単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

サマリー

この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。

要約

遺伝子転写は細胞生物学に不可欠なプロセスであり、細胞が内部および外部の手掛かりを解釈して応答することを可能にします。mRNA レベルを測定する従来のバルク集団法(ノーザンブロット、PCR、およびRNAseq)は、応答の細胞間変動に関する情報を提供する能力を欠いています。精密な単一細胞およびアレスリックな視覚化および定量は、単一分子RNA蛍光を使用して、その場合のハイブリダイゼーション(smFISH)で可能です。RNA-FISHは、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて標的RNAをハイブリダイズすることによって行われる。これらは中/高スループットのモダリティで画像化することができ、画像解析パイプラインを通じて、成熟したRNAと新生のRNAの両方に関する定量的なデータを単一のセルレベルで提供します。固定、パーメアビライゼーション、ハイブリダイゼーション、イメージングのステップは、ここに記載されているモデルシステムを使用して長年にわたって実験室で最適化されており、smFISH標識の単一細胞分析が成功し、堅牢になります。サンプルの準備と処理の主な目的は、信号対雑音比が高く、誤検出を低減し、より正確なデータを提供する高品質の画像を生成することです。ここでは、サンプルの準備からデータ分析までのパイプラインを、特定のサンプルに合わせて調整するための提案と最適化手順と組み合わせて説明するプロトコルを紹介します。

概要

遺伝子の転写と翻訳は、DNA配列からRNA、タンパク質1に移り、生物学の中心的な教義に関与する2つの主要なプロセス^です。本研究では、転写中のメッセンジャーRNA(mRNA)の産生に焦点を当てます。新生RNA分子には、非コードイントロンとコーディングエキソンの両方が含まれます。イントロンは、mRNAが細胞質に移動してリボソーム^2,3に翻訳する前に共転写される。

従来、mRNAの測定は、RT-qPCRまたはノーザンブロッティングなどの古典的なアッセイを用いて細胞のバルク集団(数百〜数百万)で行われます。非常に強力であるが、これらの方法は、細胞間変動(表現型ヘテロジェネリティ)、転写活性対立遺伝子の数の同定、そしておそらくより重要なことに、空間情報を欠いているという洞察を提供しないことから、限定的である。最近では、単一細胞RNAシーケンシング(RNAseq)を可能にするゲノムワイド技術は、イメージング法とシーケンシング⁴との間のギャップを埋め始めた。しかし、RNAseqは比較的低い検出効率に苦しんでおり、処理手順は空間情報5を完全に失う^{結果となる}。単一細胞RNAEqは、同一性細胞の集団の中で表現型ヘテロジニアリティに関する洞察を提供することができるが、その現場でのRNA蛍光(RNA-FISH)は、空間レベルでの標的遺伝子発現のより完全な探索を促進し、かつアレル単位^6,7に基づく。

RNA FISHは、固定細胞内の標的RNA分子の検出と局在化を可能にする技術です。従来とは異なり、骨状の方法、現在の最先端のRNA-FISHは、標的RNA配列と相補的である市販の核酸プローブを利用し、これらのプローブはWatson-Crick塩基対合体⁸によってそれらの標的にハイブリダイズする。初期のシチュハイブリダイゼーション技術は、1969年にGallとPardueによって確立された同様のプロトコルを含み、サンプルとして標的RNA⁹に特異的にハイブリダイズした核酸プローブで処理された。もともとアッセイは放射性または色分け検出を使用して行われました。しかし、1980年代には、DNA FISHおよび後のRNA FISHへの蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)プロトコルの開発は、より敏感な検出への経路を開き^、10,11を多重化する可能性を秘めている。

RNA FISHのさらなる発展は、単一RNA分子(smFISH)12,13を検出し定量する能力をもた^れている。直接検出は、プローブ自体がフルオロフォアで標識される方法です。smFISHの課題は、蛍光シグナルを明確で回折制限されたスポットとして検出するのに十分なハイブリダイジングプローブ/ターゲットが必要な点です。この問題に対処するために、1つは、標的^{RNA8、12、14}の様々な領域に相補的な短い一本鎖DNAオリゴヌクレオチドのプローブセットを使用することができる。複数のプローブの結合は、局所的な蛍光色素密度を増加させ、蛍光顕微鏡による明確で高強度のスポットとしてRNAを可視化します。この方法は、プローブセットプール内のオリゴヌクレオチドのオフターゲット結合は、真のシグナルとスプリアスオリゴヌクレオチド結合を区別するためにスポットサイズと強度を定量的に解析することによって真のRNAスポットシグナルと区別できるため有利であり、したがって偽陽性¹²を低減することによってより正確な分析を促進する。

mRNAを検出する代替方法は、古典的なBACクローンベースのニック翻訳法と、最近開発された分岐DNAシステムです。BACクローンのニック翻訳法では、標識されるDNAは酵素的にニックされ、新しいヌクレオチドが露出した3'末端に追加されます。DNAポリメラーゼIの活性は、所望のプローブ^15,16に至る標識ヌクレオチドを付加^する。分岐DNA技術は、RNA標的と対にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含み、これらのプローブは複数のシグナル増幅分子を利用して増幅される。この方法は、信号対雑音比を大幅に改善することができますが、蛍光スポットは大きく異なるサイズと強度¹⁷であるため、増幅は正確な定量を歪めることができます。

このプロトコルのモデルシステムとして、ガルベストンベイ/ヒューストンシップチャンネルにおける内分泌破壊化学物質の影響を定量化するためにNIEHSスーパーファンド研究プログラムの参加の一環として完全に採用され、エストロゲン受容体(ER)陽性乳癌細胞株MCF-7をERアゴニスト、17β-エストラジオール(E2)7,18,19で一晩投与した。E2は、原型的なER標的遺伝子を含む多くのER標的遺伝子を調節する、GREB1^{7、20、21、22。}ここで説明する smFISH プロトコルは、GREB1 を対象とする 2 つのスペクトル分離プローブ セットのセットを使用します。エキソンにハイブリダイズする1つとイントロンに他の1つを、成熟したRNAと新生^RNA7の両方の測定を可能にする。次に、画像smFISH標識サンプルにデコンボリューションと相まって蛍光顕微鏡を使用し、画像分析ルーチンを適用して細胞当たりの活性対立胞および成熟RNAの数を定量化する。

プロトコル

最適な結果を得るために、このプロトコルのウェットラボ部分では、すべてのステップで標準のRNaseフリーの予防措置が必要です。例えば、濾過されたピペットチップ、滅菌容器およびRNaseフリーバッファーの使用は非常に奨励される。特に低存在量標的RNAに対して、バナジルリボヌクレオシド複合体などのRNase阻害剤を用いることも示唆されている。

1. 細胞培養と実験のセットアップ

1. フェノールレッドフリー(ホルモン刺激実験にのみ必要)のT75組織培養フラスコで付着MCF-7乳癌細胞(ATCC #HTB-22)を維持し、ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)に10%ウシウシ血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、 1 nMピルビン酸ナトリウム、50 I.U./mLペニシリンおよび50 μg/mLストレプトマイシン。
2. 酸エッチングされたポリD-リジンコーティングされた丸いカバーリップ(厚さ0.16〜0.19mm、直径12mm)を24個のマルチウェル組織培養プレートに入れます。
   注:1 M HClを使用してカバーリップを酸エッチングし、標準的なプロトコルに従って無菌PBS(Ca ++および^Mg++なしリン酸緩衝生理食塩水)で再構成されたポリD-リジンの1mg/mL溶液でコートします。
3. 細胞から増殖培地を取り出し、5 mLの無菌PBS(Ca++および^Mg++なしでリン酸緩衝生理食塩分)で1回洗浄する。2-3 mLのトリプシン-EDTA 0.25%溶液を使用してMCF-7細胞を取り外します。細胞を取り外したら、トリプシンEDTA 0.25%溶液を同量の増殖培地で中和します。
4. 培地懸濁液中の細胞を15mL円錐状チューブに移し、391 x g で1分間スピンダウンして細胞をペレットにします。細胞ペレットを邪魔することなく円錐形のチューブから慎重に培地を取り出し、適切な量の処理媒体で細胞を再懸濁させる。
   注:治療培地はフェノールレッドフリーDMEMで、5%の炭デキストランを剥がして透析したFBS、2 mM L-グルタミン、1 nMナトリウムピルビン酸、50 I.U./mLペニシリン、50 μg/mLレンサマイシンを補充しています。この培地は、血清成分が主に培地を剥ぎ取ることによってステロイドを枯渇させ、透析を介して成長因子を減少させているので、ステロイドホルモン刺激実験に不可欠である。
5. 500 μLの処理媒体で、ウェルあたり60,000~70,000個の細胞で24個のマルチウェルプレートのカバーリップに細胞を播種します。この実験では、細胞の合流率は治療開始時に約70〜80%であるべきである。細胞の種類、増殖速度、実験の長さに応じて細胞のシード密度を最適化し、画像解析を複雑にする合流性を避けます。
   注: 最適なイメージングと画像解析を行うため、セルの束を避けてください。この目的のために、ウェルに分配する前に、細胞をピペッティング(または短時間渦)することによって細胞のアリコートを完全に混ぜます。メッキされた細胞をインキュベーターに戻す前に、細胞を組織培養フードに約20分間落ち着かせ、細胞の凝集を減らすのに役立ちます。
6. 細胞を培養処理の前に少なくとも2日間インキュベートし、増殖培地の除去/透析液中に残っているシグナル伝達分子による細胞周期の同期とバックグラウンドの低下を確実にします。
7. 処理媒体中で48時間のインキュベーションを行った後、MCF-7細胞を10nM17βエストラジオール(E2)および車両制御(DMSO)で、24時間処理媒体で希釈して治療する。この治療は、最大応答を誘導するためにE2の飽和用量を使用します。時間経過および用量反応実験を行い、さまざまな標的遺伝子、細胞モデルおよび治療の種類の条件を経験的に決定します。例として、最近の出版物⁷を参照してください。

2. バッファの準備

1. 固定バッファーを調製するために、希薄精製された単量体ホルムアルデヒド(電子顕微鏡サプライヤーによって16%パラホルムアルデヒドとして販売)を滅菌PBS Ca^++/Mg++(リン酸緩衝生理食塩水^{+Ca++およびMg++)}で4%にする。 RNA分解を遅らせるために2mMの最終濃度のために固定バッファーにバナジルリボヌクレオシド複合体(VRC)を加えます。
   1. 24個のマルチウェルプレートのウェルあたり300-500 μLの固定液を必要とすることに基づいて、固定バッファーの合計量を計算します。4%ホルムアルデヒドを氷の上に保管し、固定工程で必要になるまで保管してください。
      注: 各実験の固定バッファーを最新の状態にします。
      注意:ホルムアルデヒドは、皮膚を通して吸収されるテラトゲンです。あなたの機関の規制に従って適切なPPEと一緒にヒュームフードにこの化学物質を使用してください。
2. パーメアビライゼーション工程では、ヌクレアーゼフリー水に70%エタノールを調製する。代替オプションは、無菌PBS Ca⁺⁺/ Mg⁺⁺ プラス2 mMのVRCで0.5%トリトンX100です。ウェルあたり500 μLのバッファを利用して、必要なパーメアビライゼーションバッファの総量を計算します。
3. ハイブリダイゼーションバッファーの9 mLを調製するには、ストック50%デキストラン硫酸塩2 mL、20x SSC(クエン酸ナトリウムナトリウム)バッファーの1 mLを6 mLのヌクレアーゼフリー水に加えます。渦はハイブリダイゼーション緩衝液を完全に混合する。このバッファーは、4 °Cで最大1週間保存できます。
4. クエン酸ナトリウム(SSC)2xを必要とする5つの別々の洗浄工程があります。洗浄ステップごとにカバースリップあたり500 μLのバッファを予想して、必要な2x SSCバッファの最終体積を計算します。ヌクレアーゼを含まない水に必要な量のストック20x SSCバッファーを希釈します。2 mM VRC は、余分な予防措置として洗浄ステップに追加できます。このバッファーは、処理ステップの間室温で保管することができます。

3. RNA魚の固定

1. 治療後、ウェルから培地を取り出し、滅菌、冷たいPBS Ca⁺⁺/ Mg⁺⁺で一度洗います。低い付着セルモデルが利用されている場合は、真空を使用して液体を吸引しないでください。手動ピペットを使用して、ウェルの側面から慎重にメディアを取り除き、最初の洗浄ステップを省略します。氷の上に30分間500 μLの固定バッファーを加えます。
   注: サンプルが RNA 分解を起こしやすい場合は、この時点での洗浄工程に 2 mM VRC の無菌 PBS を使用してください。
2. 固定液を除去し、制度上の規制に従って化学廃棄物に処分する。3分間冷たい生殖不能PBS Ca⁺⁺/ Mg⁺⁺ で細胞を2回洗浄します。
3. PBSを取り除き、各ウェルに500μLの70%エタノールを加えます。24ウェルプレートをパラフィンプラスチックフィルムで密封します。4 °Cの回転器に4時間以上置きます。一晩70%エタノールでサンプルを残しておくのが最善です。この時点でプロトコルを一時停止することができ、サンプルは70%エタノールで最大1週間保存することができます。
   注: 2 mM VRC ソリューションを使用した PBS の 0.5% トリトン X100 を代わりに使用できます。このパーメアビライゼーションバッファーのサンプルを、ローテーターの室温で20分間インキュベートします。このパーメアビライゼーション バッファを利用する場合、この時点ではプロトコルを一時停止できず、ハイブリッド化の手順を続行する必要があります。

4. RNAフィッシュのハイブリダイゼーション

1. パーメアビライゼーションバッファーを取り外し、2x SSCバッファーの500 μLに加えて、ローテーターの室温で5分間10%ホルムアミドを1回洗います。
2. 完全なハイブリダイゼーション バッファを準備します。カバースリップあたり、約30 μLの完全なハイブリダイゼーションバッファを計算します。必要なパーセントに到達するために、ハイブリダイゼーションバッファーにホルムアミドを追加します。例えば、完全なハイブリダイゼーションバッファの500 μLが必要な場合、それは10%のvol/volに達するために、以前に作られたハイブリダイゼーションバッファーの450 μLに加えて50 μLの分子グレードのホルムアミドで構成されます。渦は簡単に混ぜる。
   注意:フォルマミドは、皮膚を通して吸収されるテラトーゲンです。機関の規制に従って適切なPPEと一緒にヒュームフードにこの化学物質を使用してください。
3. GREB1イントロン(Atto 647Nで標識)とGREB1エキソン(クエーサー570で標識)プローブをハイブリダイゼーションバッファで1:300に希釈します。ピペットで混ぜます。このバッファを光から保護し、すぐに使用してください。
   注:プローブはStossiら⁷で詳述されているように設計され、製造されました。プローブは、通常、製造プロトコル¹⁴に従ってRNAEフリーTEバッファで再構成しなければならない乾燥オリゴヌクレオチドプローブプールとして提供される。したがって、これらのプローブのストックソリューションは12.5 μMでした。プローブの作業濃度は42 nMです。
4. 一晩のハイブリダイゼーションステップのための加湿室を準備します。パラフィンプラスチックフィルムの一部を置きます, 露出していない側を上に, RNasesを除去するために表面デコンタミナントで洗浄ガラスペトリ皿.滅菌水で2つのペーパータオルを飽和させ、乾燥が特定のラベリングを破壊する可能性があるため、湿気を提供するためにペトリ皿の端に沿ってそれらを置きます。
5. アリコートは、パラフィンプラスチックフィルムのきれいな側にハイブリダイゼーションバッファーにプローブの30 μLを点在させることによってプローブをアリコート.カバーリップが互いに接触しないように、プローブのアリコートを分配します。
6. 滅菌鉗子を使用して、カバーリップセル側をガラスペトリ皿のプローブにそっとひっくり返します。気泡を避け、カバーリップに圧力をかけないでください。
   注:2x SSCバッファーを含む組織培養プレートは、後続のステップで必要となるため廃棄しないでください。
7. ガラスペトリ皿をパラフィンプラスチックフィルムで密封し、フルオロフォアへの光暴露を防ぐためにホイルでプレートを覆います。平らな非回転面上で37°Cで、一晩、最大16時間インキュベートします。インキュベーションの時間は経験的に変化することができますが、最低4時間が推奨されます。
   注:カバーリップは、ハイブリダイゼーションバッファでインキュベートする際に滑り回りやすく、カバースリップの乾燥したスポットやサンプルの損傷につながる可能性があります。

5. イメージング用サンプルの準備

1. 翌日、鉗子を使用して加湿室からカバーリップを取り外し、セル側を上にして24ウェルプレートに戻します。500 μLの新鮮な 2x SSC バッファーに加えて 10% ホルムアミドを加えて、過剰なプローブと非特異的ハイブリダイゼーションを洗い流します。
   注: このポイント以降のライトからサンプルを保護します。
2. 加熱されたローテーターで、2x SSCバッファーの500 μLと10%ホルムアミドをそれぞれ15分間15分間洗浄します。
3. DAPIを持つ反ステインDNAを1 μg/mLで2x SSCバッファで10分間、ローテーター上の室温で10分間使用します。
4. 室温で5分間、2倍のSSCバッファーで1回洗浄します。
5. 余分な2x SSCバッファーをペーパータオルで取り除き、ヌクレアーゼフリーウォーターで素早く洗い流した後、非硬化型取り付けメディアを使用してカバースリップをガラススライドに取り付け、余分な塩を除去します。最後に、カバーリップを透明なマニキュアで密封します。

6. 高解像度顕微鏡と画像処理

1. 60xまたは100xの油目的とsCMOSカメラを使用して、広視野蛍光顕微鏡でサンプルを画像化します。この実験に使用する特定の顕微鏡と目的の材料表をご覧ください。
   1. 信号の時間依存性の低下を避けるために、サンプルが完全に処理されるとすぐにイメージングを完了します。
      注:この実験では、屈折率(RI)の浸漬油を使用しています。RIの不一致はイメージのデコンボリューションに影響を与える点広がり関数の収差をもたらすので、特定のサンプルに石油RIを一致させるために経験的なテストを行う必要があります。
2. 画像は、0.10827 μmの横ピクセルサイズでキャプチャされます。
3. 光源からの照度(すなわち、透過率のパーセント)と各チャンネルの露光時間(この特定の例ではDAPI、TRITC、CY5フィルタ)を、最も高い強度(すなわち、正のコントロール)を有すると予想されるサンプルを用いて最適化する。この実験では、E2処理サンプルは両方のGREB1プローブセットに対して高い強度を有することが期待される。一般的に、GREB1イントロンおよびエキソンプローブの透過率は50~100%、露光時間は0.25~0.60秒です。
4. さらに、フォトブリーチやカメラピクセルの彩度を避ける条件下で画像を取得します。私たちの経験では、背景と信号強度の間に最小〜10倍の違いがあるはずです。少数のピクセル/フィールドの飽和は、サンプル内の非特異的な信号(すなわち、カバースリップの汚れ、セルの外のプローブ凝集)のために発生する可能性がありますが、飽和領域が定量に含まれていない場合にのみ許容できます。
5. Z スタックの取得を設定するには、DAPI チャネルのサンプルに注目します。DAPI 染色された核が焦点を合わせなくなる距離で、Z スタックの上部と下部を選択します。使用したzスタックステップサイズはスライスあたり0.25 μmで、総zスタックはセル全体にまたがります(MCF-7細胞では約10 μm)。ただし、z スタックのステップ サイズは使用する目的に従って変更され、ナイキストサンプリング基準に従う必要があります。
   注:イントロンは通常核にのみ存在します。しかし、エキソンは核と細胞質の両方にあります。したがって、上記のようにzスタックを設定すると、zスタックがセル全体を包含するので、イントロンとエキソンラベリングの大部分をキャプチャします。
6. 通常、予備実験で定量分析のために最低200個の細胞を画像化し、細胞間の応答の大きさと変動のスナップショットをキャプチャします。
7. 一部の画像化された細胞は、解析パイプライン(すなわち、画像の境界に触れる細胞、アポトーシス/ミトティック細胞)によって除外されるため、最終的な分析(ドロップアウト率)から除外されます。
   注: 画像領域を選択する場合、注意すべきいくつかの要素があります。DAPI標識、核蛍光によって定義されるように、均等に広がる、重複しない細胞を有する領域を選択する。また、部分的なセルをカウントしないように、画像領域のエッジに沿って最小の数の核を持つ領域を選択します。自動でバイアスのないイメージングは、統計的分析を必要とする実験に常に好まれます。
8. 取得後、10サイクル(すなわち、反復回数)を使用して積極的な修復アルゴリズムを使用して画像をデコンボルブする。画像解析用に最大強度投影を生成します(特定の 3D 解析が必要な場合は、この手順を省略します)。使用するカメラのビット深度に応じて、すべての投影画像を保存します。この場合、16ビットのTIFFグレースケール画像が保存されました。RGB 画像のビット深度が小さくなり、情報が失われます。したがって、RGB 画像は画像解析には適していません。

7. 画像解析

1. 手順を読み、github(https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis)から jupyter ノートブックをダウンロードします。
2. Python アナコンダディストリビューション(https://www.anaconda.com/distribution/)バージョン 3.6 以上をインストールします。
3. anaconda プロンプトを開き、インストール コマンドに「単純 ITK を anaconda 用にインストールする (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk) 」と入力します。
4. アナコンダのナビゲーターを開き、ジュピターノートブックを起動します。ディレクトリとファイルを表示する Web ブラウザが開きます。ディレクトリ構造を参照して、github からダウンロードした jupyter ノートブックを含むディレクトリにアクセスします。
5. ノートブックを開き 、Shift キー と Enter キーを同時に押して各セルを実行します。
6. ノートブックに用意されている各関数と手順の詳細に従います。異なる画像のセットでは、パラメータ値を変更する必要があります。
   注: 簡単に言えば、DAPI チャネルから、ブロック サイズが 251 ピクセルのローカルスレッショニングを使用して、核がセグメント化され、穴が埋め込まれ、100 ピクセル未満のオブジェクトが削除されます。核に触れることは、流域アルゴリズムを使用して分割されました。その後、核マスクは100ピクセル拡張され、流域は核を流域として接触する物体を分離するために使用されました。定常状態RNA(エキソン)を同定するために、大津閾値を用いた。転写活性対立体(intron)では、まずガウスブラー(シグマ=1)を適用し、次に最大エントロピー閾値を使用した。

結果

smFISHを介したホルモン応答を分析するために、例として、NIEHSスーパーファンド研究プログラム⁷への参加の文脈で環境災害における内分泌破壊化学物質の存在を決定するために、高スループットアッセイに使用されるエストロゲン受容体(ER)モデルを選びました。本実験では、付着性MCF-7乳癌細胞を、ERアゴニスト17β-エストラジオール(E2,10nM)または車両(DMSO)で24時間治療した。GREB1イントロニック(Atto 647N、 図1の赤)とエキソン(図 1のクエーサー570、緑色)配列に対するスペクトル分離プローブセットは、新生および成熟したmRNAの同時可視化と定量を可能にする。重要なのは、エストロゲン応答時間コース⁷の一部であることが示されている各細胞における転写活性対立遺伝子の数をマーキングする。

完成したプロトコルは、対象領域ごとに 16 ビット最大強...

ディスカッション

記載されている smFISH の方法論は、以前に公開されたプロトコル^7、12^、14に基づいています。このプロトコルでは、ウェットラボ(播種密度、固定時間、透過性、プローブ濃度を含む)からイメージングおよび画像解析に最適化された重要なステップを説明し、遺伝子転写の単一細胞分析を行うことに興味を持つ研究所に完全な実験パイプラインを提供します。

単一細胞分析を容易にするためには、細胞境界を必要とせずに細胞境界が推定されるように、細胞がサブコンフルエントであり、重なり合わないことが重要です。実験期間中、広範囲の播種密度に及ぶ細胞増殖アッセイを完成させ、細胞密度を最適化することを提案します。

smFISH実験を成功させるには、最適な固定時間を決定することが重要です。我々は、VRCを含む滅菌PBSで氷上で30分間希釈した4%精製ホルムアルデヒドでサンプル...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
17&ベータ;エストラジオール	Sigma-Aldrich	E2257	CAS 番号 50-28-2
Ambion SSC (20X) バッファー、Rnase フリー	ThermoFisher Scientific	AM9770
Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Fisher	Scientific	MT10017CV	Invitrogen
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	ピルビン酸ナトリウムなし
デキストラン硫酸塩、50% 溶液 滅菌済み	Sigma-Aldrich	3730-100ML
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 Ca++/Mg++	Corning	21030CV	Calbiochem Ethanol 製
、200 プルーフ (100%)	Fisher Scientific	07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate	Corning		353047 Manufactured by Decon Laboratories
Fetalウシ血清(FBS)、500 mL	フィッシャーサイエンティフィック	50-753-2978	ジェミニバイオプロダクツ社製
GEヘルスケア デルタビジョンLIVE高解像度デコンボリューション顕微鏡	GEヘルスケア
ハイクロン水、分子生物学グレード	フィッシャーサイエンティフィック	SH3053802
浸漬油 1.516	GEヘルスケアライフサイエンス	29162940	GE社製ヘルスケア バイオサイエンス
L-グルタミン溶液	フィッシャーサイエンティフィック	MT25005Cl	コーニング社製
MCF-7細胞	ATCC	HTB-22
分子グレードホルムアミド	プロメガ	PAH5051
オリンパス 60倍/1.42 NA 対物	オリンパス
パラフィルム	ビーミス社	52858-076	VWR
パラホルムアルデヒド、16%溶液、EMグレードの	電子顕微鏡科学	15710
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液	フィッシャーサイエンティフィ	MT3001Cl	ニングリ
ボヌクレオシドバナジルコンプレックス	VWR101229-716		イングランドバイオサイエンス
RNaseアウェイ	アンビオン	9780によって製造
ピルビン酸ナトリウム、100 mM	フィッシャーサイエンティフィック	11-360-070	Gibco
Thermo Scientific ガラスカバースリップ、#1.5	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-81P
トリトン X-100、100 mL	フィッシャーサイエンティフィ	BP151-100	フィッシャーバイオ試薬
トリプシン-EDTA 溶液 0.25%	シグマ-アルドリッチ	T4049-500ML
Vectashield 退色防止封入剤 10 mL	Fisher Scientific	NC9265087	Vector Laboratories 製