ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

サマリー

ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ 胚をマイクロインジェクトし、同時に画像化するプロトコルです。

要約

定量的な生細胞イメージングにおける最新のアプローチは、生物学的プロセスを分類して比較するために統計と計算モデリングを使用することによって、細胞生物学を探求するための不可欠なツールとなっています。細胞培養モデルシステムは高含有イメージングに最適ですが、細胞形態の高スループット研究は、生物内の細胞に見られる形態学的複雑さを再現する上で、ex vivo培養が限られていることを示唆しています。そのため、無傷の生物の中で生きている細胞をイメージするために、スケーラブルな高スループットモデルシステムが必要です。ここで説明する高コンテンツ画像分析装置を用いて、同期性芽胚期の胚性 ショウジョウバエメラノガスター 発生の複数のタイムラプスビデオを同時に取得するためのプロトコルを説明する。同期性ブラソデアルは、伝統的に生物学的事象をイメージングするための素晴らしいin vivoモデルとして機能してきました。しかし、定量的およびハイスループットアプローチのためのかなりの数の実験複製を得る作業は、実験反復ごとに単一の胚のイメージングによって、労力を要し、制限されている。ここで提示される高内容の画像化システム、または自動マルチポイント獲得が可能な任意の逆顕微鏡に合わせて画像化およびマイクロインジェクションアプローチを適応させる方法を提示する。このアプローチにより、単一のイメージングセッション内で、望ましい取得因子に応じて6~12個の胚を同時に取得できます。

概要

過去30年間、生細胞イメージングのためのイメージング技術と分子プローブの進歩は、細胞の複雑さと内部の働きの理解を深めてきました。この技術の前進に伴うことは、高スループットイメージングデータを取得するためのex vivo細胞培養モデルの使用に大きく依存しています。細胞培養モデルは、マイクロ流体系を介した微小環境の制御、および複数の細胞を同時に画像化する能力を含むいくつかの利点を提供し、ハイスループットスクリーニング^1,2に必要な定量的アプローチの使用を可能にする。しかし、2次元ガラスやプラスチック表面など、細胞形態学的研究の文脈において、細胞培養モデルに関連する重大な欠点もあり、細胞形態とその調節^3、4、5に交容する効果を生み^出す。これらの効果は、細胞形態を調節する生物学的プロセスの研究に関して、偽または誤解を招くデータを提供することができます。

別の方法は、無傷の生物⁶の文脈で細胞形態を研究することであったが、少数の適切な無傷の生物は、イメージングを通じて生物全体を生き続けるのが難しいため、高スループット定量的な生細胞イメージングを促進し、大きな多細胞生物の中でのイメージングに関連する課題を促進する。その結果、無傷の生物の細胞生物学的研究は、一般的に、サンプルサイズを大幅に制限する単一の生物を観察することに焦点を当てています。さらに、この一時の動物の制限は、ライブイメージングが困難で、画面の形で採用するのにコストがかかり、サンプルの数が一般的に少なすぎるため、定量分析ツールを適用する能力を制限します。したがって、高含有量的アプローチに使用できる多細胞モデル生物の必要性が生じる。

このプロトコルは、ショウジョウバエ胚をプレートベースの高含量イメージングに適応させ、定量分析に十分な大きさの実験サンプルサイズを生成します。ショウジョウバエメラノガスターは、一般に最初のモデル生物として知られています。ショウジョウバエを用いた研究は、遺伝情報の伝達、細胞シグナル伝達経路の同定、および胚発生^7、8、9の遺伝的要件を含む細胞および分子生物学におけるブレークスルーを導いた。さらに、ショウジョウバエ胚は、細胞分裂^10、11、12の間に生体内微小管ダイナミクスを探索するために使用されてきた。微小分子および分子プローブを送達するためのマイクロインジェクションの使用は、ショウジョウバエ胚発生を生体内^13,14で細胞プロセスを探査する上で特に強力な時間制御を提供する。しかし、従来のイメージングアプローチでかなりの数の実験反復を生成することは非常に労力がかかり、高スループットのイメージング画面や定量分析での使用が制限されています。我々のアプローチは、一般的に単一細胞分析のために予約された高含有分析器を利用し、初期のショウジョウバエembryoのシンジチウムにおける生体内イメージング解析に適応する。

このプロトコルは、ショウジョウバエ胚を収集、ステージ、およびマイクロインジェクトして、有糸分裂¹⁵の間にエンドプラスミクスレチクルム(ER)の形態変化を駆動するメカニズムを探索するために使用された。多くの研究は、細胞周期^{16、17、18、19}の間にERの動的性質を概説しているが^、ER形態に対する時間の経過に及ぼす複数の摂動の影響を比較することは困難であった。細胞分裂全体にわたってER形態の変化を促進する成分を同定するために、このプロトコルに記載されている方法は、ショウジョウバエ初期胚における皮質合分分裂を用いた有糸性ER再編成における微小管および他の細胞骨格因子の役割を調査するために使用された。一緒に言えば、ショウジョウバエコミュニティ内の遺伝的摂動の可用性、開発中の正確な時期に薬物および分子プローブをマイクロ注入する能力、およびショウジョウバエとの作業の安価なコストは、このアプローチを高スループット画像ベースのスクリーニングに非常に受け入れやすい。ここで説明する方法は、ショウジョウバエ胚²⁰を用いて生体内での多種多様な細胞および発達過程を研究するために適用可能である。具体的には、このプロトコルは、ショウジョウバエ胚皮質の100ミクロン以内に長期間にわたって発生する生物学的事象を研究するために十分に適応される。

プロトコル

注: メディアとソリューションのレシピについては 、表 1 を参照してください。

1. 生分析用の胚収集ケージの設定と維持²¹

1. 新鮮な胚コレクションケージに新鮮なハエを取り込みます。
   注:市販のコレクションケージが推奨されますが、コレクションケージは、空のフライボトル²¹から簡単に構築することができます。
   1. 多くの子犬がステージp14で暗くなり始めると、ボトルから大人のハエを捨てるか、または移します。20°Cでは、卵が²²に産まれた後、およそ14日後に発生する。
   2. 子犬が孵化し、12-24時間のボトルを埋め込むことを許可します。
   3. ハエが逃げるのを防ぐために、コレクションケージの開口部の上に小さな漏斗を使用して、新鮮なハエを小さなコレクションケージに移します。最大3本のボトルを組み合わせて、200~500個のハエを含む人口密度の高いケージを作り出します。
   4. 移動ハエは、硬い表面に対してハエボトルを繰り返しタップしてコレクションケージに入れます(ハエをスタンする)。その後、コレクションケージ漏斗の上にフライボトルを開いて反転します。コレクションケージにハエをドロップするためにコレクションケージに開いたボトルを数回タップします。
   5. すぐにプラグの上に置くことによって、オープンフライボトルを閉じます。漏斗からプラグに開いたフライボトルを移す間、ハエがタッピングの源から這い上がる傾向があるため、ボトルの開口部が下向きであることを確認してください。
   6. フライケージの開口部に対して漏斗を押し、ケージを硬い表面で繰り返しタップして、ハエを中にスタンさせます。すぐに漏斗を取り除き、フライケージ開口部に新鮮なブドウプレートを固定します。ぶどう板を固定するために、ラベルテープを使用してください。このプロセスを繰り返して最大3本のボトルを組み合わせて、人口密度の高いコレクションケージを生成します。
      注:または、ハエはCO₂ または他のフライスリーピングエージェントを使用して麻酔することができます。ただし、この場合、ステップ 1.2 で順応期間が長くなります。
2. 24-48時間のための新しいコレクションのケージを順応。CO2または他の任意の睡眠剤を使用した場合、コレクションケージを少なくとも48時間順応する。
   1. コレクションケージのブドウプレートを、酵母ペーストを含む新鮮なものと1日2回、8〜10時間離して交換します。
3. 5日ごとに新鮮なコレクションケージをセットアップします。

2. イメージング用の胚の収集と準備

1. 同期発達を伴う胚の取得
   1. コレクションケージのブドウプレートを、中央に酵母ペーストのダブを含む新鮮なものと交換します。ハエが1時間胚を置くことを許可します。古いブドウプレートを引き出します。
      注:ハエは、それらを敷設する前に胚を受精することができます。最初のコレクションプレートには、これらの未開発の胚の多くが含まれます。ハエが最初に古い胚をダンプすることを許可することは、胚間の発達同期を改善する。
   2. ブドウ板を中央に酵母ペーストのダブを含む新鮮なものと交換し、ハエが胚を10分間置きます。古いブドウプレートを引き出します。
      注:冷たいプレートの胚発生を遅くしないように、使用前にブドウ板と酵母ペーストを室温に温めます。
   3. ブドウ板を新鮮なもの(酵母ペーストなし)と交換し、古いブドウプレートを保存し、イメージング用の胚を有する。必要に応じて、ステップ2.1.2および2.1.3を繰り返して、このケージから胚を収集し続けます。
2. 年齢は、画像の同期分裂²³に30〜45分の胚を収集します。
   注:胚発生中のシンシチアルブラスタードアルムステージを画像化するには、胚を取り付け、収集の90分以内に顕微鏡に取り付ける必要があります。このプロトコルを初めて試すとき、ステップ2.2で10〜20分の胚を老化し、ステップ間のセットアップに余分な時間を提供する。
3. DI水中に50%の漂白剤を有するデコリオネート胚。
   1. ステップ2.2から140 nmふるいに熟成胚を移し、ブドウ板をDI水で満たし、胚をペイントブラシでそっと取り除き、胚を140nmふるいに水を注いだ(図1A)。
      注:これは、シンクまたは1,000 mLビーカーを介して行うことができます。
   2. 噴出ボトルを使用してDI水で胚を精力的に洗浄します。乾燥したペーパータオルにふるいを吸い取ることによって乾燥胚。ペーパータオルにウォーターマークを残すまでふるいをブロットします(図1B)。
      注:次のステップで漂白剤の治療が効果を発揮しなくなる可能性がありますので、胚からすべての酵母ペーストを取り除きます。
   3. 空の10cmプレートに、DI水(1:1漂白剤:DI水)で希釈した新しく調製した50%漂白剤を充填します。ふるいを50%漂白剤に2分間45分間浸します。ふるいが50%の漂白剤に触れるとすぐにストップウォッチを開始します。最初の15sの50%漂白剤3~4xの中と外にふるいをブロットして胚の塊を分解する(図1C)。
   4. 噴出ボトルを使用して、DI水で胚を激しくすすきます。乾燥したペーパータオルでふるいを吸い取って胚を乾燥させます。5xの激しいすすとブロット乾燥プロセスを繰り返します(図1D)。
      メモ:これは、チョリオンの残りのを削除するための最も重要なステップです。フルDIホヤボトルを使用し、このステップでボトルの半分を使用します。
   5. ブロット乾燥胚を篩から10cmのブドウプレートにペイントブラシ²¹を使用して移す(図1E)
      注:手動ディクロリン化は、漂白剤の装飾²⁴の代替として使用することができます。

図1:胚のデコールリオネーション(A)胚をDI H20ホヤボトル、ペイントブラシ、および140nmふるいを使用して採取した。(B) 胚を、DI H20ホヤボトルを使用して精力的にすすいだし、ペーパータオルの上で乾燥したブロットを使用した。(C)胚のデコールリオネーションは、2分間及び45s.(D)胚を、ペーパータオルの上にDI H20ホヤボトルとブロット乾燥を用いて精力的に洗浄した。これを4回繰り返し、余分な絨毛を除去した。(E)胚は、ペイントブラシを使用して10cmのブドウプレートに移された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. 胚をカバースリップに取り付ける

1. 頭上のガチョウの首の照明が装備されている実体顕微鏡の下で、卵のピッカーツールを使用してブドウの皿のきれいなセクションに15-20の胚の2列を整理する。前部および後部端に対して同じ向きの腹側の胚を整列させる。卵ピッカーを作るために、45°の角度に細かい先端ステンレス鋼のピンセットを曲げる。D/V胚の向きを確認するには、カンポス・オルテガら²⁰を参照してください。
   注:胚がステップ3.5のカバースリップに押し付けられて、画像のために後側の表面を露出するので、腹側の表面がブドウ板の上に座ることは重要です。側側表面は腹側表面よりもはるかに平坦であるため、側側の表面を撮像すると、単一のZ面内に存在する核の数が増加します。
2. 75 mm x 25 mm のシリコーンスペーサーカバースリップを準備します。
   注: これは事前に準備することができます。いくつかのカバーリップを準備し、それらをきれいに保つためにスライドボックスに保存します。
   1. 75 mm x 25 mm のカバースリップの輪郭を厚さ 1.6 mm のシリコンスペーサーシートにトレースし、はさみを使用してシリコーンスペーサーを切り取ります(図 2A)。
   2. カミソリの刃を使用して、スペーサーから40mm x 15 mmのインセットを切り取ります(図2A)。
   3. スペーサーをカバースリップに付着させ、露出したカバースリップガラスのインセットにヘプタンの10 μLを接着します(図2A)。
      注:下に置くと、偶数ストリークは、同じz平面上のイメージング胚を保証します。
3. ステップ3.2.3からのヘプタン接着剤が乾いている間、ステップ3.1から胚を含むブドウ板の長方形のセクションを切り出す。
   1. カミソリの刃を使用して、2列の胚の周りに長方形(40 mm x 15 mm未満)をカットします。まだ四角形を削除しないでください。
   2. 最初の長方形の横にある 2 つ目の長方形を切り取ります。ステンレス製のヘラの直線エッジ側を使用して、2 番目の長方形を削除します。
   3. ステンレス製のへらの直線エッジを最初の長方形の下に慎重にスライドさせて取り外します(図2B)。
4. 3.5cm皿の外側面に胚を含むブドウ板の切り抜きを置く(図2C)。
5. 実体顕微鏡では、準備したカバースリップを胚の上に下げ、2列の胚を接着剤の上に静かに押し込みます(図2D)。
6. 胚をマイクロ注入する場合は、ステップ4.1に進みます。マイクロインジェクトしない場合は、ステップ 3.7 に進みます。
7. シリコーンスペーサー(上の途中)を1:1 -ハロカーボンオイル700:ハロカーボンオイル27で充填して胚を覆う。
8. カバースリップが動かないようにするために、4スライドプレートアダプタの下端に両面テープを並べますが、テープを対物レンズのパスに配置しないようにします。このテープは非常に重要です。カバースリップがアダプタ上に座っているだけなら、取り込み中に動きます。カバースリップを4スライドプレートアダプターに取り付けます。

図2:カバースリップの準備と取り付け。(A)75mm×25mmのカバースリップの輪郭を、厚さ1.6mmのシリコーンシートにトレースした。はさみを使って輪郭を切り取ります。40 mm x 15 mm のインセットをシリコンスペーサーから切り取り、カバースリップに取り付けた。差し込みの中心を15μL下げた。(B)15~20個の胚を40mmx15mm未満のブドウ板に2列編成し、その領域をカミソリとステンレス製のヘラを使用して切り取った。(C)グレーププレートを切り取り、空の3.5cm皿の上に置いた。(D)実体顕微鏡の下で、(A)からのカバースリップを下げ、胚を接着剤の筋に貼り付けた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. 脱シコードおよびマイクロ注入胚

1. 乾燥およびマイクロインジェクション中にカバースリップの底が汚れないように、スライドの上に胚を付けてカバースリップを置きます。
   メモ:カバースリップはスライドが付着せずに画像化されます。したがって、反転顕微鏡は、イメージングに必要です。
2. 部屋の温度に応じて、5〜10分間胚を脱生物する。代表的な結果でイメージングに使用した胚を、乾燥剤上に1:1層のシリカゲルビーズを含むチャンバー内で20°Cで7分間乾燥させた(図3A)。
3. 乾燥直後に、1:1 -ハロカーボンオイル700:ハロカーボンオイル27で胚を覆う。シリコーンスペーサーを上に半分に充填します。
   注:高粘度のハロカーボンオイルと低粘度のハロカーボンオイルを混合することが重要です。純粋なハロカーボンオイル700(高粘度)は、細胞サイクルの進行を30分後の塗布を遅くする。ハロカーボンオイル700とハロカーボンオイル27の1:1混合物は、このアーティファクトを固定した。
4. 注射剤でマイクロインジェクション針をロードし、マイクロインジェクターに1つを取り付け、圧力の下で切り開きます。
   注:貴重な試薬で完全なアッセイを行う前に、ステップ4.4を数回練習してください。これはマイクロインジェクションプロセスの中で最も困難なステップです。
   1. 拡張ローディングチップを使用して、2 μLの注入剤を使用してマイクロインジェクションニードルをロードします。1つのマイクロ注射針のみが必要ですが、予備の針を2〜3針で準備するのが良いことです。
      注: 拡張ロードのヒントの仕様については、 資料表 を参照してください。マイクロインジェクション針は、先端を開く前に密閉され、装填された針の内部の空気圧を構築することに依存するマイクロインジェクション技術のユニークな性質のために、拡張された負荷チップなしではロードできません。
   2. マイクロインジェクターに針を取り付け、先端の途中でプランジャーを押し下げ。目的は、ガラスキャピラリーの内部の空気圧を高めることです(図4A)。
      注:鉱物油なしでプランジャー鉱油ベースのマイクロインジェクターを使用してください。鉱物油で圧力を加える代わりに、プランジャーを使用して空気圧を作ります。
   3. ガラスのスライドにガラスの針を下げ、新しい#9カミソリを使用して針の先端を切り開きます。針を45°の角度で切って、鋭い開いた先端を作ります。注射剤は、針から流れ出ることなく、先端の底まで流れ落ちるべきです.針の先端に20μLのハロカーボンオイルを慎重に加え、45°で再切断します。注射剤は急速に流れ始めるはずです。
   4. プランジャーを引き込み、空気圧を直ちに下げるが、注射の間に針が胚膜で詰まるのを防ぐために連続的な流量を維持するようにする。(図4B)。
      注:注射剤が透明な場合は、マイクロインジェクションニードルをハロカーボンオイルに出入りし、立体顕微鏡で注射液滴の形成速度を観察して、注射剤の流量を確認してください。一度に数回クリックしてプランジャーを押して空気圧を調整し、マイクロインジェクションチップをハロカーボンオイルに出入りして、新しい液滴ポスト調整の形成速度を表示します。
   5. マイクロマニピュレーターを使用して針を視野の中央に配置し、マイクロマニピュレーターを使用して針を持ち上げ、その下からガラススライドを取り外します。針は注射のために調整されています。

図3:乾燥チャンバ図。 (A) これは乾燥室の図である。チャンバーは、ドリエライトの層上のシリカゲルビーズの1:1層で構成されています。乾燥を行うために、胚を単一のウェルプレート蓋の上に置いた。乾燥室は7分閉鎖されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

5. マイクロインジェクト胚
   1. マイクロインジェクション針の下の実体顕微鏡段階に胚を置くが、針を下げない。
   2. 50倍の倍率で胚に焦点を当てます。
   3. それは胚と同じ焦点面に入るまで針を下げます。片手でスライドを移動し、マイクロインジェクターをもう一方の手で操作し、一列の胚を注入する。
   4. 針を上げてスライドを180°回転させ、胚の2列目をマイクロインジェクション針に露出させます。針を下げ、胚の2列目を注入する。
      注:10分以内にこれを行ってください。いくつかの未注入の胚をコントロールとして使用する。

図4:マイクロインジェクション針の調製。 (A) この図では、 針中のマゼンタの強度が空気圧の代表です。マイクロインジェクターに装填された針を取り付け、プランジャーを50%延長して針内の空気圧を高めた。プランジャーが取り付ける前に最大限に引き込まれたことを確認してください。(B)針先を圧力下で切断し、気圧と流量を減らすためにプランジャーを引き込んだ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

5. 高コンテンツアナライザでのイメージング

1. このアッセイを実行する前に、スライドアダプタ用のプレートマップを作成します。 プレートマップマネージャ メニューにあるプレートホルダーエディタを使用して、カスタムプレートアダプタの寸法を入力します。
   注: 市販のプレート アダプター用にカスタム プレート マップが作成されました ( 表を参照)。プレート マップには、次の設定が含まれています。スライド厚さ:1000 μm、底高さ:1.607 mm、 底高さの可変性:100 μm、基板材料:ガラス、カバースリップ厚さ:150 μm、カバースリップ位置:下部–行:1–間隔:56.987mm、列:4–間隔28.391、サイズと形状:長方形、幅23.00mm、高さ:73.00mm、A1 21.29mm ~ 42mm)
2. スライド アダプタを顕微鏡にセットし、 プレビュー 機能を使用して、カバースリップの明るいフィールド 10x イメージをタイル表示します。
3. 行の上部または下部から胚を選択し、[ 目的 ]を選択して 60x(NA 0.95)に切り替えます。望ましい蛍光チャネルに適した暴露を決定する。
   注: ライブセルイメージングの場合は、レーザー強度を25%以下に維持してください。
4. メインダッシュボードで、 プレビュー 機能を使用して、両方の胚列を含む蛍光60x画像をタイル表示します。
5. メイン ダッシュボードで、[ ビン分割 ] ドロップダウン メニューを選択し、最適な解像度を得るためにビン分割を 1 x 1 に設定します。
6. z スタックのパラメータを定義するには 、[z スタック設定 ]タブを使用します。
   1. [z スタックセットアップ]タブで、上矢印と下矢印を使用して、上と下の z スタック制限を定義します。上と下の制限が定義されたら、緑鉛筆アイコンを選択して z スタック位置を保存します。ステップ 5.6.5 で使用される z スタック位置に注意してください。
   2. [z スタック設定]タブで、z ステップ入力ボックスを使用して、z スライス間の間隔を定義します。
      注: スライスの総数は、ステップ 5.6.1 および 5.6.2 を調整することによって決定されます。
   3. メインダッシュボードで 蛍光チャネル を右クリックし、 画像モード ドロップダウンメニューを使用してイメージングモードを3Dに設定します。
   4. メインダッシュボードで、自動焦点を無効にするには、 レーザーオートフォーカスボックス を選択します。
   5. メインダッシュボードで、ステップ 5.6.1 の Z スタック位置で 初期フォーカス を定義し、 初期フォーカスボックス を選択して「各タイムポイントで再フォーカス」機能を無効にします。
7. [ フィールド ] タブで、[ フィールド 配置] ドロップダウン メニューを使用して [カスタム ポイント] を有効にし、[矢印] を 使用してイメージングするポイントを選択します。
   注: 取得間隔(ステップ 5.8)により、同時にイメージできるカスタム ポイントの数が決まります。
8. 時系列タブで、時系列機能を有効にする時系列の取得ボックスを選択し、合計時間数を定義します。
   注:6つのカスタムポイントx 5 zスライスx 80スタック=2,400画像、2,400画像×8.2MB/イメージ= 19.68 GBのディスク容量。
9. メイン ダッシュボードで、[ 名前入力ボックス] を使用して取得設定に名前を付け、[ ファイル] と [ 保存] を選択して取得設定を保存します。
10. メイン ダッシュボードで、[ スキャン ] ボタンを選択して取得を実行します。

6. ポスト画像処理

1. イメージシリーズをマルチディメンションハイパースタックとして開くには、xdce ファイルをフィジーにドラッグ アンド ドロップします。
2. ハイパースタックを tif ファイルとして保存します。
3. 最大強度投影を作成し、tif ファイルとして保存します。
4. 最大強度予測のライブラリを組み立て、データ抽出と分析のためのパイプラインを構築します。

結果

このプロトコルで提示されるアプローチは、ショウジョウバエ胚¹⁵における有糸分裂の間に小管(ER)再編成における微小管の役割を調べるために用いた。有糸分裂の間、ERの構造は劇的な再編成を示すが、これらの変化を駆動する力は十分に理解されていない。最近、ER形成タンパク質のファミリーは、微小管²⁸との近接性で知られているERチューブ25、26、27、28の形成を促進することが示された。ER形態に対する微小管のロールを研究するために、プロトコルで提供される方法を用いて、ミトーシス中のER再編成に及ぼすいくつかのマイクロインジェクション薬物治療の効果を定量的に比較するデータを生成した。新しい微小管重合を防止するコルヒチンは、図5および図6に示すように、有糸分裂時のERの再編成を大幅に減少させることがわかった。さらに、ここで説明するアプローチは、32個の胚のタイムラップイメージングデータの生成を可能にした。平均および最大強度の測定は、カスタムMATLABスクリプトを使用して12,800の関心領域から生成され、薬物治療間の比較を行う上で不可欠な記述的および没収的な統計も生成しました。分子プローブの入手可能性とマイクロインジェクションの容易さのために、ここで説明する方法は、蛍光強度定量を介して様々な生物学的プロセスを研究するために容易に適応可能である。

図5:有糸分裂中のスピンドル極におけるRtnl1-GFPおよびReepB-GFP濃縮の代表的な画像。(A)細胞周期10における有糸分裂時のReepB-GFPの視野の60倍の視野。青い四角形は、パネル B-E に使用される視野を表します。パネル A は、しきい値バイナリ フィルターを使用して処理されます。このフィルターは、設定されたしきい値より下のピクセルからデータを除外するため、パネル B-E には適用されませんでした。(B,D)コントロールで、コルヒチンでリープB-GFP。(C,E)制御中のRtnl1-GFP、およびコルヒチン中。この図は、Diazら¹⁵から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:有糸分裂中のスピンドル極におけるRtnl1-GFPおよびReepB-GFP濃縮の定量10フレームにわたって20本の紡錘と20個の細胞質ROIを、以下の条件で32個の胚について分析した。(A)Rtnl1-GFPのDMSO対照注射は、対照胚が非注入サンプル(T210のすべてのサンプルに対してp<0.001)と比較して濃縮(T210で全サンプルのp<0.001)の0.1倍の増加を示した(T210のすべてのサンプルに対して0.001)。(B) ReepB-GFP胚に10%DMSOを注入し、コントロールとして機能させる。対照胚は、非注入サンプルと比較して濃縮(T210のすべてのサンプルに対してp<0.001)の0.1倍の増加を示した(図1E;p<0.001 T210のすべてのサンプルに対して)。(C) 5 μMコルチチンを注入したRtnl1-GFP胚。ここでは、コントロール(A)(T210のすべてのサンプルに対してP<0.001)のスピンドルへのRtnl1-GFP濃縮の減少を測定しました(T210のすべてのサンプルに対してp<0.001)。(D) 5 μMコルヒチンを注入した ReepB-GFP 胚。ReepB-GFPのスピンドルへの濃縮(T210のすべてのサンプルのp<0.001)の減少を、コントロール(B)(T210のすべてのサンプルでp<0.001)と比較して測定しました。この図は、Diazら¹⁵から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

1. イーストペースト21	2. ぶどうプレート21	3. ヘプタングルー24
1.1 50 ml円錐形に7グラムの活性ドライイーストを加える。9ミリリットルのDI水を加え、金属ヘラでコンスタンシーまで混ぜます。	2.1 ソリューションを作る:250mlフラスコでDI水の140mlに寒天の6グラムを追加し、それをオートクレーブ。	3.1 ガラスシンチレーションバイアルに50インチの両面テープを入れます。
1.1 50 ml円錐形に7グラムの活性ドライイーストを加える。9ミリリットルのDI水を加え、金属ヘラでコンスタンシーまで混ぜます。	2.2 溶液bを作る:エタノールの2mlにメチルパラベンの0.1グラムを混ぜ、その後、グレープフルーツジュース濃縮物の60mlにこの溶液を追加します。	3.2 20mlのヘプタンを加え、パラフィルムでガラスシンチレーションバイアルをシールします。室温で一晩回転させます。
	2.3 オートクレーブ処理液aの直後に、溶液bを混ぜ、10 x 35mmペルティ皿に混合物を注ぎます。(35個のブドウ皿を作る)	3.3 15ml円錐形チューブに接着剤を移し、3000 RPMで遠心分離機を15分間取り除きます。
	2.4 ブドウプレートをプレート蓋を外して一晩室温に設定できるようにします。蓋付きプレートを覆い、セット後4C°で保管します。	3.4 接着剤の上清を1.5mlマイクロ遠心チューブに移して保管します。

表1:メディアとソリューションのレシピ

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、ショウジョウバエ胚発生の様々な段階で生物学的事象を研究するための非常に汎用性が高く、容易に適応可能である。このプロトコルは、長期間にわたって発生する生物学的プロセスの研究に適しています。例えば、ショルバライ^{ゼーション29、30、}またはショウジョウバエ^31,32におけるヘテロクロマチンドメインの形成の研究は、これらのプロセスが長期間にわたって起こるので^、このプロトコルに記載されている方法を利用することから利益を得ることができる。また、倍率を下げることでサンプルサイズを大きくすることができ、同期分割³³間のタイミングや胃の持続時間³⁴などの光学解像度を必要としない質問を研究することができる。 同様に、20倍の目的は、1つのイメージング平面内で2つの胚を画像化することを可能にする。このプロトコルの方法は、定量分析のためのモデルシステムとして胚発生を用いて生物学的な質問をする動的なプラットフォームを提供する。

このプロトコルには、3 つの重要な手順があります。50%漂白剤の後のデコールリオネーションは、胚を洗浄し、精力的に5回乾燥することが不可欠である(2.3.4)。このステップは、残った小さな絨毛を取り除きます。残った絨毛は、胚を画像化する際に視野を妨げる。胚をガラスカバースリップ(3.5)に取り付ける場合、胚を均一な圧力で接着剤に押し込むのが重要です。これにより、胚は同じz平面に配置されます。マイクロインジェクション針を切り開くとき、針の流量を調整するためにプランジャーをすぐに引き込むか、すべての注射剤を失うことが重要です。

我々の研究は2つの要因によって制限された。最初の要因は、自動セグメンテーションプロセスを持たないことでした。しかし、MATLABを使用して手動セグメンテーションスクリプトを設計しました。遺伝的にコードされたスピンドルマーカーを使用すると、このプロセスを自動化することができます。将来的には、CNN-RFP 21、Rtln1-GFP、CNN-RFPを生産したいと考えています。ReepB-GFP トランスジェニック ラインにより、スピンドルセグメンテーションを自動化できます。MATLAB スクリプトと分析パイプラインの詳細については、Diaz らの補足資料を^{参照してください。}第二に、我々はまた、同時に6個の胚を画像化することができた35秒の取得間隔によって制限されました。より長い取得間隔は、私たちが同時により多くの胚をイメージすることができます。マイクロインジェクションをパーメレーションステップに置き換えることで薬剤送達スループットを高めることができますが、サンプルサイズはすでに取得間隔によって制限されているため、これは不要であることがわかりました。

このプロトコルは ショウジョウバエ胚 発生をイメージするために使用されたが、全体的なアプローチは 、C.エレガンス、ウニ、 ゼノプスなどの他の多細胞モデルシステムにおける胚発生を研究するために適応可能である。胚は、採取や受精によって容易に同期されるため、定量分析に非常に有用です。さらに、胚は視野から離れたり泳いだりすることはおかしくないため、単純なマルチポイント取得対応ソフトウェアを使用して定量分析のために複数のタイムラプスビデオを作成できます。我々は研究において高含有分析装置を用いたが、マルチポイント獲得が可能なあらゆる逆顕微鏡システムは、本明細書で言及される方法と対にすることができる。

同様の結果は、反転共焦点顕微鏡を使用して得ることができるマルチポイント取得を使用して得ることができます。しかし、高コンテンツ分析装置の利点は、サンプルサイズが増加し、時間の解像度が低い質問を研究する際に生じる。高コンテンツアナライザを使用する利点は、従来のシステムで 1 スライドと比較して、4 つのスライドを同時にイメージする機能です。各スライドに4枚のスライドと40個の胚のフルセットを使用すると、取得間隔がフレーム間に少なくとも15分である限り、160個の胚を数時間にわたって画像化することができます。高含有分析装置を使用するもう1つの重要な利点は、サンプルが蛍光強度ベースの測定に必要な外部光源から完全に遮断されることです。最後に、我々の研究で使用される高コンテンツ分析器は、60倍の倍率で寛大な221.87 μm視野を提供する5.5メガピクセルのCMOSカメラを備えています。この大きな視野は、取得ポイントごとに胚の半分を画像化することを可能にしました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 x 35mm マイクロ ディッシュ	VWR	Cat #: 10799-192	N/A
100% ブドウジュース濃縮	Welch's, 100% 濃縮ブドウジュース	N/A	食料品店で購入
250ml 三角フラスコ, 狭口	VWR	猫 #: 10536-914	N/A
3" 非金属ふるい No. 140	Gilson Company	SV-165 #140	N/A
4 スライドイメージングトレイ	グレースバイオラボ	SKU:400104	N / A
ACROS有機物、N-ヘプタン、99 +%、分光法用	フィッシャーサイエンティフィック	キャット#:AC411255000	N / A
Acros Organics、エタノール、99.5%、ACS試薬、絶対、200プルーフ	フィッシャーサイエンティフィック	キャット#:AC615095000	N / A
Acros Organics、メチル4-ヒドロキシ安息香酸、99%。(メチルパラベン)	フィッシャーサイエンティフィック	キャット#:AC126961000	N / A
カバースリップ、長方形、25 x 75mm、#1フロートガラス	フィッシャーサイエンティフィック	キャット#:50-143-782	N / A
カルチャーウェルシリコーンシート材料 - 1.6mm厚	グレースバイオラブ	SKU:664273	N / A
DWKライフサイエンスウィートン20mLペット液体シンチレーションバイアルフィ	ッシャーサイエンティフィック	キャット#:03-341-71A	N / A
胚収集ケージ-ミニ	ジェネシーサイエンティフィック	キャット#:59-105	N / A
ッペンドルフマイクロローダーピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	製品コード:10289651	N / A
ファルコン15mLコニカル遠心分離機	フィッシャーサイエンティフィック	キャット#:05-527-90	N / A
ファルコン50mLコニカル遠心チューブフィ	ッシャーサイエンティフィック	キャット#:14-432-22	N / A
Fleischmann's、アクティブドライイースト	Fleischmann's	N/A	食料品店での購入
グレーププレート	レシピ準備への参照	該当なし /	A ハ
ロカーボン27オイル	ジェネシーサイエンティフィック	猫 #: 59-133	該当なし ハ
ロカーボン700オイル	ジェネシーサイエンティフィック	猫 #: 59-131	該当なし / A
ヘプタン接着剤	レシピ準備への参照	なし / A	該当なし / A
工業用カミソリブレード(外科用炭素鋼) 片刃 No. 9	VWR	Cat #: 55411-050	N/A
パラフィルム M ラボ用シーリングフィルム、4 インチ x 250 フィート ロール	フィッシャー サイエンティフィック	Cat #: 50-998-944	N/A
スコッチ両面テープ ディスペンサー付き、狭幅、ボンディング用設計、1/2" x 7 ヤード、3/パック キャディ	フィッシャー サイエンティフィ	Cat #: NC0879005	N/A
シリカゲルビーズ、乾燥剤~2 - 5 mm	ミリポアシグマ	SKU:1077351000	N / A
ステンレス鋼スプーン/スパチュラ	VWR	猫#:470149-044	N /
A WAハモンドドライライト吸収剤フィ	ッシャーサイエンティフィック	猫#:23-116582	N / A
ペースト	レシピ準備を参照	N / A	N / A N / A / EQUIPMENT
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Allegra X-12 ベンチトップ、遠心分離機	ベックマン・コールター	N/A	15 ml の円錐形遠心分離機インサートへのアクセスが必要になります。
オートクレーブ	N/A	N/A	どのオートクレーブでも大丈夫です。
ドラモンドナノジェクトIIマイクロインジェクター。	ドラモンドサイエンティフィック	N/A	これは、鉱物油ベースの注入システムです。
GEヘルスケアINセルアナライザー6000。	GEヘルスケア	N/A	マルチポイント取得が可能な高速共焦点顕微鏡で代用することができます。
冷蔵庫(4C°)	N/A	N/A	フライメディアとイーストペーストは(4C°)に保管する必要があります。
Zies Stemi 508 実体顕微鏡、トランスイルミネーションベース 300 とオーバーヘッドグースネック照明付き。	ツァイス顕微鏡	N/A	透過照明ベースとグースネック照明が必要です。