血管医療機器の血球適合性と宿主細胞活性化を調べるインビトロ血球ループモデル

医療機器のヘモ適合性試験は、体外膜酸素化のための血管ステントや灌流管などの新しいデバイスの開発において重要なステップです。今日まで、動物モデルは、ヒトでの実装前に医療機器をテストするための手順を最終決定するための標準的なツールと考えられています。したがって、動物の調査を最小限に抑えるためにさらに役立つ代替インビトロモデルを見つける必要があります。そこで今回の研究では、小型の体外血力学的ループモデルを検討しました。この提示方法の目的は、ISO 10993-4規格に従って医療機器のインビトロ血液適合性をテストすることです。

ISO 10993-4 標準は、血液検体¹で調査される臨床パラメータの標準化されたセットを記述します。簡単に言えば、これらは血栓症(血小板凝集およびカウント)、凝固(線維素ペプチドA、FPA)、血液学的分析(全血球数)、血糖分解指数(遊離血漿ヘモグロビン)および補体系(末端補体複合体、sC5b9)である。しかしながら、好中球多形核エラスターゼ(PMN)、インターロイキン6(IL-6)および腫瘍壊死因子-α(TNF)などの追加マーカーは、白血球の活性化状態を反映する測定についても考慮することができる。血漿中に存在する循環細胞遊離タンパク質を定量化し、サンドイッチ型結合免疫吸着測定法(ELISA)は、従来の最も信頼性の高い方法^2,3を表す。同様に、宿主細胞の表現型および活性化状態(例えば、白血球)は、単一細胞懸濁液を提供する分子の細胞表面発現を検出することによって定量することができる。これは、蛍光標識された特異的抗体が標的細胞表面分子⁴に結合するフローサイトメトリー(FACS)によって基づく。走査型電子顕微鏡法(SEM)は、ISO 10993-4規格¹による被試験材料上の血栓形成を決定するためにも推奨される。この方法は、X線マイクロトモグラフィー(μCT)を用いて補いることができ、血栓の構造解析を行う例えば、その厚さ、サイズ及び局在化を3Dレンダリング画像⁵に含む。

この体外血力学的モデルを使用する背後にある根拠は、原発性止血球または白血球に関与する血小板などの血液成分の基本的な生理学的ダイナミクスと、異なるタイプの血管デバイスとの相互作用を理解することによって、最良のパフォーマンスと互換性のある医療機器をスクリーニングすることです。このようなインビトロシステムは、動物実験の必要性を減らすため、非常に要求されています。

ここで提示されたループモデルは、これらの要求を満たしています。このモデルは、血.B血栓の生産のために1958年にチャンドラーによって最初に記述され、したがって、チャンドラーループモデル⁶とも呼ばれる。これまでこのモデルは、医療機器^{7、8、9、10、11、12、13、14}の血液生体適合性を調べる一連の実験と修正に使用されてきました。それは部分的に血液で満たされ、再凝固可能なループに形作られるポリマー管から成っている。これらのループは、温度制御された水浴で回転し、その出血性の影響を伴う血管流動条件をシミュレートします。ポンプ駆動モデルや、ループ内部の機械的なボールバルブを使用してポリマー管内の血流を誘導するモデルなどの代替方法は、すでに^15,16に記載されている。しかし、ここで提示される方法の全体的な利点は、血液細胞およびタンパク質に適用される機械的な力が低く、血化を避け、血液とコネクタの間に接触がなく、流れの乱流および血液成分の活性化につながる可能性があることである。ループ内の主な活性化因子は、試験材料自体と内部に閉じ込められている空気です。これは、たとえ血液空気界面がタンパク質変性¹⁷を導くことができる場合でも、測定誤差の原因を最小限に抑え、高い再現性を提供するのに役立ちます。長さやサイズ制限のないチューブ材やステント径の品種を調べて、長さや内径の異なるチューブの使用を可能にすることも可能です。また、不正確なループ閉鎖や未被覆チューブ表面への曝露に対する宿主のヘモコンパチリティも調査可能である。この体外血力学的ループモデルの他の同様の医療用途は、第一相I臨床試験の前に、または第一相I臨床試験の前に、または個々の薬物安全性スクリーニング中に免疫療法(薬物)と血液成分との相互作用を研究するためにも使用することができること、またはさらなる実験^18、19、20で使用することができる血栓物質の生成のためにも使用することができる。

本研究では、灌流管および/またはステントの血相溶性を試験するための詳細なプロトコルについて説明する。ここで、コーティングされていないPVCチューブとコーティングされたPVCチューブとの比較(ヘプPVC:ヘパリンコーティング、ポリPVC:生理活性ポリマーによるコーティング)。血小板の活性化が低下したが、非被覆チューブと比較して両方の被覆チューブに対して凝固系(FPA)の活性化が高いことが判明した。ここで使用されるhepPVCチューブは、血栓抵抗性²¹ を作るために共有結合ヘパリンで修飾され、すでに異なるパラメータ²²を最適化し、特徴付けるためにループモデルで採用されている。本研究で用いられるポリPVCチューブは、体外輸血の臨床現場で使用される市販のチューブであり、血栓原性²³を低下させるためにヘパリンポリマーでコーティングされている。時には、臨床用途においてもコーティングされていないPVCチューブが使用される。そこで、血小板、凝固系、IL-6、TNF、PMNエラスターゼなどの可溶性因子の過剰活性化を示す正の対照群としてラテックスチューブを含めた。不正確なループ閉鎖がシミュレートされた場合、血栓形成に気付いた。これは、ベースライン条件と比較して、凝固および補体系ならびに白血球および血小板の活性化につながった。さらに、ここで使用したステント材料(ベアメタルニチノールステント、炭素含浸されたポリテトラフルオロエチレンで覆われた)への血液接触は、PMNエラスターゼの点で高血小板および白血球活性化につながった。全体として、提示されたモデルは、赤血球(RBC)の血化が明らかであったラテックスチューブを除いて、ベースラインまたは静的条件に匹敵するため、試験された血管デバイスのいずれにも血球化を誘発しなかった。さらに、これらの灌流管は、イメージングまたは構造学のいずれかによって調べることができます。組織学的評価は実現可能かもしれないが、我々は主にELISAとフローサイトメトリーに焦点を当ててこれらの実験を行い、それによって多くの実験室で提示されたモデルに基づいて実験を実施する可能性を可能にした。従って、この方法は、ISO 10993-4規格の勧告に従って血管医療装置の血中生体適合性を試験する実現可能な方法を表す。さらに、この方法は、血液と材料との相互作用が流れ条件下でテストされるべきときはいつでも使用することができ、in vivo条件を模倣する。

本研究は、マクデブルク大学病院医学部の倫理委員会(申請番号88/18)と、血液描画手順の前に書面によるインフォームド・コンセントを提供した被験者によって承認されました。

1. ヘパリンストック調製と血液採取

1. 実験全体に必要な血液量を計算します。
   注:ほぼ、5 mLのヘパリン化された血液は、重複(ループ)の各血管装置に必要です。同様に、室温で脇に置かれる各ベースラインおよび静的状態に対して5mLの血液が必要である。
2. 脱分水中の未分離ヘパリン(例えば、ロテックスメディア)を希釈することにより、100 IU/mLの濃度でヘパリンストック溶液を調製します。10 mLの新鮮な血液のヘパリン化のためにこの溶液の150 μLを使用してください。
3. 全血球数、ELISA、FACSアッセイに必要な血漿と同様に血液量を計算します。
   注:この研究で表される測定値は、合計血液量10 mLの並列(重複として1つ)で実行されている2つのループから得られます。
4. 必要な血液量に基づいて、10 mLの注射器に150 μLのヘパリンストック溶液を充填し、最終的なヘパリン濃度1.5 IU/mLの血液で血液凝固を防ぎます。
5. 蝶を使用して血液を描画します (サイズ: 21 G).過度の真空による滑らかな、または細胞の活性化を避けるために非常に穏やかに注射器を充填してください。
   注:実験開始前に、地元の倫理委員会の許可を得る必要があります。各ヒトの献血者からインフォームド・コンセントを得る。血液供与者が健康であり、実験の少なくとも10日前に抗血小板薬や非ステロイド性抗炎症薬を服用していないことを確認してください。なお、同じドナーは、この原稿に示された異なるタイプの血管装置を初めて比較する場合に好ましい。さらに個人間の違いを評価するために、プロトコルは異なるドナーと繰り返すことができる。
6. ガラスビーカーに血液を集め、過度の攪拌を避けてください。

2. インビトロ血体ループアセンブリ

1. 水位が回転ユニットの中心まで達するまで水浴を満たします。水温を37°Cに設定します。
2. 異なるチューブ材料(ポリPVC、ヘプPVC、PVCおよびラテックス)をテストするためのループアセンブリ
   1. チューブカッターで、各チューブ素材(内径5mm)の長さ50cmの2枚をカットします。これは、フィッティングエッジに歪みなしで血液が流れるように、小径のループのための完璧な閉鎖のために特に重要であるため、切断面が平らであることを確認してください。
      注:このプロトコル全体は、5 mmの内径のチューブを利用します。
   2. 処理を容易にし、回転後のサンプル処理の遅延を回避するには、4 つのループ (2 つのマテリアルを複製) を並列に実行します。
   3. ループ形状を生成するには、チューブの開いた結端を、調査用チューブの外径に合ったシリコンチューブの短い部分に差し込みます。
   4. ループの適切な閉じを確保するためにポリカーボネート張力バンドを使用してください。初めて使用する場合は、必要な長さのはさみでテンションバンドを切断してループの外径に合うようにバンドの長さを調整し、3mmトルクレンチで固定します。
   5. 管の端点の点検の下でテンションバンドコネクタのロックねじを注意深く締めます。チューブの終端間に隙間が残らないように、閉じる力を調整します。ロックねじが完全に締め付けられており、ポリカーボネートバンドの張力が低すぎてチューブの終端間の隙間が縮まないように見える場合は、システムのロックを開き、テンションバンドの数mmをカットします。正確なループクロージャが達成されるまで、これを繰り返します(図1A)。
   6. チューブ素材が非常に柔らかく、テンションバンドの内側に滑り込む傾向がある場合は、ループをテンションバンドに電気テープで固定します(図1B,C)。
   7. テストループと同じ寸法の温度制御のためにPVCの追加ループを準備します。
   8. 水浴の外側の回転ユニットのループクレードルにループを固定します。その後、ループクレードルを水浴内の回転ユニットに取り付けます(図1E)。
   9. テンションバンドをループから部分的に解体し、各チューブの一方の端を抜いてループを開きます。
   10. 5 mL の血清ピペットで、各ループに 5 mL の血液をそっと充填します。ループにロードする前にゆっくりと上下にピペットを入れ、ガラスビーカーに血液を2回やさしく混ぜます。
   11. 使い捨て温度計を取り、温度制御ループの内部に置きます。温度計が大きすぎる場合は、小さいチューブに合うようにはさみで切ります。室温で5mLの脱イオン水でループを満たします。
   12. ループを閉じ、ループ、テンションバンド、ラックが適切に取り付けられているかどうかを確認します。
   13. 回転速度を毎分30回(rpm)に設定し、3時間回転します。
3. 不適切なループ閉鎖の影響をテストするためのループアセンブリ(ギャップ)
   1. 2.2 で説明されているように 4 つのループ (ポリPVC) を準備します。
   2. テンションバンドでループを2つ適切に閉じ、チューブの結末の間のギャップを避けてください。
   3. 他の2つのループの場合、2.2.3で説明したように、開いた結末を大きなチューブに差し込みますが、ループの終点の間に1〜2mmのギャップを残します。これらのループにはテンションバンドを使用しないでください(図1D)。
   4. 2.2.7 および 2.2.11 の説明に従って、1 つの温度制御ループを準備します。
   5. 2.2.10 で説明したように、すべてのループを血液で満たします。
   6. 回転速度を30rpmに設定し、3時間回転します。
4. ステントテストのためのループアセンブリ
   1. 2.2 と以下の説明に従って 4 つのループを準備します。
      注:ステントの血液生体適合性を評価するために、チューブ材料自体が細胞活性化のマスキングを防ぐために生体適合性であることをテストする必要があります。データが存在しない場合、チューブ材料自体は2.2に記載されているようにテストすることができます。さらに、ステント内の直径範囲は、(メーカーの指示を参照)適用することができ、チューブ材料の内径に合う必要があります。
   2. ループの2つを開き、テンションバンドシステムからチューブを取り出します。
   3. メーカーの指示に従って、ステントをチューブの中央に挿入します。
   4. コントロールとしてステントなしで他の2つのループを使用してください。2.2.10 で説明したように、すべてのループを血液で満たします。
   5. 回転速度を30rpmに設定し、3時間回転します。
5. 温度制御
   1. 回転が停止する間の任意の時点で、ループ内の血液の温度は温度制御ループ内の温度計によって示される。温度を読み取るためには、回転を停止し、温度計で示された温度をすぐに読み取ります。

3. 血液サンプル処理

1. 回転後、ループを上向きの位置に2分間ラックに立たせ、ループの下部に血液を蓄積させ、ループを開きながらこぼれないようにします。
2. 静的状態のために残された血液を検査する:この血液が凝固した場合、不適切なヘパリン化が最終的に疑われる。この場合、他の献血者でも実験を繰り返す。
3. ラックからループを慎重に取り出します。コネクタを開き、10 mLガラスビーカーに血液を流します。
4. 重複して実行されているチューブから血液をプールします。
5. 1.5および1.6で説明したのと同じドナーからのベースライン分析のための新鮮な血液を引き出す。
6. クエン酸ナトリウム血液の採取
   1. クエン酸ナトリウムの血液の収集のために、クエン酸ナトリウム管から採取した111μLクエン酸ナトリウム溶液をそれぞれ4個充填し、3.2%のクエン酸ナトリウムの最終濃度を生成する。
   2. 1.6および3.3に記載されているように、ガラスビーカーからの血液の1 mLで各チューブを充填します。
   3. 血液を室温に保ち、12に記載されているようにFACS分析のためにこの血液を使用してください。
      注: さまざまな実験用の設定でループの長さを変更するには、測定の量に基づいてアリコートを適切に計画します。ループ内の血液量がすべての測定に十分であることを確認するために、実際の実験の前に、新鮮な血液で必要なすべての測定を確立する必要があるかもしれません。
7. エチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)の血液および血漿サンプルの収集。
   1. 血液を含む各ガラスビーカー(1.6および3.3参照)から、4.5mlの血液を1つの5mlEDTAチューブに移す。各10mlガラスビーカーから2つのEDTAチューブを血液で満たします。
   2. 血をそっと混ぜて氷の上に置いておきます。
   3. 2 mLの血液を2mLのロック遠心チューブに移し、5に記載されているように血球数および遊離ヘモグロビン測定のためにこの血液を使用する。と6.
   4. 残りの血液を3,500xgで20分間遠心分離する。
   5. 上清中のプラズマを500μLのアリコートで慎重に回収し、すぐに-80°Cで凍結します。

4. 走査型電子顕微鏡・μCT画像

1. 血液サンプル処理後、2.3に記載された空のループをリン酸緩衝生理食塩分(PBS)10 mLずつリンスしてリンスします。
2. 各チューブの両端から1cmの長さのサンプルをメスで慎重に切り取ります。
3. 2%グルタルアルデヒド溶液中で4°Cで一晩インキュベートサンプル。
   注意:アルデヒド蒸気の吸入は、鼻水の鼻のかゆみや気道の刺激などの鼻症状を引き起こし、皮膚炎を引き起こす。アルデヒドは、手袋、保護ガウン、安全ゴーグルを着用しながら、ヒュームフードで処理する必要があります。
4. サンプルをPBSで(3回)すすいだ。
5. 脱イオン水にオスミウム四酸化(OsO₄₎の1%溶液を調製し、室温で15分間インキュベートサンプルを調製します。
   注意_:OsO4 は強い酸化剤であり、光への暴露によって低減することができる。調製中の減少を避けるために、OO₄ を茶色のガラス瓶に保管してください。OsO₄ は非常に揮発性であり、その煙は目、鼻および喉に有毒である。常に煙のフードの下で作業し、手袋を使用し、衣服を保護し、体の一部がOsO₄にさらされないようにします。廃棄物処理と保管の取り扱いに関する機関のガイドラインに連絡してください。一般的に、OsO₄ は数ヶ月間はケート可能ですが、OO₄ は漏れフームの存在下で冷蔵庫の内部表面や内容物を変色させることができるので、テフロンライナーとデシケータを備えた特別なガラス瓶が必要です。
6. サンプルを取り出し、新しい15 mL遠心管に移し、PBSで3回サンプルをすすいでください。
7. 様々な濃度のエタノールのシリーズを準備する(25%、50%、75%、95%、100%)
8. エタノール中の脱水サンプル:25%、50%、75%、90%および30分でそれぞれ20分間100%でインキュベートする。
9. 100%エタノールからサンプルを採取し、室温で一晩空気乾燥させます。
10. 走査型電子顕微鏡の加速度電圧5kV、X線μCTスキャナでサンプルを調べます。

5. 血球数

1. 3.7.3に記載されているように得られたEDTA血液の2 mLを取る
2. チューブを自動血液学アナライザーに挿入し、製造元の指示に従います。

6. プラズマ中の遊離ヘモグロビン(fHb)の測定

1. 3.7.5で説明した各条件から1個のプラズマサンプルを解凍する。解凍後に氷の上に保管してください。
   注:常に37°Cの水浴で凍結プラズマサンプルを解凍し、すぐにいくつかの水を含む氷に移して温度を下げます。これは、解凍中の血液成分の活性化を避けるために重要です.
2. fHb試薬を使用し、製造元の指示に従ってください。開封後の汚染を避け、試薬を直接光(太陽、紫外線)から保護します。
3. 1:5希釈でピペット方式(メーカーの指示を参照)を使用してください。
4. 1.6 mLセミマイクロキュベットに1000 μLのヘモグロビン試薬を加えます。このキュベットを使用して、空白の値を決定します。
5. ヘモグロビン試薬1000μL、プラズマサンプル250μLを別のセミマイクロキュベットに加えます。
6. 反応混合物を繰り返し充填してピペットを十分に洗い流して両方のキュベットに内容物を混ぜ、室温で少なくとも3分間インキュベートする。
7. 空の試薬としてfHb試薬に対するサンプルの消滅(E)を決定する。サンプルの fHb 濃度 (mmol/l) を計算します: E₅₄₀-E₆₈₀ x 0.452.

7. FPAの測定

1. 3.7.5で得られた各条件からプラズマサンプルを解凍し、解凍後に氷の上に保存する。
2. FPA エリサ キットを使用し、製造元の指示に従います。

8. sC5b9の測定

1. 3.7.5で得られた各条件からプラズマサンプルを解凍し、解凍後に氷の上に保存する。
2. sC5b-9 ELISAキットを使用し、製造元の指示に従ってください。

9. PMNの測定

1. 3.7.5で得られた各条件からプラズマサンプルを解凍し、解凍後に氷の上に保存する。
2. PMN-エラスターゼ ELISA キットを使用し、製造元の指示に従ってください。

10. TNFの測定

1. マイクロプレートは、ELISAを実行する前に1日前にコーティングする必要があります。コーティングの場合は、100 μLの捕捉抗体溶液をすべてのウェルに加え、シールプレートを2°C~8 °Cで一晩インキュベートします。
2. 3.7.5で説明した各条件から1個のプラズマサンプルを解凍する。解凍後に氷の上に保管してください。
3. TNF ELISAキットを使用し、製造元の指示に従ってください。

11. IL-6の測定

1. マイクロプレートは、実験の1日前に捕捉抗体でコーティングする必要があります。コーティングの場合、セット、シールプレートを備えたマイクロプレートのすべてのウェルに100 μLの捕捉抗体溶液を加え、4°Cで一晩インキュベートします。
2. 3.7.5で説明した各条件からプラズマサンプルを解凍する。解凍後に氷の上に保管してください。
3. IL-6 ELISAキットを使用し、製造元の指示に従ってください。

12. FACS 分析

1. 1x PBSの488mLに10mLの胎児子牛血清と2 mLのEDTA溶液(0.5 M)を加えて、500 mLのFACSバッファーを調製します。FACSバッファーは4°Cで4週間保存することができます。
2. 各染色手順(単球血小板凝集体(MPA)、血小板活性化(PA)、白血球インテグリン(LI)))ごとに、クエン酸ナトリウム血液100μL(3.6.3参照)を使用してください。
3. ピペット100μLの血液を各サンプルから5 mL FACSチューブに入れた。各サンプルから、MPA(単球血小板凝集体)パネル、PA(血小板凝集体)パネルおよびLI(白血球インテグリン)パネルで抗体染色および標識用3チューブを調製する。
4. 残りの4サンプルを1本の5 mL FACSチューブに混ぜます。このミックスは、非染色および蛍光マイナス1(FMO)コントロールに使用します。
5. 混合サンプル血液100μLを各チューブにピペット処理して、6本のFACSチューブを調製します。FMO-CD41、FMO-CD62PおよびFMO-CD162として3管を染色なし、3管にラベルを付けます。
6. 4%パラホルムアルデヒド溶液の100 μLを加え、室温で暗闇の中で15分間インキュベートします。
   注意:パラホルムアルデヒドは皮膚および眼に有毒である。吸入すると深刻な肺刺激を引き起こし、長期暴露後に肺損傷を引き起こす可能性があります。さらに、発がん性物質と生殖毒素に分類される。常に手袋と安全メガネを着用し、煙のフードの下で動作します。
7. 各チューブに1mLの洗浄バッファーを加え、遠心分離機を287 x g で5分間追加します。上清を捨て、2回洗浄を繰り返します。
8. 赤血球(RBC)リシスの場合、1xバッファーRBCライシスバッファー(脱イオン水中の10倍RBCライシスバッファーを希釈)の1mLを加え、ゆっくりと上下にピペット化して混ぜ、暗闇の中でRTで5分間インキュベートします。
9. 単一の汚れのための補償ビーズを準備します。FACSバッファの1 mLに各正および負のビーズの4滴を加える。渦を徹底的に、1つの5 mL FACSチューブに100 μLのビーズ溶液を加えます。
10. ビーズとラベルを付けて4つのチューブをCD14-FITC、CD41-BV421、CD45-APC、CD62P-PEとして用意します。各チューブに1mLのFACSバッファーを加え、287 x gで遠心分離機を5分間追加します。上清を捨て、氷の上に置いてください。
11. RBCのリシスの後、各チューブに1mLのFACSバッファーを加え、12.7に記載されているように洗浄します。上清を捨てる。
12. 抗体カクテルを準備する:
    1. MPAパネル:CD45-APC 4 μL、CD14-FITC 4 μL、CD41-BV421 から 388 μL の FACS バッファを追加します。
    2. PAパネル:386.4 μLのFACSバッファにCD41-BV421および12 μLのCD62P-PEを加えます。
    3. LIパネル:4 μLのCD45-APCと8 μLのCD162-BV421を388 μLのFACSバッファに加えます。氷の上に置いておきなさい。
13. 単一の汚れを準備する:CD14-FITC、CD41-BV421およびCD45-APCのためのFACSバッファの499.5 μLのそれぞれに0.5 μLを加える。CD62P-PE の場合、FACS バッファの 499.7 μL に 0.3 μL を追加します。氷の上に置いておきなさい。
14. FMOコントロールの準備: (i) MPA パネル (FMO-CD41): 1 μL CD14-FITC抗体とCD45-APC抗体 1 μL を 98 μL FACS バッファに追加します。(ii) PA パネル (FMO-CD62P): CD41-BV421 の 0.4 μL を 99.6 μL の FACS バッファに追加します。(iii) LI パネル (FMO-CD162): 1 μL の CD45-APC を 99 μL の FACS バッファに追加します。FMO コントロールを氷の上に置いておく。
15. ボルテックス抗体カクテルを12.12で調製した各抗体カクテルを、12.3に記載されているように各ラベル付きチューブ(MPA、PAおよびLIパネル)に加え、上下にピペット処理して穏やかに混ぜます。暗闇の中でRTを続けてください。
16. ボルテックス単染色抗体希釈液を12.13で調製した単染色抗体希釈液の100μLを添加した。12.7で説明したようにビーズとそれぞれのラベル付けチューブのそれぞれに、上下にピペットを通して穏やかに混ぜます。暗闇の中でRTを続けてください。
17. ボルテックスFMO抗体カクテルを12.14で調製した各FMO-1抗体カクテルを100 μL加えます。12.5 に記載されているように、それぞれのラベル付きチューブ(FMO コントロール)のそれぞれに。上下にピペットを入れ、軽く混ぜます。暗闇の中でRTに保管してください。
18. 暗闇の中でRTで30分間抗体染色を用いてすべてのチューブをインキュベートします。
19. 3本のチューブを取って、不染色コントロール(12.4)を取り、250 μLのFACSバッファにペレットを再懸濁します。氷の上に置いておきなさい。
20. インキュベーション時間後、12.7に記載されているように、FACSバッファで未染色コントロールを除くすべてのチューブを1回洗浄します。250 μL の FACS バッファにペレットを再懸濁し、フローサイトメーターのデータを取得します。
21. FACS ソフトウェアで正の設定を行う場合は、負の設定と補正マウス ビーズに対して、染色されていないセルを使用します。また、FMOを使用して格言戦略を制御し、ここでFMO-CD41がMPAパネルで使用され、FMO-CD62PはPAパネルで使用され、FMO-CD162はLIパネルで使用される。
22. FACS 用チューブあたりほぼ 0.5 x 10⁶ ~ 0.25 x 10⁶ イベントを取得します。データを保存し、分析ソフトウェア(バージョン9.9.6)で分析します。

FACSプロットを除くすべての提示データを統計ソフトウェアで分析した。FACSプロットは、フローサイトメトリーソフトウェアを用いて分析した。

全血球数の分析では、全ての試験条件間の赤血球に関して有意な差は示されなかった(図2)。しかし、ラテックス群では血小板および白血球が大幅に減少し、ラテックスの生体適合性が非常に悪いことが示された。これは、ラテックス群における遊離ヘモグロビンのレベルの増加によってさらに下線が引かれ、ラテックス群を除いて、他の血管装置または条件のいずれも広範な浸透性の高い浸透に至ったことを示している(図2)。さらに、コーティングされたPVCチューブ、ポリPVCおよびヘプPVC、ならびに試験されたステントは血小板および白血球損失によって血栓症を引き起こさなかったが、ラテックスは最も高い血小板および白血球損失を示し、続いて、減少傾向を示すコーティングされていないPVCチューブが続いた。

試験された血管デバイスはすべて凝固系(FPA)および補体成分(sC5b-9)の活性化を増加させたが、hepPVCループは、ポリPVCループと比較してFPAおよびsC5b-9のレベルの低下傾向を示した(図3)。興味深いことに、コーティングされていないPVCとギャップループは、統計的有意性のレベルに達していないが、ポリPVCと比較してFPAの低レベルを示した。しかしながら、ラテックスループは、ベースラインおよび静的条件と比較して、FPAの有意なレベルを示した。

全血球数に応じて、ラテックスループは最高レベルのTNF、IL-6および PMNエラスターゼ(図4)を示し、TNFおよびIL-6(図4A,B)の点で他の群と比較すると統計的有意性のレベルに達する一方、PMNエラスターゼ(図4C)の観点から静的およびベースライン条件に達した。これらの結果は、ラテックスによる白血球の強力な活性化を示す。活性化マーカーのベースラインレベルは、常に静的な条件に匹敵し、血液の適切なヘパリン化を示した。

興味深いことに、ギャップ誘発ループの血小板および白血球数は、凝固系(FPA)および白血球(PMNエラスターゼ)の適度な活性化でわずかに減少しただけであったが、結果として生じる流れの乱流と血の接触を伴う不適切なループ閉鎖は、コーティングされていない、粗い切断面が壊血球状に見える塊につながった(図1F)。スプライス表面全体の血栓とその分布はμCT画像とSEM画像で明らかでしたが、ループ終了間隙を残さずに外部閉鎖装置でループを閉じたときに血栓は見つかりませんでした(図5)。

血小板特異的マーカーで染色された宿主血液細胞のフロー細胞量分析は、CD41および血小板活性化マーカーCD62P、図6A、Bに示されている。ここで、ラテックス管は、血小板上のCD62Pに対して非常に高い中央値蛍光強度(MFI)を示し、続いてステント、ヘパリン被覆ポリPVCチューブはポリPVCチューブの抗血栓原性を描写する血小板の最小限の活性化を示した。さらに、白血球は(i)顆粒球にCD45およびSSC(側面散乱)ベースの粒度に基づいて分類された。(ii)単球および(iii)リンパ球(図7)と、血小板24上のCD62Pと相互作用することが知られている白血球の各亜集団に対してCD162+インテグリンの発現が検出された。ラテックスループの顆粒球やリンパ球では、インテグリンの表現が大幅に減少していることに気付きました。この結果は、ラテックスループ中の白血球の全周波数の低下レベルに沿ったものでした(図2)。一般に、インテグリンレベルは顆粒球およびリンパ球と比較した場合の単球の間で高く、活性化された血小板との単球相互作用の可能性を示す。この点に関して、単球血小板凝集体は、血液細胞をCD14(単球マーカーとして)およびCD41(血小板マーカーとして)で染色し、最終的には二重陽性細胞すなわちCD14+CD41+MPAを同定することによって評価した(図8)。ここでは、ステントグループがMPA上で最高レベルのCD41発現を示し、続いてラテックス群が続き、単球の頻度が減少したにもかかわらずMPAを形成する傾向が高まることに気付きました(<1%)ラテックスループで。

図1:体外血学的ループモデルとその変更の概要(A) 外部ループ閉鎖システムを使用したギャップ実験のループで、スプライスに隙間を残さない。(B)ポリPVCコーティングされたPVCチューブとステント(矢印)で作られたループ。(C)ラテックスチューブで作られたループ。(D) 外部ループ閉じるシステムがチューブの終わり(矢印)の間に隙間を残さずに、ギャップ実験のためのループ。(E) 水浴中のループクレードルに入れ、血で満たされたループ。(F)回転後にスプライス(矢印)に隙間が生じる血栓。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:血球数と血漿ヘモグロビンの結果(A) 赤血球数.(B) 血小板数。(F)白血球数.(D) 遊離血血漿ヘモグロビン。結果はラテックスの生体適合性が悪く、過剰な溶出を引き起こし、その結果を示す。データは平均値として表示されます。エラー バーは SEM を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:凝固および補体系の活性化の結果。(A)凝固系活性化は、フィブリノペプチドA(FPA)(B)補体系活性化のレベルで測定し、sC5b-9のレベルで測定する。ラテックスチューブはFPAの有意な上昇レベルを呼び起こしたが、補体活性化はすべての試験材料に強かった。データは平均値として表示され、エラー バーは SEM を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:白血球活性化マーカー。(A) 腫瘍壊死因子α (TNF)(B) インターロイキン 6 (IL-6) (C) PMN エラスターゼ. この結果は、分析されたマーカーのレベルの上昇による白血球の活性化の増加を示し、続いてステントループが続き、PMNエラスターゼのレベルは増加したが、TNFまたはIL-6は増加しなかった。データは平均値として表示され、誤差範囲は SEM を示します。**p<0.01、n=1。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:ループのスプライスのイメージング。(a) 不適切な閉じるループのμコンピュータ断層撮影 (μCT) (ギャップ)赤い領域は血栓物質を示す。(B)チューブの明るい側のレンダリング。矩形選択は、走査型電子顕微鏡(SEM)(C)の領域を示す。(D) 外部ループ閉結装置を備え、スプライスに隙間がないループの μCT、および(E)照明表面のレンダリングとビュー。血栓材料は見つからなかった。(F)の矩形選択のSEM画像(E)切断面に血栓材料は見つからなかった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:血小板活性化のためのFACSプロット(CD62P)。(A)血液CD41+血小板を示す代表的なFACSプロット(基本条件)。(B)静的RTおよびベースライン条件と比較して異なるタイプの血管デバイスの平均蛍光強度(MFI)によって反映される血小板活性化状態を示すグラフ。データ バーには、単一の測定値のデータが表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7:白血球インテグリン(CD162)のFACSプロット。(A)血液CD45+白血球およびサブグループを示すFACSプロット(基本条件)を示す代表的なFACSプロット(B)は、静的およびベースライン条件と比較して異なるタイプの血管デバイスの白血球CD162+インテグリン平均蛍光強度(MFI)を示すグラフ。データ バーには、単一の測定値のデータが表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図8:血小板単球凝集体(CD41/CD14)のFACSプロット。(A)血液単球の格子(CD45+/CD14+)、血小板(CD41+)および単球血小板凝集体(CD41+/CD14+)(B)の各々の血管の血小板凝集体に対するCD41+平均蛍光強度(MFI)を示すグラフと静的条件と比較した代表的なFACSプロット(基本条件)データ バーには、単一の測定値のデータが表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

●「エボクンゼインダストリーデザイン、イム・デンテル17、72639ニューフェン、ドイツ」は、この原稿の著者に消耗品と出版料の形で財政支援を提供しました[マックス・ワッカー]。資金提供者は、研究設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備において追加の役割を持っていませんでした。