このプロトコルは嚢胞性線維症の患者の喀痰内の細菌のセルそして多糖類の統合の遺伝子座(Psl)の多糖類の視覚化のための方法を提供する。
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この記事について
サマリー
要約
嚢胞性線維症患者の肺内の緑膿菌の早期発見と根絶は、慢性感染症を発症する可能性を減らすことができます。慢性緑膿菌感染症の発症は、肺機能の低下と罹患率の増加に関連しています。したがって、小児患者の約10〜40%で発生する抗生物質療法で緑膿菌を根絶できない理由を解明することに大きな関心があります。緑膿菌の宿主クリアランスと抗生物質感受性に影響を与える多くの要因の1つは、空間構成(凝集やバイオフィルム形成など)と多糖類産生の変動です。そこで、CF患者の喀痰中の緑膿菌のin situ特性を可視化することに興味を持ちました。喀痰サンプルをハイドロゲルマトリックスに包埋した後、組織透明化技術を適用し、宿主細胞に対する3D構造を保持しました。組織透明化後、蛍光標識および色素を添加し、可視化を可能にした。細菌細胞の可視化のために蛍光in situハイブリダイゼーションを行い、エキソ多糖類の可視化のために蛍光標識抗Psl抗体を結合させ、DAPI染色を行って宿主細胞を染色し、構造的洞察を得ました。これらの方法により、共焦点レーザー走査型顕微鏡によるCF患者の喀痰中の緑膿菌の高解像度イメージングが可能になりました。
概要
本研究では、小児嚢胞性線維症(CF)患者の喀痰中の緑膿菌のin vivo構造を可視化する実験が設計されました。緑膿菌感染症は、小児CF人口の30〜40%で慢性化します。慢性感染症が確立されると、それらを排除することはほとんど不可能です1.緑膿菌の早期感染患者から分離された緑膿菌株は、一般的に抗菌薬の影響を受けやすいため、慢性感染症の確立を防ぐために抗シュードモナル抗生物質で治療されます2。残念ながら、すべての緑膿菌分離株が抗生物質療法後に肺から効果的に除去されるわけではありません。抗生物質の失敗に関連する正確なメカニズムは完全には解明されていません。これまでの研究では、バイオフィルム細胞の密度、凝集、多糖類産生のばらつきが抗生物質の有効性に影響を与える可能性があることが示されています3。緑膿菌は、Pel、Psl、アルギン酸の3つの細胞外多糖類を産生します4。緑膿菌のほとんどの菌株は、それぞれのエキソ多糖類を発現する遺伝的能力を持っていますが、多くの場合、1種類の多糖類が主に発現しています5。アルギン酸エキソ多糖類は、CF肺の慢性感染症と関連しており、ムコイド表現型
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プロトコル
研究倫理委員会(REB)の承認は、被験者から喀痰サンプルを収集して保管するために必要です。本論文で紹介する研究は、Hospital for Sick Children REB#1000058579によって承認されました。
1.痰の収集
- 喀痰を滅菌コレクションカップに保管し、固定前に4°Cで最大24時間直ちに保管します。.
注:固定せずに4°Cで喀痰を長時間放置すると、細胞の分解、特に白血球の分解につながる可能性があります。できるだけ早く固定することが望ましいです。 - 喀痰サンプルを滅菌15mLチューブに移します。
- 等量の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を喀痰サンプルに加えます。例えば、喀痰サンプルが0.5 mLの場合、0.5 mLの4%PFAを加えます。穏やかな反転で混ぜます。
- 喀痰を4°Cで一晩インキュベートします。
- 固定喀痰2 mLそれぞれに5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えてサンプルを洗浄します。
注:この洗浄ステップに必要な遠心分離はありません。 - ピペットで上澄みを慎重に取り除きます。
注意: 先端を痰から遠ざけてピペットで痰を吸い上げないようにし、表面の液体を非常にゆっくりと吸引します。洗浄ステップは遠心分離を伴わないため、喀痰栓の構造的完全性を損なわない。 - 手順1.6〜1.7をさらに2回繰り返しま....
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結果
実験の全体的な計画を図 1 と 図2にまとめます。 図1 は、喀痰処理と喀痰除去プロトコルの概要を示しています。喀痰の処理と除去には最大17日かかる場合があります。ただし、プロトコルは停止する可能性があり、サンプルはPFAによる固定後(2日目)または組織除去後(クリア時間に応じて5〜17日目)に保存できます。 図2に、FISHと抗体の結合プロトコルをまとめました。FISHおよび抗体染色プロトコルは完了するまでに4日かかりますが、開始後に完了し、共焦点画像を撮影する必要があります。上記のプロトコルを使用して、緑 膿菌 細胞の高解像度3D画像を取得し、喀痰内のin-situ構造を視覚化することができます。
このプロトコルで使用される藻の除去そしてそれに続く適用はサンプル内の P.の緑膿菌の 詳しい視覚化を可能にする.......
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ディスカッション
このプロトコルの目的はCFの患者からの喀痰の P.のaeruginosa のセルのその場の構成に垣間見るようにすることである。喀痰サンプルは、すぐに固定できない場合は、処理されるまで4°Cで保存する必要があります。喀痰中の 緑膿菌 の細胞数は、4°Cで保存した場合、1時間、24時間、または48時間処理しても有意に変化しないことが実証されていますが、25°Cで24時間または48時間放置すると、細菌の増殖の結果として細菌の細胞数が大幅に増加します14。この研究では、喀痰サンプルは去痰後最大24時間まで4°Cで保存されました。炎症性細胞数は、4°Cで放置し、9時間以上後に処理すると、喀痰中に減少することが示されていることに注意する必要があります15。したがって、サンプル処理のカットオフ時間を決定する際には、喀痰で視覚化したい特定の細胞とマーカーを考慮することが重要です。
この方法でのサンプル処理は、喀痰サンプルを 4 % PFA に固定することから始まります.......
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謝辞
著者らは、この研究に資金を提供してくれた嚢胞性線維症財団と、抗Psl0096抗体を惜しみなく寄付してくれたMedImmuneに感謝の意を表したいと思います。この研究では、トロント大学のCAMiLoDイメージング施設でイメージングを実施しました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 29:1 アクリルアミド ビスアクリルアミド、30 % 溶液 | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | 注文内容: 製品:改変DNAオリゴ;名前:PseaerA;シーケンス: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC;合成:50 nmol;精製:HPLC;出荷状態:フルイールド(ドライ) | |
| Psl0096-テキサスレッド | メディミューン | Psl0096-テキサスレッド抗体は、メディミューンから提供された贈り物であり、注文に関するお問い合わせは会社に連絡する必要があります。 | |
| VA-044 硬化剤 | 和光 | 27776-21-21 |
参考文献
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L.
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再版と許可
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