニューレ化の手順の前に、所定の流れ範囲にわたってカニューレ内の灌流圧力を測定します(50〜300 μL/min、 図3)。新しいカニューレが使用されている場合にのみ行います。
    注:カニューレ内部の灌流圧力は流れに比例し、線形にフィットしています(図3)。

4. マウス心臓の抽出

1. イソフルランと酸素のタンクに接続されている麻酔ボックスにC57BL / 6マウス(性別、8-16週齢のいずれか)を入れてください。
2. 酸素タンクをオンにし、イオフルランの流れを開始します。マウスが完全に麻酔状態になるまで 5 分待ちます。
3. 麻酔が確立された後、麻酔ボックスからマウスを取り出し、血管構造中の血栓の形成を避けるために、ヘパリンIP(腹腔、360単位、0.5 mL/マウス)を注入します。その後、マウスを麻酔ボックスに戻します。
4. ヘパリンを注入してから10分、マウスを上振れしたベッドにスパーンの位置に移動し、ラベリングテープを使用して足を安定させます。鼻コーンを使用してイオブルランで完全な麻酔下にマウスを保ちます。
5. マウスの腹部の皮膚を鉗子で横隔膜の上に持ち上げ、手術用はさみを使ってダイヤフラムを切り取り、露出させます。
6. 横隔膜と胸骨を切ります。胸を開きます。
7. 胸部腔から心臓を解剖し、胸部壁にできるだけ近くに切断する。
8. 30 mM BDMを含む氷冷タイロードの溶液に心臓を置きます。
9. 心臓をきれいにして、肺などの結合組織を取り除きます。
10. 30 mM BDMを含むタイロードの溶液で満たされた冷やされた解剖チャンバーに心臓を移します。

5. 中隔動脈の準備とカヌリン

1. サーボポンプの電源を入れます。サーボポンプを「フロー」モードに設定します。チューブが血管内腔を穿ファミングするために使用されるTyrodeの溶液で満たされるまで、高速で実行してみましょう。チューブに泡がないことを確認します。その後、速度を下げます。
2. 心臓の中央部分に損傷を与えないように、心臓をPDMSに固定します。
3. 右と左の両方のアトリアを削除します。右心室を切り開き、解剖顕微鏡を使用して右心室の自由壁を取り除きます。
4. 中隔動脈を露出し、特定する。ナイロン糸(直径30μm)を中隔動脈の下に置き、将来の使用のために緩い結び目を結びます。
   注:中隔動脈は、解剖顕微鏡を使用して容易に識別することができる。中隔動脈は、ほとんどの場合、右冠動脈から起こっている中隔の主要な動脈である。
5. 細かいはさみを使用して左心室自由壁を取り外します。
6. 乳頭筋の準備をカニューレが配置された実験室に移す。チャンバーはBDMを含むタイロードの溶液で満たされている。このチャンバの底部は、PDMSの薄い(〜2mm)層でコーティングされています。
7. カニューレの位置を調整し(マイクロマニピュレータを使用)、中隔動脈のカニューレを可能にします。結び目を締めます。
8. 顕微鏡の目的が脈管構造の明確なビューを持っているように部屋の床に小さいピンを使用して乳頭の筋肉を固定します。カニューレの角度と位置に注意を払い、カニューレの先端が動脈壁に平行であることを確認します。
9. 試験缶取は、徐々にカニューレを介して注射器から溶液を排出することによってカニュール化を行う。すべての要素が正常に機能する場合, 乳頭筋の残留血液は、このプロセスの開始時に組織を出て、唯一のタイローデの溶液は後で見られます.

6. 準備の安定化

1. 過灌流液を提供する蠕動ポンプをオンにします。その後、常に3-4 mL /分の速度でプレガスPSSでバス内の準備を過熟させる。
2. スーパーフュージョン溶液の温度コントローラをオンにします。浴の温度を~35~37 °Cに調整してください。
3. カニューレをサーボポンプに接続します。圧力サーボコントローラに表示される圧力を読み取ります。
4. 流れと圧力を監視します。流量(μL/分)と動脈灌流圧(mmHg)はデジタイザを使用してデジタル化され、関連するソフトウェアを使用して記録される(図2)。
5. 流れを調整して圧力を10mmHgに設定し、約10分間動かします。
6. 明るい溶液の流れを増やして、動脈の圧力を60mmHgにします。カニューレの圧力降下を差し引くことによって、動脈自体の最終的な灌流圧を得る(図3)。
   メモ:圧力サーボコントローラの「圧力」モードを選択した場合、これらの実験では、発光圧力が〜60mmHgに設定されます。次に、フローの変化を監視します。
7. 流れや圧力レベルを監視して、サンプルを30~60分間安定させます。動脈圧の漸進的な増加は、通常、カヌリン化後の灌流の開始時に観察される。新しい定常状態は、約30分でそれ自体で確立されます(図4)。
8. 灌流圧力が安定した後(一定の流れで)実験を開始します。

7. 蛍光タグ付き小麦胚芽凝集剤(WGA)で調製物をロードする

1. アレクサ-フルーオール-488を含むタイロードのソリューションを調製し、100 μgの共役WGAをタイロードの溶液の5 mLに加えます。
2. 通常のタイローデの溶液から蛍光タグ付きWGAを含む溶液に慎重にパーフューズを切り替えます。気泡が導入されないように、慎重にパーフューザートを切り替える必要があります。
3. WGA灌流の〜30分後、またはWGA溶液がなくなったとき、パーフューズを通常のタイロードの溶液に戻します。

8. 細動脈と毛細血管の共焦点イメージング

1. ニポウディスク共焦点顕微鏡システムをオンにします。
2. 顕微鏡を使用して、透過光モードで低電力目標(4x)を使用して中隔動脈を見つけます。
   注:中隔動脈はカニューレの位置に従うことによって見つけることができる。
3. 回転ディスク共焦点で共焦点イメージングを開始し、488 nm励起レーザー、40倍の客観的な倍率を選択し、レーザー強度とサンプリングレート(画像あたり10〜500 ms)を調整します。
4. 共焦点顕微鏡の上と下のイメージング位置を設定して、イメージング範囲を定義し、zスタックイメージングのパラメータを入力します。
5. 使用しているシステムに推奨されるステップサイズを設定するか、ステップサイズを必要に応じて設定します。
6. Z スタック設定または時系列設定を選択します。
7. 新しいイメージを保存する新しいフォルダを選択または設定します。
8. [実行] をクリックして、後で分析するためにイメージングの記録を開始します (図 5)。

9. 血管拡張薬実験例:ピンアシチル誘発血管拡張(ビデオ1)。

1. ピンアシチルストック溶液(DMSOで100 mM)を準備し、4°Cで保存します。
2. タイロードの溶液の10 mLを準備します。ピンアシチルストック溶液を10 μL加え、ピンアシチルの最終濃度を100 μMにします。
3. 画像は、低倍率(4x目的)で乳頭筋を中隔動脈および枝動脈を含むようにする。
4. 発光溶液をピンアシチル含有溶液に切り替える。

10. 血流制御実験例:血管収縮剤誘発動脈灌流圧が一定の流れで増加する(図6)

1. エンドセリン-1(ET-1)ストック溶液(10 μM)を調製し、-20°Cで保存します。
2. タイロードの溶液の10 mLを準備します。ET-1ストック溶液(10μM)を10 μL加え、ET-1 10 nMの最終濃度を実現します。
3. 一定の流れで発光圧を記録し、乳頭筋を画像化します。
4. 発光溶液をET-1含有溶液に切り替える。

11. 毛細血管とペリサイトの画像例 (図7)

1. このプロトコルのセクション4に記載されているようにNG2DsRedBACトランスジェニックマウスを犠牲にします。
2. 心臓を抽出し、中隔動脈をカニューレ化し、Alexa-Fluor-488コンジュゲートWGAを5-7プロトコルでサンプルに負荷をかける。
3. 画像488nmおよび560 nm励起で乳頭筋、および510-525 nm、575-625 nm発光を共焦点を用いた。動脈圧は約40mmHgになります。

結果

蛍光血管マーカーが血管内腔に浸透する場合(ここでWGAはAlexa Fluor-488と共役)、高速共焦点顕微鏡を用いて 図5( 左パネル)に示すように、全血管樹木を可視化することが可能です。さらに拡大すると、毛細管の撮像を詳細に行うことができます(図5、右パネル)。加圧システムは、光圧の一定のモニタリングをサポートするので、この調製物は動脈圧と動脈直径の変化を関連付けるために使用することができる。 ビデオ1 は、ピンアシチル、ATP感受性^K+ チャネル(K_ATP)アゴニストが内腔から提供された場合、細動脈の直径が増加したことを示している。 図6 は、内腔から血管収縮剤ET-1を塗布した際に、動脈の直径が減少し、流れが一定に設定されたときに光圧が上昇したことを示す。

特定の細胞マーカーと組み合わせた共焦点顕微鏡の高解像度能力によ...

ディスカッション

本研究では、生理的条件下で心臓の冠状微小循環を研究する非常に単純でありながら非常に実用的なex vivo法を導入しました。この方法は、ラット²を用いた機械的調査から改変した。その他、高速かつ高い光学分解能を備えたイメージング技術が実現しました。そのため、現在市販されている高度な光学イメージングシステムを利用することができました。機能する乳頭筋の調製を良好な位置に丁寧に解剖し配置することで、細動脈、前細血管、毛細血管、および小胞、ならびに周囲の細胞を可視化することができ、他方を制御しながら動脈圧および/または流れを測定することができました。動脈および毛細管径変化を、高速回転円盤共焦点顕微鏡を用いてモニタリングした。生理食塩水の光学画像と内部灌流の組み合わせは、この調製を、生体医学的治療の効果の評価、^{ならびに心臓における}血流の生理学的および病理学的調節に関与するメカニズムの研究に有用である。

心臓乳頭筋は長年にわたり心臓生理学の研究で広く使用されてきました。しかし、「仕事」や「代謝」や「電気...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 M CaCl2 溶液	MilliporeSigma, USA	21115
1 M MgCl2 solution	MilliporeSigma, USA	M1028
AxoScope software	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Chiller/water incubator	FisherScientific, USA	Isotemp 3016S
Confocal	Nikon Instruments, USA	A1R
カスタムガラス管	Drummond Scientific Company	9-000-3301
Digidata 1322A	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
解剖顕微鏡	オリンパス, 日本	SZX12
Endothelin-1	MilliporeSigma, USA	E7764
鉗子	Fine Scientific Tools	11295-51
ヘパリンナトリウムSalt	Sigma-Aldrich, USA	H3393
Inline solution Heater	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	SH-27B
Isoflurane	VETone, Idaho, USA	502017
Micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97
Micropipette/cannula holder	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	64-0981
NG2DsRedBAC トランスジェニックマウス	ジャクソン研究所	#008241
血管を結ぶためのナイロン糸	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	THR-G
PDMS (ポリジメチルシロキサン)	SYLGARD, Germantown, WI, USA	184 SIL ELAST KIT
蠕動ポンプ	Gilson, Middleton, WI, USA	minipuls 3
Pressure ServoController	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-S
はさみ	Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA	15000-10
Servo Pump	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-P
Temperature controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor488コンジュゲート	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ	米国W11261

州