ニューロンへの多様なシナプス入力の統合は、自然なタイミングと回路の可塑性のためにすべてのシナプス前核を保存する準備で最もよく測定されますが、脳スライスは通常、多くの接続を切断します。インビボ回路活性を模倣しながら、インビトロ実験能力を維持する修飾脳スライスを開発しました。
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この記事について
サマリー
要約
インビトロスライスの電気生理学の技術は精密な電気および時間的決断の単細胞活動を測定する。脳スライスは、パッチクランプやイメージングのためにニューロンを適切に視覚化してアクセスするために比較的薄くする必要があり、脳回路のインビトロ検査は急性スライスに物理的に存在するものだけに限定されます。シナプス前核の大部分を維持しながらインビトロスライス実験の利点を維持するために、我々は新しいスライス調製物を開発した。この「ウェッジスライス」は、脳幹の内側オリボコクレア(MOC)ニューロンへの多様なモノラル、音駆動入力を特徴付けるために、パッチクランプ電気生理学の録音用に設計されました。これらのニューロンは、対側耳および対応する人工内核(CN)における刺激によって活性化されたニューロンから、その主要な刺激性および抑制性入力を受ける。非対称の脳スライスは、1つの半球の横端にあるロストロ・カウダル領域で最も厚く、反対側の半球の横端に向かって薄く設計されました。このスライスには、厚い側に、聴覚神経根が脳に聴覚刺激に関する情報を伝え、本質的なCN回路、および逆MOCニューロンに収束する不活性化および三シナプス阻害性の両方の経路が含まれている。記録は、スライスの薄い側のMOCニューロンから行われ、一般的なパッチクランプ実験のためにDIC光学を使用して視覚化されます。聴神経の直接刺激は、聴神経の脳幹に入る時に行われ、MOCニューロンのシナプス上流で本質的なCN回路活性およびシナプス可塑性が起こることを可能にする。この技術により、in vivo回路の活性化をスライス内で可能な限り近づけることができます。このウェッジスライス調製物は、インビトロスライス生理学の技術的利点と組み合わせて、回路分析が上流接続性と長距離入力の保存の恩恵を受ける他の脳回路に適用可能です。
概要
神経回路の活動の観察は、理想的には、生体内の脳領域間のネイティブ感覚入力とフィードバック、および無傷の接続性で行われます。しかし、神経回路の単一細胞分解能を与える実験を行うことは、無傷の脳における技術的な課題によって依然として制限されている。生体内の細胞外電気生理学または多光子イメージング法は、インタクト神経系の活動を調査するために使用できますが、異なる入力がどのように統合されるかの解釈や閾値以下のシナプス入力の測定は困難なままです。インビボ全細胞記録はこれらの制限を克服するが、容易にアクセスされる脳領域でさえ、実行することは困難である。単一細胞分解能実験の技術的課題は、脳の深部に位置する特定のニューロン集団、または生体内の細胞を見つけるために遺伝的ツールを必要とする空間的に拡散集団(例えば、オプトロード記録と組み合わせたチャネロドプシンの遺伝的発現)または標識を記録した後のポストホックの細胞化学的同定(例えば神経伝達特異的マーカーを有する)でさらに増幅される。脳幹の腹側表面の近くに拡散して位置している内側オリボコクリア(MOC)ニューロンは、上記の制限1に苦しんで、生体内実験のためにアクセスすることは非常に困難です。
脳のスライス(約100〜500μmの厚さ)は、同じスライス
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プロトコル
すべての実験手順は、国立神経疾患研究所と脳卒中/国立難聴およびその他のコミュニケーション障害研究所動物のケアと使用委員会によって承認されました。
1. 実験準備
注:スライス液、スライス温度、スライスインキュベーション温度、装置(など)を含むスライス調製物に関する詳細は、本実験で行う脳幹製剤に特有のものです。スライスインキュベーションの詳細は、実験室での経験ごとに変更することができます。
- パッチクランプ用の内部ソリューションを準備します。
- (mM)76 Cs-メタンスルホン酸、56 Cs-メタンスルホン酸、56 CsCl、1 MgCl2、1CaCl2、10HEPES、10 EGTA、0.3 Na-GTP、2 Mg-ATP、5 Na2-ホスホクレアチン、5 QX-314、および0.01アレクサフルオール-48ヒドラズを含む準備用クランプ溶液。CsOH で pH を 7.2 に調整します。
- (mM)125 K-グルコン酸塩、5 KCl、1 MgCl 2、0.1 CaCl2、10HEPES、1 EGTA、0.3 Na-GTP、2 Mg-ATP、1 Na2-ホスホクレアチン、および0.01アレクサフッ素-4888ヒドラズ化を含む電流クランプ溶液を準備します。
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結果
ウェッジスライスの組織学的検査
聴覚脳幹ニューロン機能の調査のために、ウェッジスライス製剤は、記録対象のMOCニューロンに対する聴覚神経根およびCN反局面を含むように設計された(図1Bに示すスライスの例)。最初の組織学的検査は、スライスが回路活性化に必要な核を含み、軸索突起がそのままであることを確認するために重要である。CN内の2つの細胞タイプは、MOCニューロンに音情報を提供する。T-ステレート細胞は、MOCニューロン39、40、41、58に興奮性入力を提供するために仮説を立てる。球状ふさふさした細胞(GBC)は、逆半球のMNTBニューロンを励起する(保持シナプスの特殊なcalyxを介して)34、36、37、38、59、60であり、MOCニューロン.......
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ディスカッション
ここで説明するスライス手順は、ウェッジスライスと呼ばれ、無傷のシナプス前神経回路を維持するために強力であるが、神経機能の分析のための脳スライス実験のアクセシビリティを有する。回路解析の準備の有用性を最大限に高めるためには、いくつかの初期ステップで細心の注意を払う必要があります。ウェッジの寸法は、シナプス前核とその軸索突起の両方が準備されたウェッジスライス内に含まれていることを確認するために不可欠である組織学的検査を使用して確認する必要があります。投影が切断された場合や、ターゲット核に到達する軸索の数が少ない場合、スライスジオメトリは修正を必要とする場合があります。より一般的には、ウェッジスライスのビブラートメの仕上げカットは非常に重要です。最適なウェッジスライスの準備は、既知の脳のランドマークに基づく設定の調整と共に、ステージベース上の同心円マーキングの使用を含むビブラートーム構成の一貫した使用の組み合わせを必要とします。スライス幾何学の最適化後、18個のウェッジスライスのうち8個で聴覚神経根を電気的に刺激することによって誘発されるMOCニューロンの一貫したPSCを記録した。これまでの研究では、MOCニューロン
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、NIHの壁内研究プログラム、NIDCD、Z01 DC00091(CJCW)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Experimental Preparations | |||
| Agar, powder | フィッシャーサイエンティフィ | BP1423500 | ビブラトーム切片化中に脳組織を安定させるために使用される4%寒天ブロック |
| AlexaFluor Hydrazide 488 | Invitrogen | A10436 | MOCニューロンパッチの成功を確認するために内部溶液中で使用されたフルオロフォア |
| Analytical Balance | Genesesサイエンティフィック(Intramalls) | AV114 | 計量化学薬品 |
| 両刃カミソリ刃 | テッドペラ | 121-6 | ビブレータカッティングブレード |
| キヌレン酸(5g) | シグマアルドリッチ | K3375-5G | スライス ACSF添加剤 解剖およびスライス中のニューロン活動を減らすために使用され、パッチクランプのための組織の健康を改善します |
| pHメーター | ッシャーサイエンティフィック(イントラマルス) | 13-620-451 | 溶液pHテスター |
| トリ皿100mm径X 20mm | フィッシャーサイエンティフィック(イントラモール) | 12-556-002 | 4%寒天準備 |
| 攪拌ホットプレート | フィッシャーサイエンティフィック(イントラモールズ) | 11-500-150 | 4%寒天調製 |
| <強>解剖およびスライス | |||
| バイオシチン | シグマのための加熱Aldrich | B4261-250MG | 軸索トレースに使用される薬品(ストレプトアビジン488に結合) |
| 解剖顕微鏡 | Amscope | SM-1BN | 脳除去中の精密解剖用 |
| デュモン #5 鉗子 | ファインサイエンスツール | 11252-20 | ファイン鉗子解剖ツール |
| エコノミーピンセット #3 | WPI | 501976 | 鉗子解剖ツール |
| ガラス ペトリ皿 150mmdia x 15mm H | Fisher Scientific (Intramalls) | 08-747E | 解剖皿 |
| インターフェースペーパー (203 X 254mm PCTE 膜 10um) | Thomas Scientific | 1220823 | スライスインキュベーション/バイオシチンアプリケーション |
| ライカ VT1200S ビブラトーム | ライカ | 1491200S001 | ウェッジスライスセクショニング用バイブローム |
| メイヨーハサミ | Roboz | RS-6872 | 解剖ツール |
| 片刃炭素鋼ブレード | フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls) | 12-640 | 解剖用カミソリ刃 |
| 試料ディスク、ライ | カ | 14048142068 | 可能な傾斜のための専用ビブラトームステージ |
| Spoonula | FisherSci | 14-375-10 | 解剖ツール |
| スーパーグルー | Newegg | 15187 | ビブラトームステージ |
| に組織を接着するために使用されるVannasの春はさみ | のファインサイエンスツール | 91500-09 | 解剖ツール |
| 電気生理学 | |||
| A1R 直立共焦点顕微鏡 | ニコンインスツルメンツ | 電気生理学およびイメージング顕微鏡は、電気生理学 | |
| と互換性のある任意の顕微鏡にすることができます電極ホウケイ酸ガラス、フィラメント外径1.5mm、内径1.1mm、長さ10cm | サッターインストゥルメント | BF150-110-10 | クランプピペットガラス |
| 電極フィラーMicroFil | WPI | CMF20G | パッチ電極ピペットフィラー |
| インラインソリューションヒーター | ワーナーインスツルメンツ(GSAdvantage) | SH-27B | スライス灌流システムヒーター |
| マルチマイクロマニピュレーターシステム | サッターインストゥルメント | MPC-200 MP285 | パッチクランプ・刺激電極配置用マイクロマニピュレーター |
| P-1000 ガラスマイクロピペット用横型ピペットプーラー | サッターインスツルメンツ | FG-P1000 | パッチクランプピペッタープーラー |
| パッチクランプアンプ&ソフトウェア | HEKA | EPC-10 / Patchmaster Next | 任意のアンプ・ソフトウェアが可能 |
| レコーディングチャンバー | ワーナーインストゥルメンツ | RC26G | 録音中のスライス「バス」 |
| レコーディングチャンバー ハープ | ワーナーインスツルメンツ | 640253 | 電気生理学録音中にスライスを安定させます |
| スライスインキュベーションチャンバー | カスタムビルド | スライス後の回復中のスライス用の加熱された酸素化された保持チャンバー | |
| 刺激隔離ユニット | A.M.P.I. | 電気生理学のための | Iso-Flex |
| シリンジ 60CC | フィッシャー・サイエンティフィック (Intramalls) | 14-820-11 | 電気生理学灌流流体処理 |
| 温度調節器 | ワーナー・インスツルメンツ (GSAdvantage) | TC-324C | スライス灌流システム 温度調節器 |
| チューブ 1/8 OD 1/16 ID | フィッシャー・サイエンティフィック (絶縁体) | 14-171-129 | 電気生理学灌流流体ハンドリング |
| タグステン同心円バイポーラマイクロ電極 | WPI | TM33CCINS | 電気生理学 |
| Histology | |||
| 24ウェルプレート フィ | ッシャーサイエンティフィック (Intramalls) | 12-556006 | 組織学スライス収集と免疫染色 |
| Alexa Fluor 488 Streptavidin | Jackson Immuno labs | 016-540-084 | バイオシチン可視化のための二次抗体 |
| Corning Orbital Shaker | Sigma | CLS6780FP | 免疫組織化学攪拌用シェーカー |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich (Intramalls) | C5042-10G | 組織学用細胞染色 |
| 使い捨てミクロトームブレード | Fisher Scientific | 22-210-052 | スライド式ミクロトームブレード |
| フィルターシリンジ Nalgene 4mm 酢酸セルロース 0.2um | フィッシャーサイエンティフィック (Intramalls) | 09-740-34A | 記録ピペットに内部溶液を充填するためのシリンジフィルター |
| フルオロマウント-G スライド取り付け媒体 | フィッシャーサイエンティフィック | OB100-01 | 免疫組織化学蛍光取り付け 中 |
| ラック付きガラススライド染色皿 | フィッシャーサイエンティフィック (Intramalls) | 08-812 | Cresyl Violet染色室 |
| Microm HM450 スライド式ミクロトーム | ThermoFisher | 910020 | 組織学用凍結ミクロトーム |
| 顕微鏡カバー ガラス 長方形 50mm X 24mm | フィッシャーサイエンティフィック社製 (Intramalls) | 12-543D | 組織化学スライドカバーガラス |
| パーマウント 封入剤 | フィッシャーサイエンティフィック | SP15-100 | クレシルバイオレット切片 取付中 |
| スーパーフロスト スライド | フィッシャー サイエンティフィ | 22-034980 | 組織学スライド |
参考文献
- Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
- Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior ....
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