高スループットシーケンシングのためのグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成

Summary

Gram陰性細菌における飽和トランスポゾン変異ライブラリーの生成方法と、その後のDNAアンプリコンライブラリーのハイスループットシーケンシングの調製方法について述べる。一例として、ESKAPE病原体 であるアシネトバクターバウマンニーに焦点を当てていますが、このプロトコルは広範囲のグラム陰性生物に適しています。

Abstract

トランスポゾンシーケンシング(Tn-seq)は、トランスポゾン突然変異誘発と大規模な並列シーケンシングを組み合わせて、幅広い環境条件下で細菌の適合性に寄与する遺伝子や経路を同定する強力な方法です。Tn-seqアプリケーションは広範囲に及び、生物レベルでの遺伝子型-表現型関係の検査を可能にしているだけでなく、集団、コミュニティ、システムレベルでも可能にしています。グラム陰性細菌は抗菌性のフェノタイプと高く関連しており、抗生物質治療の失敗の発生が増加しています。抗菌性は、それ以外の場合は致死的な抗生物質の存在下で細菌の増殖として定義される。「最終線」抗菌コリスチンは、グラム陰性細菌感染を治療するために使用される。しかし、 アシネトバクターバウマンニ を含むいくつかのグラム陰性病原体は、さまざまな分子機構を介してコリスチン耐性を発症し、その一部はTn-seqを用いて特徴付けられる。さらに、コリスチン耐性を調節するシグナル伝達経路は、グラム陰性菌内で変化する。ここでは、制限酵素、アダプターライゲーション、ゲル精製の必要性を排除することにより、飽和トランスポゾン挿入ライブラリとアンプリコンライブラリ構築の生成を合理化する A.バウマンニー におけるトランスポゾン突然変異誘発の効率的な方法を提案する。本明細書に記載されている方法は、コリスチンに挑戦したときに A.バウマンニの 適合性に寄与する分子決定因子の詳細な分析を可能にする。このプロトコルは、主に薬剤耐性病院で感染した感染症に関連する他のグラム陰性ESKAPE病原体にも適用可能である。

Introduction

抗生物質の発見は間違いなく20^世紀の最も影響を与える健康関連の出来事の一つです。抗生物質は重篤な細菌感染を迅速に解決するだけでなく、現代医学においても極めて重要な役割を果たします。新生児医学と化学療法の主要な手術、移植および進歩は患者を生命を脅かす感染症の影響を受けやすくし、これらの療法は抗生物質^11、22なしでは不可能であろう。しかし、ヒト病原体間での抗生物質耐性の急速な発達と普及は、すべての臨床的に重要なクラスの抗生物質の有効性を有意に低下させた^3。かつて抗生物質治療で容易にクリアされた多くの細菌感染は、もはや古典的な治療プロトコルに反応しなくなり、世界的な公衆衛生に深刻な脅威を引き起こす^1.抗菌性(AMR)は、治療期間^44、55に関係なく、抗生物質の致死濃度以外の場合に細菌細胞が増殖する場所である。AMRを調節する分子および生化学的要因を理解することが緊急に必要であり、代替抗菌性開発の指針となる。具体的には、ESKAPE病原体は臨床現場で問題があり、広範囲なAMRに関連している。これらには、Eンテロコッカス・フェシウム、Sタピロコッカス・アウレウス、Kレブシエラ・ニューモニエ、Aシネトバクター・バウマンニ、P・セウドモナス・エルギノサ、Eンテロバクター属が含まれる。いくつかのメカニズムはESKAPE病原体のAMRに寄与するが、後者の4つの生物はグラム陰性である。

グラム陰性菌は、有害な環境条件からそれらを保護する定義外膜を組み立てます。外膜は、抗生物質などの有毒分子の細胞への侵入を制限する透過性障壁として機能する。他の生体膜とは異なり、外膜は非対称である。外側のリーフレットは表面に露出したリポ多糖類で富化され、一方、内リーフレットはリン脂質⁶の混合物である。リポ多糖類分子は、脂質二重層⁷内に埋め込まれた保存脂質A部分によって外膜に固定される。大腸菌のカノニカル脂質Aドメインは、ほとんどのグラム陰性細菌の増殖に必要であり、グラム陰性生物^{66、7、87,8}において最も基本的かつ保存された経路の1つである9段階の酵素経路によって合成される。

ポリミキシンは、リポ多糖の脂質Aドメインを標的とするカチオ性抗菌ペプチドであり、外膜を摂動し、細胞を分解する。ポリミキシンの正に帯電した残基と負に帯電した脂質Aリン酸基との間の静電相互作用は、最終的に細胞死^{につながる}細菌細胞膜を破壊する^{9,10,,11,,12,,13.}コリスチン(ポリミキシンE)は、多剤耐性グラム陰性ノソコノミアル病原体に起因する感染症を治療するために使用される最後の手段である抗菌薬であり、例えばアシネトバクターバウマンニー¹⁴14、15、16。^,15,16最初に発見された 1947, ポリミキシンは、土壌細菌によって生成されます,パエニバチルスポリミキサ^17,,18,,19.ポリミキシンは、有意な腎および神経毒性^20,21,21の報告のために、臨床的使用が制限される前に、グラム陰性感染症を何年も治療するために処方された。

A. バウマンニは、最近数十年にわたって患者の転帰の罹患率と死亡率を劇的に増加させた院内性のグラム陰性病原体^{である 22}.かつては低脅威病原体と見なされていたものは、AMRを獲得する能力と流行のリスクが高いため、世界中の病院で感染する重大なリスクを引き起こします^。,24A. バウマンニは、米国の経経性感染症の10%以上を占めています。疾患は、肺炎、菌血症、尿路感染症、皮膚および軟部組織感染症、髄膜炎、および心内膜炎²⁵として現れる。A.バウマンニー感染症の治療選択肢は、βラクタム、フルオロキノロン、テトラサイクリン、およびアミノグリコシド^23,24,24を含むほぼすべての抗生物質クラスに対する耐性のために減少している。多剤耐性、広範囲に薬剤耐性および汎薬剤耐性A.バウマンニの分離株の有病率は、コリスチン治療の復活につながっている。しかし、A.バウマンニ分離株間のコリスチン耐性の増加は、^,世界の公衆衛生10、11、12、13、27、30、31に対する脅威をさらに増幅している。^{10,11,12,1327,30,31}

トランスポゾンシーケンシング(Tn-seq)などのハイスループットシーケンシング技術の最近の進歩は、インビトロおよびインビボでの細菌適性の理解を進めるための重要なツールを提供してきました。Tn-seqは細菌の遺伝子型-表現型相互作用を研究するために利用することができる強力な用具である。Tn-seqは細菌病原体全体に広く適用可能であり、従来のトランスポゾン突然変異誘発と大規模な平行シーケンシングを組み合わせて迅速に挿入部位をマッピングし、DNA変異を^,ゲノム全体のスケール32、33、34、35で表皮変異体にリンクするために使用できる。^32,3334,35トランスポゾン変異生成法は既に説明されているが、一般的なステップは³³に類似している。まず、挿入ライブラリはトランスポゾン変異生成を使用して生成され、そこで集団内の各細菌細胞はゲノムDNA(gDNA)内の単一のトランスポゾン挿入に制限される。突然変異誘発の後、個々の突然変異体がプールされる。gDNAは挿入変異体プールから抽出され、トランスポゾン接合部は増幅され、ハイスループットシーケンシングを受けます。読み取りは、ゲノムにマッピングできる挿入部位を表します。適性を減らすトランスポゾン挿入は、有益な挿入が豊かにされている間、すぐに集団から落ちる。Tn-seqは、遺伝子がストレス³³の細菌フィットネスにどのような影響を与えるかについての理解を進めるのに役立っています。

pJNW684でコード化されたHimar1マリナートランスポゾンシステムは、トランスポゾン変異生成の目的のために特別に構築され、最適化されました。カナマイシン耐性遺伝子に隣接するマリナー-ファミリートランスポゾンを含み、A.バウマンニにおけるトランスポゾン挿入変異体の選択に使用される。また、トランスポザーゼコード遺伝子³⁶の発現を駆動するA.バウマンニ特異的プロモーターをコードする。このマリナー系トランスポゾンには、カナマイシン耐性遺伝子の下流に2つのトランスレーショナルターミネーターが含まれており、挿入³⁷の下流に読み込みを防止する。pJNW684はまた^、38を複製するためにドナー株によって寄与するλpir遺伝子を必要とする複製のRP4/oriT/oriR6K条件付き起源を運ぶ。λpir 遺伝子がない場合、転位機械を運ぶpJNW684ベクターは、A.バウマンニ受信者株^{10、36、3836,38}において¹⁰複製することができない。したがって、細菌結合の間に、トランスポゾンのみが、トランスポザーゼ遺伝子を運ぶプラスミドのバックグラウンド挿入なしにレシピエントゲノムに挿入される。これは、トランスポザーゼ活性の喪失がプラスミドと共に、レシピエントゲノムに挿入されるとトランスポゾンが異なる場所に移動するのを妨げる単一の安定した転置イベントをもたらすので、重要です。

pJNW648はまた、別のグラム陰性生物、 大腸菌での活動についてテストされています。 大腸菌 株W3110における飽和Tn-seqライブラリーの組み立て成功は、腸内細菌科を含む幅広い病原体で変異誘発を行うことが可能であることを示した。さらに、トランスポザーゼ発現を駆動する A.バウマンニ 特異的プロモーターは、種特異的プロモーターと迅速に交換することができる。最後に、カナマイシン耐性遺伝子は、研究されている生物のAMR表現型に応じて、他の耐性カセットと交換することができる。

A. バウマンニのコリスチン耐性に寄与する1つの要因は、細菌が非致死レベル³⁹で選択的圧力にさらされる不十分な用量の投与である。いくつかの報告は、抑制性抗菌濃度が、細菌集団全体の感受性を低下させるために細胞生理学を変化させる調節応答を誘導し得ることを示した^{11,,12,30,,31.,}Tn-seqを用いて、阻害性¹⁰およびコリスチンの亜阻害濃度にさらされた後、A.バウマンニ株ATCC 17978におけるコリスチン耐性を調節する因子を発見した。この例では、マリナーベースのトランスポソン^40,41,41ファミリーを使用して飽和トランスポゾン変異ライブラリの構築と濃縮を合理化するTn-seq法を詳述する。いくつかのTn-seqA. baumanniiプロトコルは、20,000 -100,000変異体³⁵35、42、43、44、45、46を生成するが、本明細書に記載されているプロトコルは、400,000+変異体のトランスポゾンライブラリを急速に生成することができ、これはおよそ^{,42,43,44,45,4610}塩基対毎にトランスポゾンに相当する。さらに、ライブラリのサイズは、多大な追加の努力をせずにスケールアップすることができます。この方法はまた、制限エンドヌクレアーゼ、アダプターライゲーションおよびゲル精製の要件を排除し、最終的なライブラリの多様性を減らすことができます。

Protocol

1. 細菌株の調製

1. 600 μMのジアミノピメル酸(DAP)、アンピシリン100mg/L、カンマイシン25mg/Lを補ったルリア・ベルタニ寒天上の孤立したコロニーに対する「ドナー」株(大腸菌 MFD DAP^-/pJNW684、 材料表)をストリークする。37°Cで一晩インキュベートする。 単一の単一の単一のコロニーを使用して、600 μM DAP、100 mg/L のアンピシリン、25mg/L のカナマイシンを250 mL のエルレンマイヤーフラスコで補ったルリアブロス(LB)の 50 mL を接種し、それを「ドナー」とラベル付けする。
2. ルリア・ベルタニ寒天上の孤立したコロニーのための「レシピエント」株(A.バウマンニ 株ATCC 17978、 材料表)をストリーク。37°Cで一晩インキュベートする。 単一の単一の分離されたコロニーを使用して、250 mLのエルレンマイヤーフラスコにLBの50 mLを接種し、「受取人」としてラベル付けする。
3. 両方の培養物(「ドナー」と「レシピエント」)を37°Cで一晩揺れでインキュベートする。

2. バクテリア嵌合

1. 一晩培養物を50 mL円錐管に移す。
2. ペレットは、5,000xgで7分間遠心を用いたレシピと x g ドナー培養物の両方を用いた。
3. 上清を捨て、残留抗生物質を洗い流すためにDAPを補充したLBの35 mLの「ドナー」株ペレットを再中断する。
4. ペレットは、5,000 x g で遠心分離を用いて細胞を「ドナー」株7分間用いた。
5. 上清を捨て、DAPを補充したLBの4.5 mLに「ドナー」株ペレットを再中断する。10 mL血清ピペットを使用してください。
6. 再懸濁された「ドナー」株をペレット化された「レシピエント」細胞を含む「レシピエント」株チューブに移す。同じ10 mL血清学的ピペットをステップ2.5から使用して培養を混合する。すぐに次のステップに進みます。
   注意:最終サスペンションの総容量は5mLにする必要があります。
7. 交配懸濁液を、DAP(プレート当たり5~7滴)を補ったLB寒天プレートに個別の100μL液滴として分配する(図1A)。
8. プレートを室温で30分間インキュベートします。
9. 液滴を邪魔することなく、プレートを慎重に37°Cインキュベーターに移し、培養物を1時間交尾させます。
   注:1時間を超える潜伏期間は、姉妹変異体の生成を危険にさらす。
10. インキュベーションに続いて、各プレートに1.5mLのLBを加え、プレートから細菌を再懸濁して収穫します。1 mL マイクロピペットを使用して再懸濁します。最終ボリュームは約12〜15mLである必要があります。
11. 収穫した細胞を50 mLの円錐形の管で結合する。
12. ペレットは、5,000 x g で7分間遠心分離を用いて細胞を合分させた。
13. 上清を捨て、残りのDAPを除去するために50 mLのLBで細胞を再懸濁します。
14. ペレットは、5,000 x g で遠心分離を用いて交配し、7分間行う。
15. 洗浄手順を繰り返します(ステップ2.13および2.14)。
16. 10 mL血清ピペットを使用して、25%グリセロールを補充したLBの10 mLでペレットを再懸濁する。
17. 洗浄された細胞を使用して、LBスープ(1:10、1:100、1:1000、1:10,000、1:100,000)で5つの連続希釈液を作ります。
18. 滅菌ガラスビーズを使用して4つの異なるプレートに各希釈液の100 μLを広げる:カナマイシンを補充したルリア・ベルタニ寒天、アンピシリンを補充した寒天、DAPと寒天のみを補った寒天。
19. 一晩で37°Cでプレートをインキュベートする。
20. アリコート1 mLアリコートで残りの交配を行い、-80°Cで保存する。

3. トランスポゾンライブラリの適切な希釈を決定する

1. コロニー形成ユニット(CFU)を一晩プレートから記録します。
2. 異なるプレート条件ごとに、計数可能なコロニーを持つプレートをイメージする(図2A)。
   注:両方の「ドナー」と「レシピエント」株は、DAPを補った寒天プレート上に成長する必要がありますので、ほとんどのめっき希釈は芝生をもたらすでしょう。「レシピエント」株だけが寒天プレート上で成長することができます。「ドナー」も「レシピエント」株もアンピシリンを補充した寒天プレート上で成長することはできませんので、どれも/最小限の成長が必要です。トランスポゾン挿入をコードする標的株細胞のみが、カナマイシンを補った寒天プレート上で増殖することができる。コロニーの大きさはさまざまで、カナマイシンを補充した寒天の適性に寄与する遺伝子におけるトランスポゾン挿入を示す。
3. 凍結交配中のトランスポゾン変異体の数を計算し、カナマイシンを補ったLB寒天プレート上のコロニー数を数えて計算する。
   注:A.バウマンニゲノム(約4Mbps)の目標は、高解像度の変異ライブラリ(約1つのトランスポゾン挿入/10塩基対)を生成するために約40万個のコロニーを得ることであった。しかし、この数は、標的種のゲノムサイズに基づいて最適化されるべきである)。

4. 最終細菌変異体ライブラリーの生成

1. 氷の上の凍結交配のアリコートを解凍します。
2. ステップ3.1で計算されたCFUsに基づいてカナマイシンを補った150 mmルリア・ベルタニ寒天プレートのプレート交配。LBでボリュームを調整して、めっき前に150 μLあたり13,333コロニーを得ます。
   注:ここでのCFU数は約10⁵ CFU /mLであると判断したので、プレートを過密にすることなく、高解像度の変異ライブラリに30プレート上の最適なコロニー数を提供するため、交配体積はプレートあたり13,333コロニーを得るように調整されました。
3. 滅菌ガラスビーズを使用して、30 x 150 mmルリア・ベルタニ寒天プレートにプレート当たり150 μLを広げ、カナマイシンを補い40万コロニーを得る(図1C)。
   注:滅菌棒または無菌拡散器ツール(すなわち、ガラスビーズ)の任意の種類は、プレート上の細菌を広げるために使用することができます。
4. 過剰な嵌合物を含む使用済みチューブを処分する。
   注: 凍結/解凍サイクルは細菌培養に選択的な圧力を加え、Tn-seq実験結果を歪めることができます。毎回新鮮なアリコートを使用してください。
5. 37°Cで14時間インキュベートプレート。
   注:インキュベーション時間は、過剰増殖(コロニーが触れる)を防ぐために最適化されています。インキュベーション時間を短縮して成長を最小限に抑える方法が提案される。

5. ストレージのライブラリ密度とプールの見積もり

1. 各プレートの CFUs をカウントして、トランスポゾンライブラリの総変異体を推定します。プレートのグループ全体のコロニー数の推定値を決定するために、少なくとも3つのプレートの20%を数える(図2A)。コロニーが別のコロニーに触れていないことを確認します。
2. 推定コロニー収量を計算した後、各プレートに3〜5mLのLB(必要に応じて以上)を加え、滅菌スクレイピングツールを使用して細菌を掻き落とします。
   注:滅菌接種ループは、効率的にプレートを削るために使用されました。
3. すべてのプレートから50 mLの円錐形チューブに細菌の懸濁液をプールする(図1D)。これは、少なくとも3、複数の50 mL円錐管を必要とします。
4. ペレットは、5,000 x g で7分間の遠心分離を使用して細菌懸濁液をプールした。
5. 上清を捨て、30%グリセロールを補充したLBの5mLでペレットを再懸濁します。
6. トランスポゾンライブラリーのアリコート1 mLをクライオビシャルに入れ、-80°Cで保管する。

6. A. バウマンニにおけるコリスチン耐性を調節する因子の同定

1. 4 x 250 mL エルレンマイヤーフラスコを準備し、それぞれに 50 mL LB ブロスとラベルを含む (図 2B)
   1. A. バウマンニ株 ATCC 17978 Tn-seqライブラリ;(-) colistin_1
   2. A. バウマンニ株 ATCC 17978 Tn-seqライブラリ;(-) colistin_2
   3. A. バウマンニ株 ATCC 17978 Tn-seqライブラリ;(+) colistin_1
   4. A. バウマンニ株 ATCC 17978 Tn-seqライブラリ;(+) colistin_2
      注: ここで説明する課題の成長では、各条件(-)コリスチン制御および(+)コリスチンチャレンジが重複してテストされています。したがって、セットアップは、4 x 250 mLエルレンマイヤーフラスコ、条件ごとに2を必要とします。
2. 0.5 mg/L コリスチンの 50 μL を (+) コリスチンフラスコ (6.1.3 および 6.1.4) に加え、50 μL の水を (-) コリスチン フラスコ (6.1.1 および 6.1.2) に加えます。
3. 氷上のステップ5から凍結Tn-seqライブラリアリコートを解凍します。
4. 解凍したライブラリのピペット1 μLをPBSの1 mLにします。
5. 光密度を600 nm(OD₆₀₀₎で測定し、1,000を掛けます。
   注:これはTnライブラリの1 μLのOD₆₀₀ を決定します。
6. ステップ6.5の計算に基づいて、50mL LBを含む各フラスコを最終OD_{600 0.001} に接種する。
7. 37°C~OD₆₀₀ 0.5で振る培養液で培養を行います。
   注: 培養は対数成長段階にとどまることが重要であるため、指数成長の間に異なる OD₆₀₀ の株がある場合、OD₆₀₀ は、培養が対数成長フェーズ内で可能な限り何度も複製されるように調整する必要があります。培養が3回しか複製しなかなければ、変異体のフィットネス欠陥を検出する力は、理論的には3倍の差で制限される。異なる細菌は、異なる倍時間を有するので、開始接種を正常化するために、固定OD₆₀₀ で培養物を播種することが重要である。これにより、すべてのカルチャでライブラリ全体を一貫して表現できます。
8. 4°Cで5,000xgで7分間遠x g心培養を行う。
9. 上清を取り出し、50mLのPBSで洗います。
10. ペレットは4°Cで5,000xgでx g遠心分離を用いて7分間使用した。
11. 上清を取り除き、PBSの1 mLでペレットを再懸濁します。アリコート~200μLを5マイクロ遠心チューブに。
12. 4°Cで5000xgで遠心分離x gを用いたペレットを5分間使用した。ピペットチップを使用して上清をすべて取り除きます。
13. ペレットを-20°Cで保存するか、gDNA抽出を進めます。

7. gDNA抽出

1. 氷の上に1つの細胞ペレットを解凍します。
2. 0.6 mLのリシスバッファー(材料表)と渦を加え、ペレットを完全に再懸濁します。
3. 37°Cで1時間インキュベートする。
4. 0.6 mLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールをサンプルに加え、渦を激しく加えます。
5. マイクロ遠心分離を使用してフェーズを分離し、室内温度で最大速度で5分間。
6. 上部水相を新しいチューブに移します。転送中に位相インタフェースを乱さないようにします。
7. 上記で得られた水相に等量のクロロホルムを加え、渦を激しく加えます。
8. マイクロ遠心分離を使用して、室内温度で5分間の最大速度で遠心分離を使用してフェーズを分離します。
9. 上部水相を新しいチューブに移します。
   注:転送中にインターフェイスを乱さないようにしてください。
10. 冷たい100%エタノールの2.5倍の水相体積を加え、穏やかに混ぜます。沈殿したDNAが見える。
11. チューブを-80°Cで1時間以上置きます。
12. 4°Cで最大速度で遠心分離を用いたペレットDNAを30分間使用した。
13. DNAペレットを乱さずに上清を慎重に除去し、ピペット処理により70%エタノールの150 μLで洗浄します。
14. ペレットDNAは、最大速度で最大速度で2分間遠心分離を用いた。
15. 上清を慎重に取り除いてください。
16. ステップ 7.14 を 1 回繰り返します。残りのすべてのエタノールを慎重に除去します。
17. 室温で5〜10分間インキュベートすることによりDNAを乾燥させる。
18. ピペット処理によりDNAペレットを100μLのTEバッファーに再懸濁します。

8. DNAせん断 (図 3A)

1. 全容200μLで250ng/mLの濃度にTEバッファーを用いてgDNAを希釈します。
2. 水浴の超音波処理器にチューブを置きます。
3. 約300ヌクレオチドの断片を得るためにDNAを超音波処理する。パワー:60%、合計時間:20分、サイクル:10 s ON、4°Cで10s OFF(図3A)
4. 1%アガロースゲル上の10μLの未シェレ化DNAと10μLの皮層DNAを分離することにより、DNAを適切に切り取っていることを確認します。超音波処理を繰り返すか、必要に応じて最適化します (図 3B)。

9. 3'の端に追加されたポリCテール(図3A)

1. 表1に従ってポリC反応を設定する。
2. 37°Cで1時間インキュベート反応する。
3. 以下の手順に従って、40 μLのサイズ選択常磁性ビーズ (図 3A)でポリC反応を精製します。
   1. 各サンプルに40 μLのサイズ選択常磁性ビーズを加えます。渦~5sまたはピペット上下。
   2. 室温でサンプルを5分間インキュベートします。
   3. 簡単に言えば、遠心管はチューブの底部に液体を集める(〜2s)。
   4. チューブを磁気ラックに移し、溶液が透明になるまで~2分間室温でインキュベートします。
   5. 磁気ラックにチューブを付けて、上清を慎重に取り外します。
   6. マグネットラックにチューブを使用して、200 μLの新しく調製した80%エタノールを追加します(ビーズを邪魔しないでください)。
   7. 溶液が透明になるまで、少なくとも30sのサンプルをインキュベートする。
   8. 磁気ラックにチューブを付けて、上清を慎重に取り外します。
   9. 洗浄手順を繰り返します(ステップ9.3.6~9.3.8)。
   10. 短い遠心分離工程(〜2s)を使用して、チューブの底部に液体を集める。
   11. チューブを磁気ラックに移し、残りの液体を取り外します。
   12. 2~5分間乾燥したサンプルを室温でインキュベートします。乾燥し過ぎないでください。
   13. 磁気ラックからチューブを取り外し、それぞれに25μLの水を加えます。〜5 sまたはピペットの上下のための渦。
   14. 簡単に言えば、遠心管はチューブの底部に液体を集める(〜2s)。
   15. チューブを磁気ラックに移し、溶液がはっきりするまで~2分間座るようにします。
   16. 磁気ラックにチューブを使用して、ビーズを邪魔することなく液体を取り除き、新しいチューブ(〜23 μLのDNA)に移します。

10. トランスポゾン接合増幅 (図3A)

1. 第 1 ネスト PCR の 表 1 に記載されている PCR 1 のセットアップ (表 2) 。
2. 表1に記載の条件を用いてPCR1を実行 する。
3. サイズ選択の常磁性ビーズを 40 μLで PCR 製品を精製します(ステップ 9.3.1 ~ 9.3-12)。50 μLの水で溶出します(ステップ9.3.13 - 9.3.16)。この時点で、サンプルは-20°Cで保存することができる。
4. ストレプトアビジン結合常磁性ビーズを準備する:
   1. 激しく振ってストレプトアビジンビーズを再中断します。
   2. 新鮮なマイクロ遠心チューブにサンプルあたり32 μLのビーズを加えます。
      注:6 + サンプルのビーズは、単一のチューブで調製することができます。
   3. チューブを磁気ラックに移します。溶液が透明になるまで〜2分間インキュベートする。
   4. 磁気ラックにチューブを付けて、上清を取り除く。
   5. 磁気ラックからチューブを取り外します。1 mL 1x B&Wバッファーに重ね順にピペットを入れ、ビーズを洗浄します。
   6. チューブを磁気ラックに移します。溶液が透明になるまで〜2分間インキュベートする。
   7. チューブを磁気ラックに付けて、上清を取り外します。
   8. 1 mL 1x B&Wバッファー(ステップ10.4.5~10.4.7)で洗浄を2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。
   9. マグネットラックからチューブを取り外し、サンプルあたり2倍のB&Wバッファの52 μLでビーズを再中断します。
5. 50 μL の精製された PCR1 と 50 μL の精製された PCR1 を組み合わせます(ステップ 10.3 から)。ミキシングするピペット。
6. 室温で30分間回転します。
7. バインドされていないDNAを洗い流す:
   1. 簡単に言えば、遠心分離機はチューブの底部に液体を集める(〜2s)。
   2. チューブを磁気ラックに移します。溶液が透明になるまで〜2分間インキュベートする。
   3. チューブを磁気ラックに付けて、上清を取り外します。
   4. 磁気ラックからチューブを取り外し、100 μL 1x B&Wバッファで再サスペンドしてビーズを洗浄し、上下にピペットを入れます。
   5. チューブを磁気ラックに移します。溶液が透明になるまで〜2分間インキュベートする。
   6. 磁気ラックにチューブを付けて、上清を取り除く。
   7. 100 μL LoTE (ステップ 10.7.4 ~ 10.7.6) でさらに 2 回、洗浄を合計 3 回繰り返します。
8. トランスポゾン接合部を増幅し、各サンプルにバーコードを1つ追加する場合の表1に記載されているPCR2の設定(表2および表3)。
9. 表1に記載の条件を使用してPCR2を実行する。
10. サイズ選択の常磁性ビーズの40 μLで精製します(ステップ9.3.1 ~ 9.3.12)。17 μLの水(ステップ9.3.13 ~ 9.3.16)で溶出し、~15 μLを集めます。
11. フルオメーターを使用してDNA濃度を定量化します。最終的な濃度は~50〜250 ng/μlである必要があります。
12. チップベースの毛細管電気泳動を用いてDNAの品質を評価する(図4A)。

Results

概説された方法は、プラスミドpJNW684を複製する大腸菌MFD DAP-を用いた細菌結合を介して^-A.バウマンニ株ATCC 17978における高密度トランスポゾンライブラリーの生成を記述する(図4B)。詳細なプロトコルは、大腸菌λpir+ドナー株からA.バウマンニレシピエント株へのpJNW684の転送にバイペアの細菌結合を使用する。これは、高密度トランスポゾン変異ライブラリを生成するための効率的かつ安価な方法です。細菌は最適化された比率で混合され、交配は1時間のルリア・ベルタニ寒天プレートに発見された(図1A)。交配中、トランスポゾンをドナーからレシピエント株に移し、そこでgDNAに挿入した(図1B)。交配物を採取し、約10⁵ CFU/mLを計算し、カナマイシンを加えた150mm x 15mm寒天プレートにメッキした

Discussion

A. バウマンニは、コリス^,チン^,,,,10、11、12、23、24、30、31などの「ラストライン」^10,11治療薬に対するAMRの急速な取得による世界的な公衆衛生に対する新たな脅威である。^1223243031ここ数十年、Tn-seqは、多くの細菌種にわたって遺伝子型-表現型相互作用を解明し、細菌遺伝学^{34、35、42、4335,42}の³⁴理解を深める上で重要な役割

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mM ddCTP, 2',3'-Dideoxycytidine-5'-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2'-Deoxycytidine-5'-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm シャーレ	コーニング	351029
150mm x 15mmシャーレ	コーニング	351058
1X B&W	N/A	N/A	希薄 2X B&Wを半分にすると、1X B&Wが得られます。
2,6-ジアミノピメリン酸	アルファエーザー	B2239103	600μで使用されています。M
2X B&W	N/A	N/A 2	M NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA(pH 7.5)を水に加えます。ストレプトアビジンビーズと併用します。溶液は室温に保ちます。
50mL円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離管	フィッシャーサイエンティフィック	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml 水.-20°Cで保管してください。
AccuPrimeTM Pfx DNA ポリメラーゼ	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
>Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	を 100 mg/L で使用
AMPure XP PCR 精製システム	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer 高感度 DNA 分析	Agilent	5067-4626
デオキシヌクレオチド溶液ミックス (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 磁気ラック	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-N	/A	N/A	DAP補助栄養剤は、成長するために600 mMの外因的に添加されたDAPを必要とします。プラスミド転写用のRP4機構が含まれています。JNW68用キャリア(36)。
エタノール	ッシャーサイエンティフィ	A4094
おねじ極低温バイアルコー	ニング	09-761-71
ガラスビーズ	コーニング	72684
グリセロール	フィッシャーサイエンティフィック	G33
接種ループフィ	ッシャーサイエンティフィック	22-363-602	スクレイピングツール
カナマイシン	フィッシャーサイエンティフィック	BP906	25 mg/L
LB 寒天、Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB ブロス、Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	3 mM Tris-HCl、0.2 mM EDTA(pH 7.5)を水に加えます。ストレプトアビジンビーズと併用します。溶液は室温に保ちます。
溶解バッファー	N/A	N/A	9.34 mL TE バッファー、10% SDS 600 ml、プロテイナーゼ K (20 mg/mL) 60 ml
ノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1 混合物、pH 6.7/8.0、液)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgeratedウォーターバス	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (rTdt)	Promega	PR-M1875