新生児マウスの生物発光 性大腸菌 O1:K1:H7感染は、著しい肺炎症および肺病理を伴う敗血症感染をもたらす。ここでは、全身性細菌の負担の列挙、炎症プロファイリング、肺組織病理学と並行して縦方向の生体内イメージングを用いて新生児敗血症をモデル化し、さらに研究する手順について述べた。
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この記事について
サマリー
要約
新生児は、生後数ヶ月で表示されるユニークな免疫プロファイルのために細菌敗血症のリスクが高くなります。私たちは、新生児の高い死亡率を担う血清型である 大腸菌 O1:K1:H7の病因を研究するためのプロトコルを確立しました。我々の方法は、感染の進行時に異なる時点で新生児の出生時の生体内画像を利用する。このイメージングは、血液中の細菌の測定、炎症プロファイリング、および組織組織組織病理学によって平行して、敗血症中の感染ダイナミクスを理解するための厳格なアプローチを意味する。現在の報告書では、細菌の負担と疾患の重症度を比較するための2つの感染性接種をモデル化する。我々は、皮下感染が感染後10時間までに感染を広めることにつながることを発見した。24時間までに、血液、肺、およびその他の末梢組織に発光 性大腸菌 の感染が豊富であった。肺の炎症性サイトカインの発現は24時間で有意であり、その後に細胞浸潤および感染性用量で増加する組織損傷の証拠が続く。インビタルイメージングには、いくつかの制限があります。これには、発光シグナル閾値と麻酔中に新生児で生じる可能性のあるいくつかの合併症が含まれます。いくつかの制限にもかかわらず、私たちの感染モデルは、これまで徹底的に調べられていない新生児マウス敗血症中の縦方向感染ダイナミクスを理解するための洞察を提供することがわかりました。このモデルは、初期の間に他の重要な細菌感染を研究するためにも適応できると期待しています。
概要
細菌敗血症は、感染からの十分な保護を提供しない生後の最初の日にユニークな免疫プロファイルを示す新生児にとって重要な懸念事項である1。新生児敗血症は、米国だけで毎年75,000例以上を占める米国の重大な医療問題であり続けています2.これらの感染症を深く研究するためには、ヒト疾患の側面を再現する新しい動物モデルが必要である。我々は、Eシェリヒア大腸菌、O1:K1:H73を用いて新生児マウス感染モデルを確立した。大腸菌は、米国における新生児敗血症の第2の主要な原因であるが、敗血症関連死亡率4、5の大部分を占める。しかし、それは、前期および非常に低い出生体重(VLBW)の赤ちゃんが独立して5と考えられる主な原因である。K1血清型は、新生児6,7における侵襲性血流感染および髄膜炎に最も頻繁に関連している。現在、抗生物質や支援ケア以外の治療法はありません。一方、多くの病原性細菌に対する抗生物質耐性の割合は上昇し続け、治療
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プロトコル
すべての手続きは、ウェストバージニア州の施設動物のケアと使用委員会によって承認され、国立研究評議会による実験動物のケアと使用のためのガイドからの勧告に従って行われました18.
1. 細菌性接種の調製
- トリプティック大豆寒天(TSA)プレートを、単一コロニーを大腸菌O1:K1:H7-luxの冷凍庫から隔離するためのインノキュレーティングループを有し、ルシファーゼを安定して発現し、カナマイシン耐性を有する3を運ぶ。37°Cで一晩インキュベートする。
- 翌日、ルリアブロス(LB)はバイオセーフティキャビネットで室温(25°C)に来ることを可能にします。
- バイオセーフティキャビネットフードの下で、縞模様のプレートから単一のコロニーを特定し、カナマイシン(30 μg/mL)を補充したLBの3mLで接種します。振るとともに37°Cで一晩インキュベート(220rpm)。これがスターターカルチャーです。
- スターター培養液1:100をバイオセーフティキャビネットフードの下のLBの新鮮な3mLに希釈し、37°Cで2〜3時間(220rpm)のインキュベーターに戻します。これがストックカルチャーです。
- 分光光度計を用いて、600 nmのブランクおよびストック培養の両方の光学....
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結果
このプロトコルは新生児マウスで細菌敗血症を誘発し、縦方向のインビタルイメージング、血液中の細菌の列挙、病理の組織学的評価、炎症性サイトカイン発現プロファイルを使用して疾患の経過を研究した。病態の徴候は、低い(2 x 106 CFU)および高い(7 x 106 CFU)の両方に感染した新生児の子犬で、時間の経過とともに大腸菌の接種を観察した。より大きな接種を受けた子犬は、移動性の低下、姿勢の矯正ができないこと、感染後24時間(hpi)までに直立した位置を維持する能力の障害を含む、より顕著な苦痛の兆候を示した。しかし、一部の子犬は他の子犬よりも悪く見えたので、罹患率の範囲がありました。感染直後、1匹の低用量動物が、ベースラインを確立するためにイメージングセッション中にイオブルラン暴露のために死亡した。24 hpiによって、6匹の高用量動物のうち2匹が全身感染に屈した(死亡率は33.3%)。高用量または低用量の接種接種を受けた感染した子犬は、24 hpiでコントロールリッターメイトよりも有意に少ない重量を量った(図1
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ディスカッション
新生児マウスで細菌敗血症を誘導する当社の肩甲膜感染モデルは、細菌病原体の縦方向の広がりをリアルタイムで研究する新しい方法です。インビタルイメージングは、新生児における細菌の播体拡散をリアルタイムで探索する機会を提供します。これは、細菌の普及の運動学を理解し、病気の適切な段階で宿主の応答および損傷をさらに研究するために重要である。マウスの子犬は、細菌の接種の皮下、肩甲骨下注射を投与される。この注射技術は、注射部位内の精度が低く、尾静脈や腹腔内感染などの他の一般的に使用される代替手段よりも簡単です。これは、子犬の小さなサイズを考えると重要です。生体内イメージングにより、動物を犠牲にすることなく、末梢組織や中枢神経系への細菌増殖と普及の縦断評価が可能になります。同様のイメージング手法と技術が癌生物学と転移の研究のために使用されている20,21.さらに、新生児ラット22における大腸菌感染時の生物発光イメージングの使用を挙げている別の研究では、ここでは新生児マウスに.......
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開示事項
著者らは開示する利益相反を持っていません。
謝辞
この仕事は、C.M.Rへの機関資金によって支えられた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 mL インスリン シリンジ | Coviden | 1188128012 | 接種または PBS 注射 |
| 10% 中性緩衝ホルマリン | VWR | 89370-094 | 組織病理学 |
| ACK 溶解バッファー | Gibco | LSA1049201 | 細菌クリアランスアッセイ |
| 動物 タトゥー インク ペースト | ケッチャム | KI1482039 | 動物識別 |
| 動物 タトゥー インク グリーン ペースト | ケッチャム | KI1471039 | 動物同定 |
| 抗Ly-6B.2マイクロビーズ | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | 細胞単離 |
| 大腸菌 O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (ルシフェラーゼを発現) | N/A | N/A | WVU |
| で社内建設E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | 細菌増殖 |
| IL-1 ベータプライマー/プローブ (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 Cytokine expression qPCR | |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 4331182 | サイトカイン発現 qPCR |
| iQ スーパーミックス | バイオ・ラッド | 1708860 | リアルタイム定量 |
| PCR iScript cDNA 合成キット | バイオ・ラッド | 1708891 | cDNA 合成 |
| アイソレーション バッファー | ミルテニー バイオテック | N/A | バクテリアクリアランスアッセイ |
| IVIS スペクトラム CTおよびリビングイメージ 4.5 ソフトウェア | パーキン・エルマー | N/A | 生体内イメージング |
| LBブロス、レノックス | フィッシャー バイオ試薬 | BP1427-500 | 細菌増殖 |
| EASYストレーナー(ナイロンバスケット) | グライナーバイオワン | 542 040 | セルストレーナー |
| SpectraMax iD3 | 分子デバイス | N/A | プレートリーダー |
| ペレット 乳棒 モーター | グレインジャー | 6HAZ6 | 組織均質化 |
| ポリプロピレンペレットPestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 4331182 サイトカイン発現 qPCR | |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
参考文献
- Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
- Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014). <....
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