この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。
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この記事について
サマリー
要約
遺伝子転写は細胞生物学に不可欠なプロセスであり、細胞が内部および外部の手掛かりを解釈して応答することを可能にします。mRNA レベルを測定する従来のバルク集団法(ノーザンブロット、PCR、およびRNAseq)は、応答の細胞間変動に関する情報を提供する能力を欠いています。精密な単一細胞およびアレスリックな視覚化および定量は、単一分子RNA蛍光を使用して、その場合のハイブリダイゼーション(smFISH)で可能です。RNA-FISHは、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて標的RNAをハイブリダイズすることによって行われる。これらは中/高スループットのモダリティで画像化することができ、画像解析パイプラインを通じて、成熟したRNAと新生のRNAの両方に関する定量的なデータを単一のセルレベルで提供します。固定、パーメアビライゼーション、ハイブリダイゼーション、イメージングのステップは、ここに記載されているモデルシステムを使用して長年にわたって実験室で最適化されており、smFISH標識の単一細胞分析が成功し、堅牢になります。サンプルの準備と処理の主な目的は、信号対雑音比が高く、誤検出を低減し、より正確なデータを提供する高品質の画像を生成することです。ここでは、サンプルの準備からデータ分析までのパイプラインを、特定のサンプルに合わせて調整するための提案と最適化手順と組み合わせて説明するプロトコルを紹介します。
概要
遺伝子の転写と翻訳は、DNA配列からRNA、タンパク質1に移り、生物学の中心的な教義に関与する2つの主要なプロセスです。本研究では、転写中のメッセンジャーRNA(mRNA)の産生に焦点を当てます。新生RNA分子には、非コードイントロンとコーディングエキソンの両方が含まれます。イントロンは、mRNAが細胞質に移動してリボソーム2,3に翻訳する前に共転写される。
従来、mRNAの測定は、RT-qPCRまたはノーザンブロッティングなどの古典的なアッセイを用いて細胞のバルク集団(数百〜数百万)で行われます。非常に強力であるが、これらの方法は、細胞間変動(表現型ヘテロジェネリティ)、転写活性対立遺伝子の数の同定、そしておそらくより重要なことに、空間情報を欠いているという洞察を提供しないことから、限定的である。最近では、単一細胞RNAシーケンシング(RNAseq)を可能にするゲノムワイド技術は、イメージング法とシーケンシング4との間のギャップを埋め始めた。しかし、RNAseqは比較的低い検出効率に苦しんでおり、処理手順は空間情報5を完全に失う結果となる。単一細胞RNAEqは、同一性細胞の集団の中で表現型ヘテロジニアリティに関する洞....
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プロトコル
最適な結果を得るために、このプロトコルのウェットラボ部分では、すべてのステップで標準のRNaseフリーの予防措置が必要です。例えば、濾過されたピペットチップ、滅菌容器およびRNaseフリーバッファーの使用は非常に奨励される。特に低存在量標的RNAに対して、バナジルリボヌクレオシド複合体などのRNase阻害剤を用いることも示唆されている。
1. 細胞培養と実験のセットアップ
- フェノールレッドフリー(ホルモン刺激実験にのみ必要)のT75組織培養フラスコで付着MCF-7乳癌細胞(ATCC #HTB-22)を維持し、ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)に10%ウシウシ血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、 1 nMピルビン酸ナトリウム、50 I.U./mLペニシリンおよび50 μg/mLストレプトマイシン。
- 酸エッチングされたポリD-リジンコーティングされた丸いカバーリップ(厚さ0.16〜0.19mm、直径12mm)を24個のマルチウェル組織培養プレートに入れます。
注:1 M HClを使用してカバーリップを酸エッチングし、標準的なプロトコルに従って無菌PBS(Ca ++およびMg++なしリン酸緩衝生理食塩水)で再構成されたポリD-リジンの1mg/mL溶液でコートします。 - 細胞から増殖培地を取り出し、5 mLの無菌PBS(Ca++およ....
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結果
smFISHを介したホルモン応答を分析するために、例として、NIEHSスーパーファンド研究プログラム7への参加の文脈で環境災害における内分泌破壊化学物質の存在を決定するために、高スループットアッセイに使用されるエストロゲン受容体(ER)モデルを選びました。本実験では、付着性MCF-7乳癌細胞を、ERアゴニスト17β-エストラジオール(E2,10nM)または車両(DMSO)で24時間治療した。GREB1イントロニック(Atto 647N、 図1の赤)とエキソン(図 1のクエーサー570、緑色)配列に対するスペクトル分離プローブセットは、新生および成熟したmRNAの同時可視化と定量を可能にする。重要なのは、エストロゲン応答時間コース7の一部であることが示されている各細胞における転写活性対立遺伝子の数をマーキングする。
完成したプロトコルは、対象領域ごとに 16 ビット最大強.......
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ディスカッション
記載されている smFISH の方法論は、以前に公開されたプロトコル7、12、14に基づいています。このプロトコルでは、ウェットラボ(播種密度、固定時間、透過性、プローブ濃度を含む)からイメージングおよび画像解析に最適化された重要なステップを説明し、遺伝子転写の単一細胞分析を行うことに興味を持つ研究所に完全な実験パイプラインを提供します。
単一細胞分析を容易にするためには、細胞境界を必要とせずに細胞境界が推定されるように、細胞がサブコンフルエントであり、重なり合わないことが重要です。実験期間中、広範囲の播種密度に及ぶ細胞増殖アッセイを完成させ、細胞密度を最適化することを提案します。
smFISH実験を成功させるには、最適な固定時間を決定することが重要です。我々は、VRCを含む滅菌PBSで氷上で30分間希釈した4%精製ホルムアルデヒドでサンプル.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
MAM、FS、MGMはNIEHS(プロジェクト4、P42ES027704、PI、ルシン)によって資金提供されています。MAM、FS、RMM、MGM、PKSは、CPRITが資金を提供するGCC先端顕微鏡・画像情報学センター(RP170719)によってサポートされています。イメージングは、NIH(DK56338、CA125123)、CPRIT(RP150578)、ダン・L・ダンカン総合がんセンター、ジョン・S・ダン・ガルフ・コースト化学ゲノミクス・コンソーシアムからの資金提供を受けて、ベイラー医科大学の統合顕微鏡コアによってもサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 17&ベータ;エストラジオール | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS 番号 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) バッファー、Rnase フリー | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Fisher | Scientific | MT10017CV | Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | ピルビン酸ナトリウムなし |
| デキストラン硫酸塩、50% 溶液 滅菌済み | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Calbiochem Ethanol 製 |
| 、200 プルーフ (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 Manufactured by Decon Laboratories | |
| Fetalウシ血清(FBS)、500 mL | フィッシャーサイエンティフィック | 50-753-2978 | ジェミニバイオプロダクツ社製 |
| GEヘルスケア デルタビジョンLIVE高解像度デコンボリューション顕微鏡 | GEヘルスケア | ||
| ハイクロン水、分子生物学グレード | フィッシャーサイエンティフィック | SH3053802 | |
| 浸漬油 1.516 | GEヘルスケアライフサイエンス | 29162940 | GE社製ヘルスケア バイオサイエンス |
| L-グルタミン溶液 | フィッシャーサイエンティフィック | MT25005Cl | コーニング社製 |
| MCF-7細胞 | ATCC | HTB-22 | |
| 分子グレードホルムアミド | プロメガ | PAH5051 | |
| オリンパス 60倍/1.42 NA 対物 | オリンパス | ||
| パラフィルム | ビーミス社 | 52858-076 | VWR |
| パラホルムアルデヒド、16%溶液、EMグレードの | 電子顕微鏡科学 | 15710 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 | フィッシャーサイエンティフィ | MT3001Cl | ニングリ |
| ボヌクレオシドバナジルコンプレックス | VWR101229-716 | イングランドバイオサイエンス | |
| RNaseアウェイ | アンビオン | 9780によって製造 | |
| ピルビン酸ナトリウム、100 mM | フィッシャーサイエンティフィック | 11-360-070 | Gibco |
| Thermo Scientific ガラスカバースリップ、#1.5 | フィッシャーサイエンティフィック | 12-545-81P | |
| トリトン X-100、100 mL | フィッシャーサイエンティフィ | BP151-100 | フィッシャーバイオ試薬 |
| トリプシン-EDTA 溶液 0.25% | シグマ-アルドリッチ | T4049-500ML | |
| Vectashield 退色防止封入剤 10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | Vector Laboratories 製 |
参考文献
- Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
- Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
- Köhler, A., Hurt, E.
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