生体内の微小内視鏡的カルシウムイメージングは、動物の行動を自由に行う神経活動をリアルタイムで監視できる貴重なツールです。しかし、扁桃体にこの技術を適用することは困難であった。このプロトコルは、マウスの顕微鏡を小型化した扁桃体細胞を標的にするための有用なガイドラインを提供することを目的としています。
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この記事について
サマリー
要約
自由に動く動物の神経活動のリアルタイムモニタリングは、神経活動を行動に結びつける重要なアプローチの1つです。このため、遺伝子組み換えカルシウム指標(GEC)、蛍光顕微鏡の微細化、および勾配屈折率(GRIN)レンズを用いてニューロンのカルシウム過渡症を検出するinvivoイメージング技術が開発され、多くの脳構造1、2、3、4、5、6に応用することに成功しました。このイメージング技術は、遺伝的に定義された細胞集団の長期にわたる数週間の慢性同時イメージングを可能にするため、特に強力です。有用であるが、このイメージング技術は、扁桃体、感情処理および連想恐怖記憶7に不可欠な脳構造である扁桃体などの脳内の深部に位置する脳構造に容易に適用されていない。扁桃体にイメージング技術を適用することが困難になるいくつかの要因があります。例えば、運動アーチファクトは、通常、脳の深部に移植されたヘッドマウント顕微鏡が比較的不安定であるため、より深い脳領域で行われるイメージング中により頻繁に発生する。もう一つの問題は、横心室が埋め込まれたGRINレンズの近くに位置し、呼吸中のその動きが、容易に矯正できない非常に不規則な運動アーチファクトを引き起こし、安定したイメージングビューを形成することが困難になることです。さらに、扁桃体の細胞は通常安静状態または麻酔状態で静かであるため、後のイメージングのための基固め手順の間に扁桃体中のGECIを発現する標的細胞を見つけて焦点を合わせるのは難しい。このプロトコルは、扁桃体でGECIを発現する細胞を頭部小型化顕微鏡で効率的に標的化し、このようなより深い脳領域で生体内カルシウムイメージングを成功させる方法に関する有用なガイドラインを提供する。このプロトコルは特定のシステム(例えば、Inscopix)に基づいているが、それに限定されないことに留意された。
概要
カルシウムはユビキタスな第二のメッセンジャーであり、ほぼすべての細胞機能8において重要な役割を果たしている。ニューロンにおいて、作用電位焼成およびシナプス入力は、細胞内遊離の急速な変化を引き起こす [Ca2+]9,10.したがって、カルシウム過渡性を追跡することは、神経活動を監視する機会を提供する。GEC は、定義された細胞集団および細胞内区画11,12で [Ca2+] を監視できる強力なツールです。タンパク質ベースのカルシウム指標の多くの異なるタイプの中で、GCaMPは、単一のGFP分子13に基づくCa2+プローブで、最も最適化され、広く使用されているGECIです。複数のエンジニアリングを通じて、GCaMPの多くのバリエーションが12、14、15、16で開発されました。我々は、このプロ....
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プロトコル
すべての手続きは、韓国科学技術院の動物倫理委員会によって承認されました。すべての実験は、制度的動物の世話と使用委員会のガイドラインに従って行われました。
注:このプロトコルは、ウイルス注入手術、GRINレンズインプラント手術、GRINレンズ注入の検証、ベースプレートアタッチメント、行動テスト中のGCaMP信号の光学記録、およびデータ処理の6つの主要なステップで構成されています(図1A)。手術以外は市販のソフトウェアパッケージ(Inscopix)を使用しています。
1. 立体的手術 – AAV ウイルス注射
注意:この外科処置で使用されるマウスの緊張はC57BL6/Jである。動物の体は手術中に無菌ドレープで覆われており、プロトコルのすべてのステップは無菌手袋を着用して行われます。複数の手術は通常、同じ日に行われません。しかし、複数のマウスが同じ日に同じ手術を受ける必要がある場合は、マウスごとにオートクレーブされた外科用具の別々のセットを使用し、70%エタノールを使用してマウス間の手術器具を消毒する。外科的処置の間にマウスを暖かく保つために、マウスは立体的フレームに固定された後にカスタムメイドの外科用毛布で覆われる。
- 必要なすべての手術用具を70%エタノール....
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結果
GRINレンズ注入の検証
セメンテーションによってベースプレートを脳に慢性的に取り付ける前に、GRINレンズの注入を検証する必要があります。レンズの移植に成功した動物では、GCaMP発現細胞と血管の両方が、顕微鏡の対物レンズと埋め込まれたGRINレンズとの距離によって決定される焦点面範囲内で明確に観察された(図2AおよびB)。対照的に、オフターゲット移植を有する動物では、GCaMP発現細胞の鮮明な画像は、焦点外または視野外の範囲内で観察されなかった。焦点が合っていない場合、焦点が合った血管は観察できたが、焦点面範囲内の細胞に対してぼやけた画像しか観察できなかった(図2CおよびD)。視界外の場合、ほとんどの場合血管は観察されず、焦点面範囲内で蛍光シグナルは検出されなかった(図2E)。また、他の場合とは異なり、埋め込まれ.......
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ディスカッション
ここで述べたような扁桃体のような深部脳領域における頭部取付小型顕微鏡による生体内光学的カルシウムイメージングの成功を達成するためには、巧みな手術技術が不可欠である。したがって、このプロトコルは、ベースプレートアタッチメントとGRINレンズの移植の最適化された外科プロセスのためのガイドラインを提供しますが、重要なステップのために追加の最適化プロセスが必要な場合があります。プロトコルセクションで述べたように、手術における扁桃体座標、ベースプレート接続ステップにおける気流速度、画像取得設定(フレームレート、LEDパワーなど)をカルシウム記録及び変数(ICA時間重量、イベント最小減衰時間など)で最適化する必要がある。
ベースプレートのアタッチステップは変更できます。ヘッドプレートは、モバイルホームケージで行われたベースプレートアタッチメント中に目を覚ますマウスの頭部を固定するのに役立つため、必要です。しかし、移動式家庭用ケージが実験室で準備されていない場合、イソフルランガス麻酔システムは代替オプションです。この代替方法では、イソフルランガスの濃度が重要で.......
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開示事項
著者は開示するものが何もない
謝辞
この研究は、サムスン科学技術財団(プロジェクト番号SSTF-BA1801-10)からの助成金によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 26Gニードル | BD | 302002 | 手術 |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | |
| AAV2 / 1-CaMKiiα-GFP | カスタムメイド | 手術 | |
| アクリル歯科用セメント(オルソジェットアクリルピンク) | Lang | 1334-ピンク | 手術&ベースプレートアタッチメント |
| エアフローマニピュレーター | ニューロター | NTR000253-04 | ベースプレートアタッチメント |
| アモキシシリン | SIGMA | A8523-5G | 手術 |
| 用ベースプレート | INSCOPIX | 1050-002192 | ベースプレートアタッチメント |
| ベースプレートカバー | INSCOPIX | 1050-002193 | ベースプレートアタッチメント |
| 行動装置(チャンバー) | Coulbournインスツルメント | テストケージ | ビヘイ |
| テスト ビヘイビア機器(ソフトウェア) | コールボーン インストゥルメント | フリーズフレーム | ビヘイビアテスト |
| カーボンケージ | ニューロター | 180mm×70mm | ベースプレート アタッチメント |
| カルプロフェン | SIGMA | PHR1452-1G | 手術 |
| データ処理ソフト | INSCOPIX | データ処理ソフト | ベースプレートアタッチメント&行動試験 |
| デキサメタゾン | SIGMA | D1756-500MG | 手術 |
| 用ドリル | セヤン | マラソン-4 | 手術 |
| 用ドリルバー | ELA | US1/2, Shank104 | |
| 手術用ガラス針 | WPI | PG10165-4 | 手術 |
| 用 GRINレンズ (INSCOPIX Proview レンズプローブ) | INSCOPIX | 1050-002208 | 手術 |
| 用ハミルトンシリンジ | ハミルトン | 84875 | 手術 |
| ヘッドプレート | 神経腫瘍 | モデル5 | 手術 |
| 六角レンチ | INSCOPIX1050-004195 | ベースプレートアタッチメント | |
| ラップトップコンピュータ | サムスン | NT950XBV | 手術&ベースプレートアタッチメント |
| レンズホルダー、脳定位固定装置ロッド(INSCOPIX proviewインプラントキット) | INSCOPIX | 1050-004223 | 手術 |
| 顕微鏡グリッパー | INSCOPIX | 1050-002199 | ベースプレートアタッチメント |
| 顕微鏡、DAQソフトウェア、ハードウェア | INSCOPIX | nVista 3.0 | ベースプレートアタッチメント &行動テスト |
| モバイルホームケージ | Neurotar | MHC V5 | ベースプレートアタッチメント |
| Moterized arm | Neurostar | カスタマイズ | 手術 |
| Moterized アームソフトウェア | Neurostar | カスタマイズ | 手術 |
| NIボード | 国立楽器 | 行動テスト | |
| 取り外し可能なエポキシボンド | WPI | Kwik-Cast | 手術 |
| レジンセメント(スーパーボンド) | サンメディカル | スーパーボンド C&B | 手術 |
| 頭蓋骨ねじ | ストールティング | 51457 | 手術 |
| 脳定位固定装置用電極ホルダー | ASI | EH-600 | 手術 |
| 脳定位固定装置フレーム | ストールティング | 51600 | 手術 |
| 脳定位固定装置マニピュレーター | ストールティング | 51600 | ベースプレートアタッチメント |
参考文献
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocamp....
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