ウシ卵巣皮質のインビトロ培養と卵巣微小環境に対する栄養ステアステップ食の効果が提示される。卵巣皮質片を7日間培養し、ステロイド、サイトカイン、および卵胞ステージを評価した。ステアステップダイエット治療は、培養中の卵胞の進行をもたらすステロイド発生を増加させました.
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この記事について
サマリー
要約
原始から角質段階までの卵胞の発達は、体細胞および積雲細胞卵母細胞コミュニケーションからの内分泌およびパラクリン因子を含む卵巣皮質内の動的プロセスである。卵巣微小環境についてはほとんど知られていないし、周囲のミリューで産生されるサイトカインとステロイドが卵胞の進行または逮捕に影響を与える方法.卵巣皮質のインビトロ培養は、隣接する間質によって支えられているままの正常化された環境で卵胞を発達させることができます。我々の目的は、牛の卵巣皮質のインビトロ培養を通じて、卵巣微小環境(卵胞の発達、ステロイド、およびサイトカイン産生)に対する栄養ステアステップ食の効果を決定することであった。これを達成するために、卵巣皮質片は、思春期前に2つの異なる栄養開発スキームを受けているハイファーから取り除かれました:コントロール(伝統的な栄養開発)と階段ステップ(開発中の給餌と制限)は約0.5〜1mm3 個に切断されました。これらの部分は、その後、一連のウォッシュを通過し、ウェイマスの培養培地を含む井戸に設定された組織培養インサートに配置された。卵巣皮質は、毎日の培養培地交換で7日間培養した。組織学的切除は、追加の治療なしに栄養と文化の影響を決定するために、培養前後の卵胞ステージの変化を決定するために行われました。ステロイドを測定するために皮質培養培地を数日間プール, ステロイド代謝物, サイトカイン.ステアステップ対コントロール卵巣皮質培養で卵胞の進行を可能にする卵巣微小環境でステロイドホルモンの増加の傾向があった.卵巣皮質培養技術は、卵巣微小環境のより良い理解を可能にし、内分泌の変化が生体内およびインビボ治療の両方からの卵胞の進行および成長にどのような影響を与えるかを可能にする。この培養法は、不妊治療を促進するために女性の卵胞の進行を改善する可能性のある潜在的な治療薬をテストするために有益であることが証明されるかもしれません.
概要
卵巣皮質は、卵胞の発生が起こる卵巣の外層を表す1。初期卵胞は、最初に開発中に逮捕され、パラクリンおよびゴナドトロピン入力1、2、3、4に基づいて、一次、二次、および第三次卵胞になるために活性化される。卵巣内の生理学的プロセスをよりよく理解するために、組織培養をインビトロモデルとして使用することができ、それによって制御された環境が実験を行うことを可能にする。多くの研究は、生殖補助技術、生殖能力の保存、および卵巣癌5、6、7の研究のために卵巣組織培養を利用している。卵巣組織培養は、卵巣の健康にダメージを与える生殖毒素を調査するためのモデルとしても役立っており、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)8、9、10、11などの生殖障害の病因と卵巣の健康に損傷を与える。<....
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プロトコル
卵巣は米国肉動物研究センター16から得られた。16以前に述べたように、すべての手順は、農業研究と教育における農業動物のケアと使用のためのガイドに従って、米国肉動物研究センター(USMARC)動物のケアと使用委員会によって承認されました。卵巣はネブラスカ大学リンカーン生殖研究所に持ち込まれ、そこで処理され、培養されました。
1. 必要なメディアの準備
-
ウェイマス MB 752/1 メディア
- 1 L組織培養ボトルに900mLの滅菌水を充填します。水がかき混ぜる間、徐々に粉状の媒体を加えます。粉末化した培地が溶解したら、2.24gの重炭酸ナトリウムに続いて1.25gのウシ血清アルブミン(BSA)を加える。pHメーターを使用し、pHを7.25-7.35に調整します。滅菌水を追加して最終体積を1 Lにします。
- 生物学的安全キャビネットに移動し、ペニシリンストレプトマイシン硫酸塩を培地の0.1%v/vの濃度で添加します。0.22 μmの細孔33.2 cm2 500 mLボトルトップフィルターで媒体をフィルターします。
- ろ過した媒体を複数の50 mL円錐形チューブに注ぎます。アリクォート培地の50mLあたり0.5 mLのインスリントランスフェリンセレンを加....
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結果
この牛皮質培養法は、卵巣の小片から多種多様なホルモン、サイトカイン、および組織学データを決定するために使用することができる。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)のような染色は、卵胞のステージング16、23、31を通して卵巣形態を決定するために使用することができる(図3)。簡単に言えば、卵胞は、扁平上皮前顆粒球細胞の単層に囲まれた卵母細胞である原始子に分類された(0);過渡卵性卵胞または初期の初代は、主に扁平上皮前顆粒球細胞といくつかの立方腺顆粒球細胞に囲まれた卵母細胞である(1);1-1.5層の立方体顆粒球(2)に囲まれた卵子である原発卵胞。二次卵胞は、2つ以上の立方体顆粒球細胞に囲まれた卵母細胞である(3);直径1mm以下のアンタル卵胞は、それぞれ異なるアントルム(4)16、23を含む顆粒球細胞の2層以上
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ディスカッション
この原稿に記載されているように、体外卵巣皮質培養の利点は、卵胞が卵胞を取り巻く隣接する間質を有する正常化された環境で発達することです。体細胞と卵母細胞はそのまま残っており、インビボモデルとして適切な細胞間通信がある。我々の研究室は、7日間の培養システムが卵巣皮質の治療のための代表的な卵胞形成およびステロイド生成データを提供することを発見した。他の卵巣組織培養プロトコルは、1〜6日、32または10〜15日5、6、10の長い培養期間が比較的短い培養期間を有する。しかし、我々は、7日を超える培養が組織の劣化、ステロイド生成の減少、および潜在的に汚染の可能性の増加につながることを観察した(データは示していない)。卵巣切除術後の卵巣皮質の培養は、その特定の動物内の卵巣微小環境に関する直接的な洞察も提供する。これは、栄養体制が引き続き発泡し、ハイフ.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、米国国立食品農業研究所2013-67015-20965によって、ASCへのネブラスカ大学健康競争力のある助成金のための食品ASCに支援されました。米国農業ハッチ省は、ASC、ハッチ-NEB ANHL加盟#1002234 ASCにNEB26-202/W3112加盟#1011127を付与します。定量的ライフサイエンスイニシアチブ夏のポスドク学者のサポート - COVID-19 CMSのための夏の資金調達のための賞。
著者らは、この技術を検証する概念実証として現在の論文で使用された以前の出版物で卵巣を提供してくれたことに感謝するために、NE州クレイセンターの米国肉動物研究センターであるロバート・クッシュマン博士に感謝したいと考えています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| #11 スケーペルブレード | スワン・モートン | 303 | スカプルブレード |
| #21 スケーペルブレード | スワン・モートン | 307 | スカプルブレード |
| 500mL ボトルトップフィルター | コーニング | 430514 | ボトルトップフィルター 0.22 µろ過媒体のためのmの細孔 |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | サンプルはBiocratesに送られ、ステロイドパネルが実行され、結果が返されます |
| アンドロステンジオン二重抗体RIAキット | MPBio | 7109202 | RIAで、培養培地ベルギーA4アッセイキットからアンドロステンジオンを測定& |
| nbsp; | DIAソース | KIP0451 | RIA 培地からアンドロステンジオンを測定する |
| ウシサイトカインアレイ Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | サイトカインキット 培地からサイトカインを測定する |
| cellSens ソフトウェア標準 1.3 | オリンパス | 7790 | イメージングソフトウェア |
| インスリン-トランスフェリン-セレン-X | Gibco サーモフィッシャー サイエンティフィック | 5150056 | 培地 |
| への添加物LeibovitzのL-15ミディアム | Gibcoサーモフィッシャーサイエンティフィック | 4130039 | クリーンベンチでのティッシュ洗浄、およびバイオセーフティキャビネット |
| 顕微鏡 | オリンパス | SZX16 | 組織培養片のイメージングに用いる分切顕微鏡 |
| 顕微鏡カメラ | オリンパス | DP71 | 顕微鏡カメラ組織培養片のイメージングに使用 |
| ミリセル細胞培養インサート0.4µm、12,mm直径 | ポアシグマPICM01250 | 、組織がそれに沈むことなく媒体に対して休むことができます | |
| マルチウェル24ウェルプレート | ファルコン | 353047 | プレート メドゥイム、インサート、およびティッシュを保持するために使用される |
| プレート ペトリ皿 60 x 15 mm | ファルコン | 351007 | 培養前の洗浄ステップに使用されるペトリ皿 |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS 1X) | コーニング21-040 | -履歴書 | ティッシュ洗濯に使用 |
| SAS Version 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | 統計解析ソフトウェア |
| トーマス・スタディ・リッグス ティッシュスライサー | トーマス・サイエンティフィック | 6727C10 | フレッシュティッシュの薄い均一切片を調製するための組織スライサー |
| ウェイマウス MB 752/1 メディウム | シグマ・アルドリッチ | W1625 | 組織培養に使用されるメディウム |
参考文献
- Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
- Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from gen....
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再版と許可
