過渡性心筋肥大を得るために吸収性縫合を用いて横方向の大動脈収縮を操作する

Summary

このプロトコルは、吸収性縫合糸を有する一過性心筋肥大を得るための改善された方法を提示し、圧力過負荷を除去した後に減少した左心室肥大をシミュレートする。これは、心筋肥大型プレコンディショニングに関する研究のために貴重な可能性があります。.

Abstract

マウスの2回横筋狭窄(TAC)に基づいて、心筋肥大前調整(MHP)が心筋細胞肥大を減衰させ、心不全への進行を遅らせることができることが証明されています。しかし、初心者にとって、MHPモデルは、人工呼吸器の操作における技術的な障害、胸部の繰り返し開き、およびデパンディングによる出血のために確立することは通常非常に困難である。このモデルを容易にするために、外科的成功率を高め、出血の発生率を減少させるために、人工呼吸器のない技術を用いた最初のTACコーミングのための吸収可能な縫合糸に切り替えた。2週間の吸収性縫合糸を用いて、この手順が2週間で重大な心筋肥大を引き起こす可能性があることを実証した。そして手術後4週間、心筋肥大はほぼ完全にベースラインに後退した。このプロトコルを使用すると、オペレータは、より低い操作死亡率でMHPモデルを簡単に習得することができます。

Introduction

虚血性プレコンディショニングは、虚血と心臓への再灌流の短い非致死的なエピソードを誘発する現象であり、心筋損傷を劇的に減少させる能力を有^する1。心筋梗塞サイズ²の制限や心筋血管化^後の心室頻脈不整脈の抑制など、虚血性プレコンディショニングの明らかな臨床的影響を考えると、プレコンディショニング^4,5によって誘発される心臓保護効果のメカニズムを解剖する研究が多い。対照的に、他の非虚血型のプレコンディショニングは比較的注目されていない。心臓肥大は、大動脈弁置換術⁶を受けている大動脈狭窄症の患者において鈍化し得る。病理学的心筋肥大の状態が存在するところはどこでも、プレコンディショニングの原理はほとんど報告されない。

1991年、ロックマンらは、まず横大動脈収縮^(TAC)7により左心室肥大のマウスモデルを確立した。マウスでTACを2回操作することにより、心筋肥大型プレコンディショニング(MHP)が心臓の一過性肥大刺激につながることが以前に証明され、それによって心臓は将来の持続的な肥大性ストレスに対してより耐性を高める^8。MHPモデルの特性は、超音波バイオ顕微鏡と血行力学的評価⁹によって検証されています。モデルを構築する際の重要なポイントは、3回の経術術、1週間のTAC、1週間のデバンディング、および6週間の二次TACを行うことであった。しかし、デベンディングは出血を引き起こす可能性があり、初心者によって習得されにくく、普及することは困難でした。また、マウスを挿管することは技術的な課題でもあります。不適切な挿管は、気管損傷、気胸、さらにはマウスの死を引き起こす可能性があります。したがって、MHPモデルを構築しながら、いくつかの手順を改善することが必要であり、価値があります。

モデルの難易度を軽減し、その成功を高めるために、我々は最初のTACのための吸収可能な縫合線に切り替え、心エコー検査¹⁰の下で大動脈収縮の間の圧力勾配を測定することによってモデルの成功を監視した。我々の予備実験に基づいて、あまりにも低圧勾配のマウスに十分な心筋肥大を誘発することは困難であり、高圧勾配が高すぎるマウスは急性心不全を発症するか死ぬことさえある。モデルの理想的な圧力勾配は40-80 mmHg¹¹から範囲。さらに、この実験は人工呼吸器に頼らず、人工呼吸器関連の技術的操作や傷害を効果的に回避できる^12.

Protocol

すべての手順は、米国国立衛生研究所(NIH出版第85-23号、1996年に改訂)が発行した 実験動物のケアと使用 のガイドラインに従って行われました。C57BL/6J雄マウス(8-10週、20〜25g)は、南医科大学動物センターによって提供された。

1. 術前準備

1. 針ホルダーで25G針の先端をつまみ、ホルダーのような硬い物体で鈍らせる。
2. 5~0 の吸収性縫合糸を針に通し、それをホルダー¹³で 90° にカーブさせます。
   注:異なる研究目的に従って、研究者は異なる吸収時間で吸収可能なラインを選択することができます。このプロトコルでは、大動脈弓を収縮させるために2週間の吸収可能な縫合糸を使用しました。
3. 別の25G針を120°までカーブさせ、ライゲーションステップでスペーサーとして使用するホルダーで先端を滑らかにします。
   注:体重(BW)>25gを持つマウスのスペーサーとして25G針が使用されました。19-24 g BW のマウスには 26 G 針を使用してください。
4. 75%アルコールで手術部位を消毒します。
5. 加熱パッドの温度を37°Cに調整します。
6. 滅菌された手術器具(1つの眼科用ハサミ、1つのマイクロハサミ、2つのマイクロ外科肘ピンセット、1針のホルダーおよび1つのマイクロ針のホールダーを含む)

2. 麻酔とシェービングの誘導

1. 生理食塩水(0.9%NaCl)で希釈したキシラジン(5mg/kg)とケタミン(100mg/kg)の混合物の腹腔内注射によりマウスを麻酔します。陰性ペダル離脱反射で完全麻酔を確認します。
2. 縫合糸で切歯を固定し、粘着テープで手足を固定することにより、マウスを上手に置いてください。
3. 脱毛クリームを適用して、首とシフォイドの毛髪を取り除きます。ヨウ素で地域を消毒し、その後75%のアルコールを消毒します。

3. 手術

1. メスで上胸部ノッチと胸部の間の正中位置に10mm以上の切開を行います。次に、皮膚と表面性筋膜を分離する。
2. 胸骨の角度からリブを数えることによって、最初の肋間空間を識別します。最初の肋間空間で切開を行い、胸骨にできるだけ近い。このスペースを開くために肘のピンセットでそれをぶっきらぼうに貫通してください。
3. 横大動脈弓が見えるまで、パレンチマと胸腺を穏やかに分離します。
   注意:気胸を避けるために頭頂胸膜を損傷しないでください。
4. 大動脈弓の下に5-0吸収性縫合糸を、腕頭筋動脈と左共通頸動脈の間に、ラッチ針¹⁴で渡す。手術場には、腕頭筋動脈、左共通頸動脈、左鎖骨下動脈が見えるようにしてください。
5. ステップ1.3で準備したスペーサーを横断大オルタに置き、ステップ3.4で縫合糸でスペーサーにダブルノットを実行します。
   注:スペーサーの先端は、それを取り外している間に横の大オルタを傷つけることを避けるために鈍くなければなりません。
6. スペーサーを素早くそっと取り出し、縫合糸の端を切ります。
7. 5-0 ナイロン縫合糸を使用して、最初の肋間空間とスキンを閉じます。75%アルコールで再び皮膚を消毒する。
8. 回復を促進するために加熱パッドの上にマウスを置きます。手術後最初の3日間、ブプレノルフィン(0.1mg/kg、q12h)腹腔内注射を行う。
9. 意識回復時に、12時間の明暗サイクル室でマウスをケージに戻します。
10. 上記の手順と同一の、収縮なしの恥の手術を行う(ステップ3.5)。
11. 上記のすべてのステップと同じシルク縫合糸群の手術を行いますが、ステップ1.2では5-0シルク縫合糸を使用します。

4. 結紮と測定の成功の心エコー評価

1. 手術後の日(D)7に対して心エコー評価を行う。
2. 誘導のための吸入を通して3%のイオブルラン、および0.5-1 L/min酸素流量で麻酔の深さを維持するために1.5%でマウスを麻酔します。
3. マウスをプラットフォーム上の上の位置に置き、37°Cに維持し、その手足を電極にテープで貼ります。
4. 脱毛クリームで胸の毛を取り除き、マウスの胸部に超音波カップリング剤を塗布します。
5. 30MHzプローブで横大動脈収縮を評価します。
   1. プラットフォームを左端に傾けます。プローブを垂直位置に保ち、胸部の右寄尾翼線に沿って下げます。次に、大動脈のアーチがはっきりと見えるまで、BモードでX軸とY軸を操作します。
   2. Bモードで狭窄を見つけて大動脈アーチビュー¹¹を得る。カラードップラーモードとパルス波を使用してピーク流速を測定し、TACグループとして3,000mm/s以上の速度を持つマウスを選択します(値は予備実験に基づいています)。
   3. ベルヌーイの方程式¹¹の修正版に従って圧力勾配を計算する:
      圧力勾配 = 4 x V_max².
      注: 横方向の大動脈収縮モデルの理想的な圧力勾配は 40 ~ 80 mmHg¹¹から範囲です。
   4. Cine ストアとフレーム ストアを使用して、データと画像を保存します。
6. 30 MHz プローブで左心室(LV)の寸法と収縮性を評価します。
   1. プラットフォームを水平位置にリセットします。左寄縁線に対して、プローブを反時計回りに30°に保ちます。
   2. Bモードを使用し、XとYを操作して、心臓の明確で全長の軸図を得ます。
   3. Mモードを押して、インジケータラインを表示します。後でLVチャンバー寸法、分数短縮、LV壁厚を測定するために、Cine Storeとフレームストアで画像を取得します。
7. 一度行われた, イソファラン吸入を停止し、マウスが麻酔から回復することができます.その後、12時間の明暗サイクルルームでケージに動物を戻します。
8. 手術後のD14とD28では、上記の手順を繰り返して心臓パラメータを測定し、組織学的研究のために心臓を収穫します。

Results

本研究では、45匹のマウスを無作為に、シャム、シルク縫合糸群、および吸収性縫合グループ(D0(ベースライン)、D14、D28後の各群の数をそれぞれ15、10、および5に分割した。手術後のD7、D14、D21、およびD28では、収縮したピーク速度を心エコー検査によって決定した。吸収性の縫合糸を使用して大動脈弓を収縮させたにもかかわらず、TACの後の第2週に収縮時の血流速度は依然として3,000mm/sを超えていることがわかった(図1A)。また、吸収性縫合材群の収縮時の圧力勾配は2週間で40mmHg以上に維持された(図1B)。興味深いことに、手術後の第4週には収縮はなく、吸収可能な縫合糸が完全に吸収されたことを示している。

また、末側-拡張期の左心室後壁厚が増加し、末側-拡張期の左心室内径がTAC後のD14でわずかに減少したこともわかりました(図2A-C)。興味深いことに、吸...

Discussion

心臓非虚血予備調整には、依然として非常に未踏の領域があります。これまでの研究に基づき、吸収性縫合糸を使用して心筋肥大プリコンディショニングモデルを改善することに切り替えました。

以前の報告では、多くの研究者がシルク縫合糸を使用して大動脈弓^{8、14、15を}収縮^{させました}。シルク縫合糸は容易に入手でき、しばしば外科的創傷縫合糸、組織結紮、および組織固定に使用された。このプロトコルでは、最初の TAC のシルク縫合糸を吸収可能な縫合糸に置き換えました。収縮中の血流速度は依然として3,000mm/s以上に達し、2週間続き、長期的な肥大刺激として十分であることがわかりました。その後、D28 のベースラインに戻ります。しかし、吸収性縫合糸の吸収時間を制御することは困難である。吸収時間は、吸収性縫合糸の材料とバッチ、組織の適応性、収縮時の圧迫度に関連しています。先に、収縮が厳しく、吸収時間が少ないことがわかりま...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
吸収性縫合糸 (5-0)	山東カンリダメディカルプロダクツ株式会社	5-0	結紮
動物超音波システム VEVO2100	ビジュアルソニック	VEVO2100	心エコー検査
冷光イルミネーター	オリンパス	ILD-2	ライト
ヒートパッド - サーモスタット手術システム (ALC-HTP-S1)	上海アルコット バイオテック CO	ALC-HTP-S1	暖房
イソフルラン	RWDライフサイエンス	R510-22	吸入麻酔
Matrx VIP 3000 イソフラン気化器	ミッドマークコーポレーション	VIP 3000	麻酔
医療用ナイロン縫合糸 (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	皮膚を閉じる
ペントバルビタール ナトリウム塩	メルク	25MG	麻酔
精密電子天秤	デンバーインスツルメント	TB-114	計量センサー
自作スペーサー			25ゲージ針
シルク縫合糸 (5-0)	揚州元康医療機器有限公司	5-0	結紮
小動物マイクロサージェリー機器	Napox	MA-65	手術器具
トランスミッション ゲル	広公甚	250ML	心エコー検査
Veet脱毛クリーム	レキットベンチザー	RQ/B 33 タイプ2	マウスの毛髪を除去
縦型自動電熱圧力蒸気滅菌器	合肥華泰医療機器有限公司	LX-B50L	手術器具の自動クリーニング