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方法論記事

グラム陰性細菌敗血症の新生児画像モデル

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DOI:

10.3791/61609

⸱

2020年8月12日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center at West Virginia University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

新生児マウスの生物発光 性大腸菌 O1:K1:H7感染は、著しい肺炎症および肺病理を伴う敗血症感染をもたらす。ここでは、全身性細菌の負担の列挙、炎症プロファイリング、肺組織病理学と並行して縦方向の生体内イメージングを用いて新生児敗血症をモデル化し、さらに研究する手順について述べた。

要約

新生児は、生後数ヶ月で表示されるユニークな免疫プロファイルのために細菌敗血症のリスクが高くなります。私たちは、新生児の高い死亡率を担う血清型である 大腸菌 O1:K1:H7の病因を研究するためのプロトコルを確立しました。我々の方法は、感染の進行時に異なる時点で新生児の出生時の生体内画像を利用する。このイメージングは、血液中の細菌の測定、炎症プロファイリング、および組織組織組織病理学によって平行して、敗血症中の感染ダイナミクスを理解するための厳格なアプローチを意味する。現在の報告書では、細菌の負担と疾患の重症度を比較するための2つの感染性接種をモデル化する。我々は、皮下感染が感染後10時間までに感染を広めることにつながることを発見した。24時間までに、血液、肺、およびその他の末梢組織に発光 性大腸菌 の感染が豊富であった。肺の炎症性サイトカインの発現は24時間で有意であり、その後に細胞浸潤および感染性用量で増加する組織損傷の証拠が続く。インビタルイメージングには、いくつかの制限があります。これには、発光シグナル閾値と麻酔中に新生児で生じる可能性のあるいくつかの合併症が含まれます。いくつかの制限にもかかわらず、私たちの感染モデルは、これまで徹底的に調べられていない新生児マウス敗血症中の縦方向感染ダイナミクスを理解するための洞察を提供することがわかりました。このモデルは、初期の間に他の重要な細菌感染を研究するためにも適応できると期待しています。

概要

細菌敗血症は、感染からの十分な保護を提供しない生後の最初の日にユニークな免疫プロファイルを示す新生児にとって重要な懸念事項である1。新生児敗血症は、米国だけで毎年75,000例以上を占める米国の重大な医療問題であり続けています2.これらの感染症を深く研究するためには、ヒト疾患の側面を再現する新しい動物モデルが必要である。我々は、Eシェリヒア大腸菌、O1:K1:H73を用いて新生児マウス感染モデルを確立した。大腸菌は、米国における新生児敗血症の第2の主要な原因であるが、敗血症関連死亡率4、5の大部分を占める。しかし、それは、前期および非常に低い出生体重(VLBW)の赤ちゃんが独立して5と考えられる主な原因である。K1血清型は、新生児6,7における侵襲性血流感染および髄膜炎に最も頻繁に関連している。現在、抗生物質や支援ケア以外の治療法はありません。一方、多くの病原性細菌に対する抗生物質耐性の割合は上昇し続け、治療8で一般的に使用される多数の抗生物質に耐性のある大腸菌の株もある。したがって、新生児における敗血症のメカニズムと宿主応答を研究する方法を作り続けることが不可欠です。これらの結果は、現在の治療と感染結果を改善するのに役立ちます.

新生児の免疫状態は、成人と比較して、触語と機能的な違いの両方によって特徴付けられる。例えば、インターロイキン(IL)-10およびIL-27のような抗炎症および調節性サイトカインの上昇レベルは、臍帯血由来のマクロファージによって産生され、マウス新生児9、10、11の血清中でより大きなレベルで存在することが示されている。これは、成人の対応物10と比較して新生児細胞から頻繁に報告されるIFN-α、IFN-ɣ、IL-12、およびTNF-αの低レベルと一致する。さらに、新生児免疫系は、成人12と比較してTh2および調節性T細胞応答に向かって歪んでいる。好中球、T細胞、B細胞、NK細胞、および単球の増加数も新生児に存在するが、著しい機能的障害を有する。これには、細胞表面マーカーの発現における欠陥および非成熟性13、14、15を示唆する抗原提示が含まれる。さらに、新生児好中球は、化学戦術因子16に移行する能力が著しく欠損している。骨髄由来のサプレッサー細胞(MDSC)は、新生児の上昇レベルでも見られ、最近IL-2711の供給源であることが示されている。MDSC は T 細胞17に対して非常に抑制性が高い。総称して、これらのデータは、感染に対する感受性の増加に役立つ新生児免疫の限界を示している。

新生児敗血症時の細菌の負担の進行と保護宿主免疫応答の解剖を研究するために、我々は新しい感染モデルを開発した。新生児マウスは、3〜4日目の生命において、腹腔内腔または尾静脈に注入することが困難である。我々のモデルでは、3日目または4日目の子犬は、細菌の接種またはPBSを皮下領域に投与する。全身感染が発症し、発光性大腸菌O1:K1:H7を用いて、個々の新生児マウスを縦断的に画像化し、末梢組織における播種された細菌負担に従うことができる。これは、マウス新生児3における敗血症時の細菌の普及の動態を理解するために、生体内画像化を利用する最初の報告されたモデルである。

ここでは、新生児マウス3における敗血症性大腸菌感染症を誘導するプロトコルについて説明する。注射用の細菌接種を調製する方法、病理評価のための組織の採取方法、遺伝子発現解析による炎症マーカーの測定、細菌負担の列挙方法について説明する。また、新生児免疫細胞による細菌殺死の活性化および細菌の定量化に対する発光性大腸菌の使用についても説明する。これらのプロトコルはまた、新生児における他の重要な細菌感染を研究するために適応され得る。ここに示すデータは、翻訳可能な新生児敗血症モデルにおける感染ダイナミクスを理解するための全体的な新しいアプローチを表しています。

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プロトコル

すべての手続きは、ウェストバージニア州の施設動物のケアと使用委員会によって承認され、国立研究評議会による実験動物のケアと使用のためのガイドからの勧告に従って行われました18.

1. 細菌性接種の調製

  1. トリプティック大豆寒天(TSA)プレートを、単一コロニーを大腸菌O1:K1:H7-luxの冷凍庫から隔離するためのインノキュレーティングループを有し、ルシファーゼを安定して発現し、カナマイシン耐性を有する3を運ぶ。37°Cで一晩インキュベートする。
  2. 翌日、ルリアブロス(LB)はバイオセーフティキャビネットで室温(25°C)に来ることを可能にします。
  3. バイオセーフティキャビネットフードの下で、縞模様のプレートから単一のコロニーを特定し、カナマイシン(30 μg/mL)を補充したLBの3mLで接種します。振るとともに37°Cで一晩インキュベート(220rpm)。これがスターターカルチャーです。
  4. スターター培養液1:100をバイオセーフティキャビネットフードの下のLBの新鮮な3mLに希釈し、37°Cで2〜3時間(220rpm)のインキュベーターに戻します。これがストックカルチャーです。
  5. 分光光度計を用いて、600 nmのブランクおよびストック培養の両方の光学密度(OD)を読み取ります。LB(細菌を含まず)の100 μLを96ウェルフラットボトムアッセイプレートの1つの井戸に加えます。これは空白です。その後、ストック培養から別のウェルに100 μLを加えます。2 つの追加のレプリケートに対して繰り返します。吸光度は、プレートリーダーを使用して読み取られます。
  6. 在庫培養吸光度値(OD値)からブランク吸光度を差し引き、以前に生成され検証された成長曲線と比較して、感染量の調製のためのストック培養中の細菌密度の近似値を決定する。
  7. 研究課題に応じてターゲットの接種を生成します。この研究では、マウス(/マウス)あたり2 x 106( 低)および7 x 106( 高)コロニー形成ユニット(CFUs)の接種を用いた。
    1. マウスあたりの標的用量(用量T)をストック培養中の細菌の推定濃度(Stock)で割り、ストックチューブから必要な細菌の量を得る(VS)。
    2. 感染に必要な細菌の総量に対して5〜10個のエキストラに十分な量と共に感染する必要があるマウスの数(NM)と5〜10回の追加用量をVSに掛けます。ストックチューブからこのボリュームを取り出し、新しい遠心管に追加します。
    3. 次の数式を使用します。
      用量T/Stock= VS x NM = ストックチューブから除去される細菌の総容積 (VT)です。
  1. 4°Cで5分間2,000xgの細菌を遠心分離し、感染するマウスあたり50μL(pH 7.2-7.6)で細菌ペレットを再懸濁する(例えば、1回の2 x 106細菌の10用量の場合、2x107細菌のペレットは500μLで再懸濁される)。 繰り返しますが、必要以上に接種を準備することをお勧めします。コントロール接種のためだけにPBSの等量を準備します。感染するまで氷上で感染性の接種およびPBSコントロールを維持する。
  2. 96ウェルプラスチック底希釈板でPBSに7つの10倍の連続希釈を行い、かつカナマイシン(30μg/mL)を加えた象限TSAプレートに複素二重の希釈液のプレート25μLを行い、投与された細菌の実際の量を列挙します。列挙前にコロニー形成のために一晩37°Cでインキュベートする。

2. 動物の識別

  1. 年齢に合わせた子犬のためにごみが同期されるように、十分な数の繁殖ペアを手配してください。1日±年齢変動は許容される。
  2. 妊娠中のC57BL / 6メスマウスを特定し、正確に年齢を決定するために計画された実験の前にごみの誕生を監視します。
  3. コントロールと感染した3日または4日の古い子犬を区別するには、小さな、細かい先端の虹彩はさみを使用して、コントロールの子犬の尾の端だけを切り取ります。感染した子犬は尾の切り取りを受け取りません。尾を切る前に、70%エタノールで使用綿球で皮膚を消毒する。必要に応じて綿球またはガーゼで尾の端に圧力を加えます。
    注: この手順は、バイオセーフティ キャビネット フードの下で実行されます。1インチの約1/8のテールスニップで十分です。
  4. コントロールおよび感染したグループ内の子犬を識別するには、28 G x 1/2''永久針を持つ1mLインスリン注射器を使用して、子犬の尾に入れ墨を入れ入れる。入れ墨の前に、70%エタノールで使用綿ボールで皮膚を消毒します。この手順は、バイオセーフティキャビネットフードの下で行われます。
  5. 尾を入れ墨するには、針の先端に動物の入れ墨インクを適用します。次に、尾を完全に露出して、片手で慎重に子犬を拘束します。表面的な深さを保ちながら針を皮膚の下にそっと挿入し、小さなマーキング(ドット)が作成されるまで針を数ミリメートル皮膚と平行に動かします。皮膚の下から余分なインクが放出されないように、皮膚の下からゆっくりと針を取り除く前に数秒待ちます。
  6. 必要に応じて綿球またはガーゼで傷口に圧力をかける。70%エタノールで皮膚の表面に余分な入れ墨インクを除去します。
  7. 感染したマウスと対照群の後続のマウスでこのプロセスを繰り返し、連続した子犬の入れ墨ごとに追加のドットを追加します(例えば、子犬1は尾に1ドット、子犬2は尾に2つのドットを持ちます)。
    注: 追加の識別層の場合は、コントロールと感染したグループに動物のタトゥー インクの別々の色を使用することをお勧めします。

3. 肩甲骨の接種

注:この研究では、各実験に対して指定された低用量および高用量群で2つの実験を行った。最初の実験では、7つの子犬に低用量接種(4つの子犬がコントロールとして使用された)を与え、別のごみから5つの子犬が高用量を与えられた(3つの子犬がコントロールとして使用された)。実験1の子犬は、24時間のタイムポイントについてのみデータを提供した。2番目の実験では、8つの子犬に低用量接種(2つの子犬をコントロールとして使用した)を与え、6つの子犬は高用量接種接種を与えられた(2つの子犬がコントロールとして使用された)。実験2の子犬は、0、10、および24時間のタイムポイントのデータを提供した。

  1. 年齢マッチの子犬は1日≤。各ごみを低用量または高用量のごみとして割り当てます。ごみの中でランダムにコントロールまたは感染した子犬として子犬を割り当てます。
  2. 3日目または4日目の出生後に、 大腸菌ルクス またはPBSコントロールで接種する前にすべての子犬の体重を記録する。この間に子犬からダムを分離して、感染中に移動しないようにします。
  3. インスリン針を用いたバイオセーフティキャビネット内で、PBSまたは 大腸菌-lux 接種のいずれかを吸引する。この作業では、マウスあたり2 x 106 および7 x 106 CFUsの接種器が使用されました。感染性の接種とPBSの両方を氷上に保管し、肩甲骨注射を介して投与する。
  4. バイオセーフティキャビネットフードのきれいな表面に新生児を置き、子犬をこするかのように首のうなじで皮膚を上げます。
  5. 今、動物の皮膚と筋肉の間に作成された空間では、針を挿入し、ベベルアップ、皮膚のすぐ下に、PBSまたは 大腸菌ルクスの50 μLを注入します。同時に注入の逆流を防ぐために、皮膚のピンチ部分を解放します。
  6. ゆっくりと、注意して針を取り外します。注射が終了した後、ダムで戻って子犬を配置します。
    注:開発中の解剖段階のために、3-4日目に新生児の子犬に尾静脈または腹腔内注射を投与することは技術的に困難です。従って、この研究では、実行のしやすさから、下垂体感染経路が選択された。

4. 疾患とエンドポイントの基準の評価

  1. 感染期間中、1日2回子犬を監視します。外観の異常に注意してください。
  2. 罹患率の客観的な測定として重みを記録する。
  3. 体重の変化に加えて、後側に新生児を配置することによって、自分自身を右に子犬の能力をテストします。病気の動物は腹側と足に引き渡すことができないか、困難でこのアクションを完了します。
  4. エンドポイント基準に近い動物をマークするには、次のチェックをしてください: 正常体重の 85% 未満;動きが減少し、自分自身を正しくすることができない。ピンクとは対照的に、皮膚の変色と、より灰色または透明な外観;触り心地が良く、体温の低下と側面に沿った出血性の打撲傷を示し、また、進行した病気を示す。
    注: 新生児が 2 日間にわたって体重を増やずず、手順 4.4 の説明のいずれかに適合している場合、エンドポイントの基準を満たしています。高用量を受ける子犬は、しばしば24時間でエンドポイント基準を満たす。低用量および高用量のごみ内の制御子犬は、制御群と実験群の間の比較分析を可能にするために同時に安楽死させる。以下の安楽死セクションに進みます。

5. 細菌の負担のインビボイメージング

  1. イメージングと後続の解析には、microCT イメージャーとソフトウェアを使用します。
    注: 子犬の肌の色は、イメージング品質に影響しません。
  2. 大腸菌-ルクス感染新生児マウスとダムとケージをBSL-2レベルの層流フードに入れます。画像化するマウスを取り除き、ボンネット内の透明なイオブルランチャンバーに入れます。必要なイオブルランの量を測定するために、感染していないコントロールから始めることをお勧めします。
  3. microCTに接続されているコンピュータ上のソフトウェアを開きます。システムを初期化し、CCD温度が-90 °Cでロックされるまで待ちます。
  4. イオブルラン気化器をオンにし、ダイヤルを5%のイオブルランフローに調整します。彼らは動きを停止するまで20〜30 sのこのイオブルラン混合物でチャンバーにマウスを保ちます。一部のマウスでは、より長いまたは短い麻酔の暴露時間が必要になることがあります。マウスが動かなくなると、十分に麻酔が行われ、画像化が可能になります。
  5. マウスをmicroCTイメージングチャンバーに移動させ、鼻が鼻コーンに垂直に向いている傾向のある位置のイメージングボックスに置きます。歯科ワックスを使用して、画像処理ボックスの足を静かに拘束し、動きを制限します。一度に最大4匹の新生児マウスを画像化できます。
  6. イオブルラン気化器を2~4%の流れに下げて、イメージング中にマウスを麻酔し続けます。マイクロCTイメージングチャンバーのドアを閉めます。数秒後にマウスを確認してください。動き始めた場合は、イゾフルランで綿のボールを使用し、麻酔をするために5秒間動く動物の鼻にそれを保持します。イメージング中に動物の近くに綿のボールを保管してください。マウスを麻酔して終了しないように注意してください。
  7. ソフトウェアを使用して、イメージング用の [ルミネセント ]オプションを選択します。[ ブロック ]に設定した励起フィルタを使用し、放出フィルタを [開く]、[500 nm]、[520 nm]、[560 nm]、[580 nm]、[600 nm]、および 620 nm に設定します。発光用に7つの合計エミッションフィルタがセットされます。
  8. 各時点でマウスを画像化し(0、10、および24時間感染後[hpi])、すべての画像を各時点のフォルダに保存します。ダムとケージに子犬を返し、すべての子犬が麻酔から回復したことを確認してください。
  9. 2D画像を解析するには、ソフトウェアで画像を開きます。単位を ラディアンス (フォトン)に変更します。これは 総流束(フォトン/秒)に変わります。
  10. 複数のエミッション フィルタを使用して一度に 1 つのイメージ セットのみを解析します。各画像セットから、各画像の右下隅にある輝度の最小値と最大値をメモします(例えば、7つのエミッションフィルタがある場合は、7つの画像と7つの最小値と最大値があります)。比較する各イメージ セットに対して繰り返します。
  11. すべての画像の値と発光を包含するスケールを決定するには、各画像セットの最小値と最大値を最も小さい値にします。この調査では 、Open フィルター画像を代表として使用しました。
    1. 選択した画像をハイライト表示して開き、スケールを変更します。ツール パレットで、[ イメージ 調整]タブをクリックし、[ カラー スケール ]を、以前に特定した最小値と最大値の最小値に変更します。各イメージ セットを TIFF として保存します。この方法で各時間ポイントを個別に分析し、正しい縮尺が表示されるようにします。
  12. 個々のマウスの総フラックス(マウス当たりの発光信号量)を定量化するには、ステップ5.9-5.10で前述したとおりに画像を開きます。ツール パレットの[ROI ツール] タブを開き、円ツールを選択します。発光の 1 つの領域を分析する場合は、1つの円を選択します。
  13. 発光領域の オーバーレイ に ROI を移動します。必要に応じて ROI のサイズを調整します。
    注: 調整が必要な場合は、他の画像の ROI を調整して一貫性を維持します。[ROI の測定] を選択します。ROI 測定ウィンドウが開き、総流束 (p/s)、平均輝度 (p/s/cm2/sr)、放射度の標準偏差、最小放射輝度、最大輝度が表示されます。
  14. 各画像セットの総フラックス測定値を記録します。この数値は、2D 画像におけるマウスの発光量を定量化した値です。
  15. 3D 再構成された microCT イメージを作成するには、ツール パレットのDLIT 3D 再構築パネルを開き、[解析]タブに含まれるすべての波長を確認します。

6. 安楽死

  1. 壊死および適切な下流の適用のために目的の組織/器官のための管を準備し、ラベルを付ける。
  2. バイオセーフティキャビネットで新生児をダムから分離します。
  3. 綿のボールを獣医グレードのイゾフルランに浸し、透明な封じ込めチャンバーの中に置きます。
  4. 血液を採取する場合は、P200マイクロピペットをチップで調製し、抗凝固剤として10 μLの5mM EDTAを有する1.5 mLチューブを有する。血液の50-200 μLの容積が予想される。
  5. チャンバーに新生児を置き、動かなくなるまで子犬を監視します。
  6. すぐに、新生児を取り除き、はさみで首を切ります。長期間新鮮な空気を吸い込むことができれば、子犬は意識を取り戻すことができます。新生児は、成体マウスに対して肺容量を低下させ、したがって、イオブルラン単独で安楽死のために十分に深く呼吸しない。
  7. P200マイクロピペットを使用して、頭部の基部のトランクから血液を採取する。採血量を最大化するには、切断後できるだけ早くこのステップを実行します。ステップ1.9に記載されているように、連続希釈および標準プレートカウントによって血液中の細菌を列挙する。
  8. 組織サンプルの切除前に70%エタノールで新生児全体を殺菌します。

7. 組織収穫

  1. バイオセーフティキャビネット内で、汚染を防ぐために70%エタノールで新生児を使用してください。動物を右側に置きます。
  2. 鉗子を使用して、腹部と後部左足の間の点で皮膚をつかみ、細かい先端の外科用ハサミで切開を行う。背中に向かって上向きに動く皮膚を切り取り続けます。脾臓全体が露出するまでの進行。
  3. 鉗子を使用して脾臓をつかみ、腹部から取り除き、はさみを使用して結合組織を切断します。下流アプリケーションに適したソリューションに脾臓を配置します。
  4. 肺を得るために、胸部の皮膚を完全に剥がす。
  5. 胸骨の基部に縦に保持されたはさみで入り、リブケージが分割されるまで上向きに切断する。
  6. 鉗子を使用して右肺と左肺を個別に把握し、胸腔から取り除く。はさみで切断することによって肺組織から心臓を取り除きます。
  7. 下流のアプリケーションに適した溶液に肺を置きます。RNAの単離のために、グアニジンチオシアネート/フェノール(GTCP)の500 μLを使用してください。組織病理学のために、10%中性緩衝ホルマリンの5 mLを使用してください。

8. 遺伝子発現のための肺組織からのRNAの分離

  1. マイクロ遠心分離機を4°Cに予冷します。
  2. はさみでGTCPの肺組織をミンチ。次に、電池式ホモジナイザーで組織を均質化する。溶液ができるだけ均一になるまで続けます。室温で3~5分間インキュベートします。
  3. フィルター処理されたピペットチップを使用して、クロロホルムを100 μL加えます。チューブを15 sで反転させ、室温で3〜5分インキュベートします。
  4. 12,000 x gで 15 分間の遠心分離機 .
  5. スピン中に、70%エタノールの500 μLで1.5 mLチューブを準備します。RNA分離キットからカラムとコレクションチューブを組み立て、ラベル付けします。
  6. 遠心分離の際に形成された相間層を乱すことなく、上層水層を慎重に除去する。水層を70%エタノールを含むチューブに入れます。
  7. エタノールとライセート混合物をコレクションチューブ内のカラムに移動します。
  8. この時点から、RNAの最終的な溶出まで、RNA分離キットの市販製品プロトコルに従ってください。
  9. RNAの純度と量を分析します。すぐに使用するか、さらに使用するまで-80°Cで保存してください。

9. cDNA合成

  1. PCRチューブにラベルを付け、脇に置きます。
  2. 各サンプルのcDNA反応混合物に1μgのRNAを加えます。
  3. cDNA プロトコルに記載されているように、PCR チューブに試薬とテンプレートを追加します。最後に酵素を混合物に加えます。
  4. PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、25°Cで5分、42°Cで40分、85°Cで15分、4°Cの最終ホールドを行います。
  5. サーモサイクラーからPCRチューブを取り除き、すぐに使用するか、さらに使用するまで-20°Cで保存してください。

10. リアルタイム定量PCR(qPCR)サイクル

  1. 分析する各遺伝子に反応ミックスカクテルを用意します。15 μL PCR 反応ごとに、7.5 μL の 2x 試薬ミックス、20X 5'-FAM 標識遺伝子特異的プライマー/プローブの 0.75 μL、ヌクレアーゼを含まない水 3.75 μL が必要です。アンプリコンは通常60-120 bpの範囲です。
  2. 各実験グループに対して3μLのcDNAテンプレートを適切なウェルに追加します。
  3. 適切なウェルに12μLの遺伝子特異的反応ミックスカクテルを加えます。
  4. プレートに光学粘着フィルムと遠心分離機を1,000 x g で1分間覆い、ウェルに形成された気泡を除去します。
  5. リアルタイム PCR サーモサイクラーに PCR プレートを配置します。
  6. 実行方法は95°Cで3分、15sの95°Cの40サイクル、1分間は60°Cと続きます。
  7. 対象遺伝子を内部制御に正規化してデータを分析し、2-ΔΔCt 式と数値のlog2 変換を用いて、感染していない対照サンプルに対する感染サンプルからのデータを表現する。

11. 肺組織病理学

  1. 上記のように新生児の子犬から肺を取り除く。
  2. 組織に対する溶液の比率が約20:1になるように、10%中性緩衝ホルマリンの体積に組織を入れます。
  3. パラフィン埋め込み、切除、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色のための適切な神学サービスとの連携。この研究のために、ウェストバージニア大学組織病理学コアを利用しました。あるいは、前述のプロトコル19に従ってください。

12. インビトロ細菌殺滅アッセイ

  1. 上記のように感染していない新生児の子犬から脾臓を取り出し、滅菌60 mmペトリ皿内の40 μmナイロンバスケットに入れます。これを繰り返し、一緒に収穫し、均質化するために1つのチューブに脾臓をプールします。
  2. 10%FBSで補ったPBSの5 mLを加えます。
  3. 単一の細胞懸濁液が作成されるまで滅菌3 mLシリンジプランジャーを使用して組織を分解する。
  4. ナイロンバスケットの外側の単細胞懸濁液を回収し、15 mL遠心チューブに移し、ペレット細胞を350 x g で5分間回収します。
  5. 赤血球のリシスバッファー(最大7-8脾臓の場合は2 mL)で細胞を中断し、赤血球を除去するために室温で5分間放置します。
  6. 上記のようにPBSとペレットで脾細胞を洗浄します。
  7. 期待される細胞収量に従って0.5%BSAおよび2 mM EDTAを補充するPBSの0.25 mLで脾細胞を中断する。
  8. 血球計または他の適切なアプリケーションを使用して脾細胞をカウントします。
  9. メーカーのプロトコルに従って、Ly6B.2+ (顆粒球/炎症性単球の骨髄性の集団) 細胞を免疫磁気ビーズで分離します。
  10. シードLy6B.2+ 10%FBS、2 mMグルタミン、および25 mM HEPES(完全培地)を含むDMEMの0.1 mLの体積で、黒または白の96ウェルプレートでウェルあたり1 x 105 細胞の密度で細胞をシードします。
  11. セクション1に記載されている生物発光 大腸菌 を列挙し、0.1mLの最終容積で所望の多重性感染(MOI)で細菌接種を調製する。これは、一括で共通のMOIですべての井戸に必要なものを作ることによって最もよく行われます。
  12. 0.1 mLの細菌接種または完全な培地をコントロールとして加えます。マルチウェルプレートを37°Cで、CO2 を5%で1時間インキュベートします。
  13. ピペットで静かにメディアを取り出し、新しいピペットチップでフレッシュメディアを追加することで、ゲンタマイシン(100 μg/mL)を含む0.2 mLの新鮮な完全なメディアに交換してください。培養液を2時間分培養に戻す。
  14. 3時間のポスト感染時に、プレートリーダーを用いて蓋付き培養プレートの各ウェルの発光を下から測定し、培養液を培養に戻す。
  15. 他の所望の時間ポイントで発光の測定を繰り返す。

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結果

このプロトコルは新生児マウスで細菌敗血症を誘発し、縦方向のインビタルイメージング、血液中の細菌の列挙、病理の組織学的評価、炎症性サイトカイン発現プロファイルを使用して疾患の経過を研究した。病態の徴候は、低い(2 x 106 CFU)および高い(7 x 106 CFU)の両方に感染した新生児の子犬で、時間の経過とともに大腸菌の接種を観察した。より大きな接種を受けた子犬は、移動性の低下、姿勢の矯正ができないこと、感染後24時間(hpi)までに直立した位置を維持する能力の障害を含む、より顕著な苦痛の兆候を示した。しかし、一部の子犬は他の子犬よりも悪く見えたので、罹患率の範囲がありました。感染直後、1匹の低用量動物が、ベースラインを確立するためにイメージングセッション中にイオブルラン暴露のために死亡した。24 hpiによって、6匹の高用量動物のうち2匹が全身感染に屈した(死亡率は33.3%)。高用量または低用量の接種接種を受けた感染した子犬は、24 hpiでコントロールリッターメイトよりも有意に少ない重量を量った(図1

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ディスカッション

新生児マウスで細菌敗血症を誘導する当社の肩甲膜感染モデルは、細菌病原体の縦方向の広がりをリアルタイムで研究する新しい方法です。インビタルイメージングは、新生児における細菌の播体拡散をリアルタイムで探索する機会を提供します。これは、細菌の普及の運動学を理解し、病気の適切な段階で宿主の応答および損傷をさらに研究するために重要である。マウスの子犬は、細菌の接種の皮下、肩甲骨下注射を投与される。この注射技術は、注射部位内の精度が低く、尾静脈や腹腔内感染などの他の一般的に使用される代替手段よりも簡単です。これは、子犬の小さなサイズを考えると重要です。生体内イメージングにより、動物を犠牲にすることなく、末梢組織や中枢神経系への細菌増殖と普及の縦断評価が可能になります。同様のイメージング手法と技術が癌生物学と転移の研究のために使用されている20,21.さらに、新生児ラット22における大腸菌感染時の生物発光イメージングの使用を挙げている別の研究では、ここでは新生児マウスに...

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開示事項

著者らは開示する利益相反を持っていません。

謝辞

この仕事は、C.M.Rへの機関資金によって支えられた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mL インスリン シリンジCoviden1188128012接種または PBS 注射
10% 中性緩衝ホルマリンVWR89370-094組織病理学
ACK 溶解バッファーGibcoLSA1049201細菌クリアランスアッセイ
動物 タトゥー インク ペーストケッチャムKI1482039動物識別
動物 タトゥー インク グリーン ペーストケッチャムKI1471039動物同定
抗Ly-6B.2マイクロビーズMiltenyi Biotec130-100-781細胞単離
大腸菌 O1:K1:H7ATCC11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (ルシフェラーゼを発現)N/AN/AWVU
で社内建設E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA KitOmega Bio-tekR6812RNA extration
DPBS, 1XCorning21-031-CV
Difco Tryptic Soy AgarBecton, Dickinson and Company236950細菌増殖
IL-1 ベータプライマー/プローブ (Mm00434228)Thermo Fisher Scientific4331182 Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190)サーモフィッシャーサイエンティフィック4331182サイトカイン発現 qPCR
iQ スーパーミックスバイオ・ラッド1708860リアルタイム定量
PCR iScript cDNA 合成キットバイオ・ラッド1708891cDNA 合成
アイソレーション バッファーミルテニー バイオテックN/Aバクテリアクリアランスアッセイ
IVIS スペクトラム CTおよびリビングイメージ 4.5 ソフトウェアパーキン・エルマーN/A生体内イメージング
LBブロス、レノックスフィッシャー バイオ試薬BP1427-500細菌増殖
EASYストレーナー(ナイロンバスケット)グライナーバイオワン542 040セルストレーナー
SpectraMax iD3分子デバイスN/Aプレートリーダー
ペレット 乳棒 モーターグレインジャー6HAZ6組織均質化
ポリプロピレンペレットPestlesGrainger6HAY5Tissue homogenization
Prime Thermal CyclerTechne3PRIMEBASE/02cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258)サーモフィッシャーサイエンティフィ4331182 サイトカイン発現 qPCR
TriReagent (GTCP)Molecular Research CenterTR 118RNA extration
ック

参考文献

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