方法論記事

メチルサリチル酸除去と3Dイメージングによる脂肪組織構造の探索

DOI：

10.3791/61640

⸱

2020年8月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity", Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Haematometabolism in Diseases", Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、蛍光イメージングによる血管系、核、免疫細胞、ニューロン、脂質・液滴被覆タンパク質を可視化するマーカーを組み合わせて、マウスとヒトの両方の白色脂肪組織の3D構造を解決するための簡単で安価で迅速なクリアリング方法について述べています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肥満は、心血管疾患、2型糖尿病、および肝臓疾患を発症するリスクを高める世界的な公衆衛生上の主要な問題です。肥満は脂肪細胞肥大や肥大による脂肪組織(AT)質量の増加を特徴とし、その三次元構造の深い改造につながる。確かに、肥満の間に拡大するATの最大容量は肥満関連病理の開発にとって極めて重要である。このAT拡張は、過剰なエネルギー摂取量への適応を可能にし、筋肉や肝臓などの他の代謝器官への有害な脂質の波及を避けるために重要な恒食機構です。従って、AT拡張の失敗につながる構造改造を理解することは、臨床的適用性の高い根本的な問題である。本稿では、蛍光イメージングによるマウスとヒト白脂肪組織の形態を探求するために当研究室で日常的に使用されている、シンプルで高速なクリアリング方法について説明します。この最適化されたATクリアリング方法は、化学フード、温度制御軌道シェーカー、蛍光顕微鏡を備えた標準的な実験室で簡単に行われます。また、使用する化学化合物は容易に入手可能である。重要なことに、この方法は、様々なマーカーを染色することによって3D AT構造を解決し、アディポ細胞、神経および血管ネットワーク、および先天的および適応的な免疫細胞分布を特異的に視覚化することを可能にする。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肥満は脂肪組織量の増加を特徴とし、肥満の人々が心血管疾患、2型糖尿病、肝臓病およびいくつかの癌を発症するリスクを高めていることを考えると、世界的に主要な公衆衛生問題となっている。

脂肪組織の基本的な生理学的機能は、全身グルコースおよび脂質恒常性11,22を調節することである。この摂食期間中、脂肪細胞(すなわち脂肪組織の主細胞)は、食事によって提供される過剰のグルコースおよび脂質をトリグリセリドに保存する。断食の間、脂肪細胞はトリグリセリドを非エステル化脂肪酸とグリセロールに分解して体のエネルギー需要を維持します。肥満の発症の間、脂肪組織は脂肪細胞のサイズ(肥大症)および/または数(過形成)を増加させることによって拡大し、その貯蔵能力を高める。脂肪組織の拡張がその限界に達すると、患者の間で一定の高い可変性、残りの脂質は筋肉および肝臓3、44を3含む他の代謝器官に蓄積し、その機能障害および肥満関連の心代謝合併症を発症する1,1、5。したがって、脂肪組織の拡張を支配するメカニズムを特定することは、臨床的な課題です。

肥満の間に脂肪組織内で文書化された形態学的修飾は、その病理学的機能不全に関連している。いくつかの染色手順は、アクチン6、血管マーカー7、脂質滴マーカー8、および特異的免疫細胞マーカー9、1010を含む脂肪組織の組織組織を記述するために使用されてきた。9しかし、アディポサイトの直径が大きい(50~200μm)11の11場合、肥満時に観測された劇的な構造AT変化を正確に分析するためには、組織全体の大部分を3次元で分析することが不可欠です。しかし、光が不透明な組織に浸透しないため、蛍光顕微鏡を用いた大組織試料内での3Dでのイメージングは不可能である。透明にする組織のクリアの方法は、文献で報告されています (レビューのために、12を参照してください ) 1 つの組織をクリアし、組織全体の顕微鏡を実施することができます。これらの方法は、健康で病気の組織における3D細胞組織を評価する前例のない機会を提供します。記載された各方法には利点と欠点があり、したがって、研究された組織に応じて慎重に選択する必要があります(レビューのために、13を参照)。実際、いくつかのアプローチは、高価な、有毒であるか、,,,または14、15、16、17、18、19を得14,15,ることが困難である材料または化合物の使用を長い潜伏期間および/または使用する必要があります。16171819ヴェルナー・スポルテホルツが1世紀前に使用した最初の化合物の1つを利用して組織20をクリアし、化学フード、温度制御軌道シェーカー、共焦点顕微鏡を含む標準的な機器を備えた実験室ですべてのマウスおよびヒト脂肪組織貯蔵庫のクリアに非常によく適応したユーザーフレンドリーで安価なプロトコルを設定しました。

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プロトコル

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このプロトコルはテストされ、すべてのマウスおよびヒト白色脂肪組織の貯蔵所について検証される。ヒトおよびマウス脂肪組織は、それに応じて欧州の法律に従って収集され、フランスとスウェーデンの倫理委員会によって承認されました。

1. マウスとヒト白色脂肪組織の固定

  1. 収穫したマウスまたはヒト白色脂肪組織を、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む少なくとも10mLのPBSに15mLのプラスチックチューブに浸漬する。
  2. ローリングプレートの室温でプラスチックチューブを1時間振ります。
  3. プラスチックチューブをローリングプレートの上に4°Cで一晩放置し、固定を完了します。
    注:このプロトコルは、通常の食事を与えられたマウスから得られた全身上端体脂肪パッド(≈250mg - ≈0.6 cm3)などの大規模な脂肪組織サンプルに適合しています。高脂肪食(≈1.5g - ≈4 cm3)またはヒト脂肪組織サンプルを与えられたマウスから得られた上端体脂肪パッドのようなより大きなサンプルについては、クリアプロトコルは完全に(PFAと抗体混合物をスケールアップすることによって)サンプル全体に対して完全に機能するはずですが、一般的に、残りのサンプルを1g(≈2.5cm3)の周りに切断して、追加の染色またはアプリケーションのために残りのサンプルを予約します。PFA(ステップ1.1.)の場合、組織の体積の約10倍を使用することをお勧めします。抗体混合物(ステップ3.1.および3.4.)の場合、組織を完全に浸漬するために体積を増やし、組織が1.5 mLプラスチックマイクロチューブに対して大きすぎる場合は15mLプラスチックチューブ( 材料表を参照)を使用します( 材料表を参照)。

2. マウスとヒト白色脂肪組織の透過と飽和

  1. 固定白色脂肪組織をPBSの10 mLで室温で5分間リンスし、PFAの痕跡をすべて除去します。
  2. 0.3%のグリシン( 材料表を参照)を補ったPBSの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、残りの遊離アルデヒド基を1分あたり100回転(rpm)で軌道シェーカーで室温で1時間振り、残りの遊離アルデヒド基を急いで残します。
  3. 0.2%トリトンX-100( 材料表を参照)を補ったPBS10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、100rpmで2時間の温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを振ります。
  4. 0.2%トリトンX-100と20%DMSO( 材料表を参照)を補ったPBSの10 mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、一晩100rpmで温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを振ります。
  5. 0.1%のTween-20( 材料表を参照)を補ったPBSの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、0.1%トリトンX-100、0.1%デオキシコール酸( 材料表を参照)、20%DMSOで37°Cの温度制御軌道シェーカーでチューブを少なくとも240rpmで振る。
  6. 0.2%トリトンX-100を補うPBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100 rpmで軌道シェーカーで室温でチューブを1時間振ります。
  7. 0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSA( 材料表を参照)を補ったPBSの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、12時間100rpmの温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを12時間、非特異的に結合する可能性のある任意の部位を飽和させる。
    注:ステップ2.7において、BSAは、使用される二次抗体の種の血清によって置換することができる。

3. マウスとヒト白色脂肪組織の染色手順

  1. 0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAおよび一次抗体を補った300μLのPBSを含む1.5mLプラスチックマイクロチューブ内の組織を移管する(凍結染色よりも10倍多く濃縮されたが、抗体ごとに最適な抗体濃度を評価する必要があります)。アルミニウム箔で覆い、温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを少なくとも2日間100rpmで振って、光からチューブを保護します(ステップ1.1とステップ3.7.1のノートを参照)。
  2. 0.2%トリトンX-100、10%DMSOおよび3%BSAを補うPBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、温度制御された軌道シェーカーで37°Cで光から保護されたチューブを100 rpmで5時間振る。この手順を 2 回実行します。
  3. 0.2%トリトンX-100、10%DMSOおよび3%BSAを補うPBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100rpmで100rpmで37°Cで1泊から2日間、光から保護されたチューブを振ります。
  4. 0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAおよび二次抗体(凍結染色よりも10倍濃縮)を補ったPBSの300 μLを含む1.5 mLプラスチックマイクロチューブに組織を移す。アルミニウム箔で覆い、温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを少なくとも2日間100rpmで振って、光からチューブを保護します(ステップ1.1とステップ3.7.1のノートを参照)。
  5. 0.2%トリトンX-100、10%DMSO、および3%BSAを補ったPBSの10 mLを含む15mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100rpmで温度制御軌道シェーカーで37°Cで光から保護し、5時間で37°Cでチューブを振ります。この手順を 2 回実行します。
  6. 0.2%トリトンX-100、10%DMSO、および3%BSAを補ったPBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100rpmで100rpmで37°Cで光から保護されたチューブを1泊から2日間振ります。
  7. PBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100rpmで温度制御軌道シェーカーで37°Cで2時間、光から保護されたチューブを振ります。
    注:核やアクチンなどの特定の構造の標識については、4′、6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPIまたは同等物)および/または蛍光標識ファロイジンをステップ3.1に追加する必要があります。蛍光標識された一次抗体のみが使用される場合、またはステップ3.4で使用する。二次抗体が使用される場合。
    注:染色手順では、既にフルオロクロムと結合した一次抗体(フローサイトメトリーに使用されるものなど)を使用することができ、時間と特異性を得るためにお勧めします。実際、マウス一次抗体を使用し、その後に二次抗マウス抗体を使用できたとしても、ここで実証したように、循環免疫グロブリンによる血管の非特異的染色を観察することが多い。したがって、この問題を回避するために、既に標識されている一次抗体が強く推奨され、ここではフローサイトメトリーで使用される抗体が我々の手順と互換性があることを示す証拠を提供します。しかし、低レベルで発現される抗原の特定の場合には、二次抗体を介したシグナル増幅ステップが必須である。唯一の利用可能な一次抗体がマウスで作られると、犠牲で少なくとも5分間PBSを有するマウスの心臓灌流は、循環免疫グロブリンの大部分を除去することができ、したがって非特異的染色を行うことができる。

4. マウスとヒト白色脂肪組織のクリア手順

  1. 50%エタノールの10 mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、2時間100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。
  2. 70%エタノールの10 mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、2時間100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。
  3. 95%エタノールの10 mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、2時間100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。
  4. 100%エタノールの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、2時間100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。
  5. 100%エタノールの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、一晩100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。
  6. 5 mLのメチルサリチル酸を含むプラスチックキャップ( 材料表を参照)を化学フードの下に20 mLガラス瓶に浸し、光から保護されたガラス容器を100rpmの軌道シェーカーで室温で少なくとも2時間振ります。
    注: 手順 4.3 を回避することで、クリア処理手順を(必要に応じて)大幅に高速化できます。4.5.と、最終的なクリア品質はわずかに低下しますが。

クリアホワイト脂肪組織の5.3D共焦点イメージング

  1. 化学フードの下にガラス底( 材料表を参照)を装備した金属画像チャンバーに組織を移し、新鮮なメチルサリチル酸でチャンバーを満たします。
    注:所定の位置に組織を固定し、したがって、チャンバー内に浮いたり、横に動かないようにするために、チャンバーに取り付けるときに、複数の18ミリメートルの丸いガラスカバーリップ( 材料表を参照)を適用します。
  2. 反転した共焦点顕微鏡の上に撮像チャンバーを置きます。
  3. 低倍率の目的(例えば、4倍の目的)を用いて組織を画像化し、脂肪組織全体またはヒト組織サンプルの数cm33D マップを生成する。
  4. 高い倍率で組織サンプリング用の領域を複数選択します。通常、解像度と深さの間に良好な比率を提供する 20 倍の長距離エアの目的を使用します。深さ600~2000μmのzスタックを持つ大型モザイク画像を取得します。
    注: 遠距離の目的を使用して、組織の奥深くに画像を表示します。

3D脂肪組織画像からの定量的結果の抽出

注:異なる構造のセグメンテーションと、ポイント5で生成された3D画像スタックからの定量的情報の抽出は、市販またはフリーウェアのいずれかの既存の画像解析ソフトウェアオプションのいずれかを使用して実行できます。以下の点では、当社の研究室で、商用ソフトウェアを用いて3D脂肪組織画像から定量的情報を抽出するために日常的に使用されている戦略を説明します( 材料表を参照)。

  1. 3D スタックをソフトウェア形式に変換して、メモリ空間を解放します。
  2. セルをセグメント化します。
    1. ソフトウェアの Cell モジュールを開きます。
    2. 細胞検出の設定を、プラズマ膜染色に変更します。
    3. 細胞周辺(マクロファージのF4/80、T細胞のTCR-β、または免疫細胞サブタイプに特異的な分化CDタンパク質のクラスターのような皮質アクチンまたは血漿膜マーカーを標識するファロイジン)を線引するのに使用されるマーカーの蛍光チャネルを選択します。
    4. しきい値を設定し、予想されるセルサイズの範囲を提供します(すなわち、セル検出のための1〜200 μm)。
    5. セグメンテーションを実行します。z スタックに対応するボリュームは、隣接するセルごとに異なる色で色分けされたセグメント化されたセルで生成されます。
    6. 統計タブに統計フィルター(サイズ、丸み、円形など)を適用して、セグメンテーションアーティファクトを除外したり、セグメント化された細胞をそのサイズに基づいて対象細胞に絞り込んだりします(例えば、有数葉細胞の場合は20〜200μm、マクロファージの場合は5〜25μm、リンパ球の場合は1〜3μm)。
    7. 統計タブから測定値と定量データ(体積、数、サイズ、直径など)を抽出します。
  3. 細胞成分(核、小胞など)または血管を構造としてセグメント化します。
    注:フィラメントのセグメンテーションは、船舶の接続性を調べるのに非常に便利ですが、表面モジュールのセグメンテーションを使用して、血管のサイズ、体積、直径に関するデータを抽出します。実際、フィラメントモジュールを使用すると、血管のサイズの定量化が失われます。
    1. ソフトウェアの サーフェス モジュールを開きます。
    2. 細胞下の成分を3Dで再構成するために、細胞内成分に特異的に標識するために使用されるマーカーの蛍光チャネルを選択します。
    3. しきい値を設定し、構造物の予想直径サイズの範囲を提供します(すなわち、核の場合は0.5〜5 μm、血管の場合は0〜100μmなど)。
    4. セグメンテーションを実行します。セグメント化されたセルラー構造を持つボリュームが生成されます。測定値と定量データ(体積、数、サイズ、直径など)は、統計タブから抽出することができます。
  4. 管状の連続体として血管をセグメント化します。
    注:フィラメントのセグメンテーションは、船舶の接続性を調べるのに非常に便利ですが、表面モジュールのセグメンテーションを使用して、血管のサイズ、体積、直径に関するデータを抽出します。実際、フィラメントモジュールを使用すると、血管のサイズの定量化が失われます。
    1. ソフトウェアの フィラメント モジュールを開きます。
    2. 容器染色に対応する蛍光チャネルを選択します。
    3. 蛍光強度のしきい値を設定し、予想される接続ノードの適切な数を選択します。
    4. セグメンテーションを実行します。容器ネットワークを表すフィラメントは3Dで生成されます。測定は統計タブから抽出することができ、容器の長さ、船舶の分岐の数などを含む定量的なデータを得ることができます。

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結果

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図1に示したここで説明した手順を用いて、それぞれ図2Aおよび図2Bに示すように、ヒトおよびマウス白色脂肪組織をそれぞれ染色し、光学的に透明化することができた。クリアされた組織を金属イメージングチャンバに移し、共焦点イメージングを行った(図3A)。クリアによって、取得できた組織画像の深さが大幅に改善されました(図3Bおよび図3C)。脂肪組織全体は、4倍の目的を使用して低倍率で3Dで獲得することができ(補足ムービー1を参照)、3Dマップを生成し、20倍の目的を使用して高倍率で獲得する異なる領域を選択することを可能にする(図3D)。高倍率画像は、深さ2mmの3Dで取得されます(

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ディスカッション

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肥満などの病理学的進行の過程で脂肪組織内で起こる修飾は、病理学の背後にあるメカニズムの理解の基本である。脂肪組織におけるこのようなメカニズムを明らかにした先駆的な研究は、全体の脂肪組織プロテオミクス21、フローサイトメトリー22、23、および転写23体2224、25などの世界的なアプローチに24,25基づいている。さらに、組織学的分析26、27、28、29,27,28を用いて脂肪組織で起こる構造変化を29探る努力がなされている。しかし、5-10 μm脂肪組織切片の分析は、セクションのサイズが限られているた...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示する矛盾を持っていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、INSERMによってサポートされました。 コート・ダジュール大学、そして将来のラベックス・シグナライフへの投資を通じたフランス国立研究庁(ANR)からの助成金(ANR-11-LABX-0028-01)、プログラムUCA JEDI(ANR-15-IDEX-01)、アカデミー2「システムズコンプレックス」とアカデミー4「コンプレックス・エ・ダイバート」を通じて フォンダシオンは、ラ・レシェルシュ・メディカル(エキペFRM DEQ20180839587)とJ.G.(ANR18-CE14-0035-01-ギレロン)に若い調査官プログラムを注ぎます。また、コンセシル・デ・アルプ・マリティームとレジオンPACAが出資するC3Mのイメージングコア施設に感謝し、IBISA顕微鏡・イメージングプラットフォームコートダジュール(MICA)も支援しています。マリオン・デュソットの組織準備に関する技術的な助けに感謝します。私たちは、原稿の証拠読み取りのためにアビー・カットトリス、UCA国際科学可視性に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mLマイクロチューブEppendorff チューブ - Dutscher33528
15 mL プラスチックチューブFalcon チューブ - Dutscher352096
18 mm 丸型ガラスカバースリップMariendfeld0117580
20 mL ガラスボトルWheaton986546
抗マウス-alexa647-標識抗体Jackson ImmunoResearch715-605-150希釈率:1/100
抗ウサギ-alexa647標識抗体Jackson ImmunoResearch711-605-152希釈率:1/100
BSASigma-aldrichA6003
CD301-PE抗体バイオレジェンドBLE145703希釈率:1/100
CD31AbCamab215912希釈率:1/50
市販の3D解析ソフトウェア - IMARISOxford instrumentセルモジュール付
共焦点顕微鏡 - Nikon A1RNikon
DapiThermoFisherD1306ストック濃度: 5 mg/mL; 希釈 1/1000
デオキシコール酸Sigma-aldrichD6750
DMSOSigma-aldrichD8418
Glut4 抗体Santa Cruzsc-53566希釈: 1/50
GlycineSigma-aldrichG7126
Lectin-DyLight649Vector LabDL-1178-1ストック濃度 : 2 & micro;g/µL;IVインジェクション:50µL/マウス
ガラス底部を備えた金属イメージングチャンバー - AttoFluorサーモフィッシャーA7816
サリチル酸メチルSigma-aldrichM6752
ペリリピン抗体プロジェン651156希釈率:1/50
ファロイジン-アレクサ488サーモフィッシャーA12379希釈率:1/100
TCR-&β;-PB抗体BiolegendBLE109225希釈率:1/100
TH 抗体AbCamab112希釈:1/50
Triton X100Sigma-aldrichX100
Tween-20Sigma-aldrichP416
抗体 チャンバー

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
  2. Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
  3. Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
  4. Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
  5. Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375(2015).
  6. Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
  7. Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
  8. Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592(2018).
  9. Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
  10. Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
  11. Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
  12. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271(2018).
  15. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225(2016).
  16. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274(2016).
  17. Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553(2017).
  18. Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22(2014).
  19. Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368(2019).
  20. Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
  21. Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
  22. Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
  23. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
  24. Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
  25. Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250(2017).
  26. Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 1049-1052 (2005).
  27. Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
  28. Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
  29. Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
  30. Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266(2019).
  31. Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471(2016).

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