方法論記事

潜在的エピジェネティックマーカーのトップダウン質量分析プロファイリングのためのソルガム葉組織からのヒストンの分離

DOI：

10.3791/61707

⸱

2021年3月4日

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1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2DOE-Joint Genome Institute, Lawrence Berkeley Laboratory, 3Kearney Agricultural Research and Extension Center, University of California Agriculture and Natural Resources, 4West Side Research and Extension Center, University of California, 5Department of Plant Sciences, University of California, Davis, 6Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、エンジニアリングの干ばつ耐性作物を支援するための潜在的なエピジェネティックマーカーとして機能するヒストン翻訳後修飾のプロファイリングのために、ソルガム葉材料から無傷のヒストンを効果的に抽出するために開発されました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒストンは真核生物中の高度に保存されたタンパク質のファミリーに属しています。彼らはクロマチンの機能的単位としてDNAをヌクレオソームに詰め込む。ヒストンのトランスレーショナル後修飾(PTM)は、非常に動的で、酵素によって追加または除去され、遺伝子発現を調節する上で重要な役割を果たします。植物では、ヒストンPTMを含むエピジェネティック要因は、環境に対する適応応答に関連しています。エピジェネティックコントロールの分子メカニズムを理解することは、革新的なバイオエンジニアリングソリューションの前例のない機会をもたらすことができます。ここで、我々は、核を分離し、ソルガム葉組織からヒストンを浄化するプロトコルを記述する。抽出されたヒストンは、トップダウン質量分析(MS)とオンライン逆相(RP)液体クロマトグラフィー(LC)を組み合わせることで、無傷の形態で分析することができます。同じヒストンプロテオーフォーム上の複数のPTMの組み合わせおよび量合体測定は容易に同定することができる。さらに、ヒストンテールクリッピングは、トップダウンLC-MSワークフローを使用して検出することができ、したがって、コアヒストン(H4、H2A、H2B、H3)のグローバルPTMプロファイルを生成します。我々は、以前にこのプロトコルを適用して、干ばつ抵抗性のエピジェネティックマーカーを同定することを目的とした大規模なフィールドスタディから採取したソルガム葉組織からのヒストンPTMをプロファイリングした。このプロトコルは、クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP-seq)、または同様の植物でヒストンPTMを研究するために適応され、最適化される可能性があります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

干ばつの深刻度と頻度の増加は、穀物作物1、2の生産性に影響を与えると予想される。ソルガムは、水を制限する条件3、4に耐えるその例外的な能力のために知られている穀物の食糧とエネルギー作物です。我々は、干ばつストレス、植物の発達、およびソルガム[ソルガム二色(L.)Moench]植物のエピジェネティクス間の相互作用の機械学的理解を追求している。我々の前の研究は、植物と根球微生物叢との間の強い関係を、干ばつ順応と分子レベル5、6、7での応答で実証した。この研究は、将来の気候シナリオに作物を適応させる上でエピジェネティック工学を利用する道を開く。エピジェネティクスの理解の一環として、植物生物の遺伝子発現に影響を与えるタンパク質マーカーの研究を目指しています。

ヒストンは、真核生物中のタンパク質の高度に保存されたファミリーに属し、DNAをクロマチンの基本単位としてヌクレオソームに詰め込みます。ヒストンの翻訳後修飾(PTM)は、クロマチン構造を制御し、遺伝子発現に影響を与えるために動的に調節される。DNAメチル化を含む他のエピジェネティック因子と同様に、ヒストンPTMは多くの生物学的プロセス8,9において重要な役割を果たす。ウエスタンブロットなどの抗体ベースのアッセイは、ヒストンPTMを同定し定量するために広く使用されてきました。さらに、ヒストンPTMsとDNAの相互作用は、クロマチン免疫沈降法(ChIP-seq)10によって効果的にプローブすることができる。ChIP-seqでは、特定の標的ヒストンPTMを有するクロマチンは、その特定のPTMに対する抗体によって濃縮される。次いで、DNA断片を濃縮クロマチンから放出し、配列することができる。標的ヒストンPTMと相互作用する遺伝子の領域が明らかになる。しかし、これらの実験はすべて、高品質の抗体に大きく依存しています。いくつかのヒストン変異体/ホモログまたはPTMの組み合わせでは、堅牢な抗体の開発は非常に困難な場合があります(特に複数のPTMの場合)。さらに、抗体は、標的ヒストンPTMが既知である場合にのみ開発することができる。11したがって、ヒストンPTMの対象を絞り込みずグローバルプロファイリングを行うための代替方法が必要です。

質量分析(MS)は、ヒストンPTMを特徴付ける相補的な方法であり、抗体が利用できない未知のPTMを含む11,12。よく確立された「ボトムアップ」MSワークフローは、液体クロマトグラフィー(LC)分離およびMS検出前にタンパク質を小さなペプチドに消化するためにプロテアーゼを使用します。ヒストンは、塩基性残基(リジンとアルギニン)が多いため、標準的なボトムアップワークフローにおけるトリプシン消化(リジンおよびアルギニンに特異的なプロテアーゼ)は、タンパク質を非常に短いペプチドに切り込みます。短いペプチドは、標準的なLC-MSによる分析が技術的に困難であり、複数のPTMの接続性および量論に関する情報を保持しません。他の酵素または化学標識を使用してリジンをブロックすると、ヒストンPTMs13,14の特性評価に適した長いペプチドが生成される。

あるいは、消化ステップを完全に省略することができる。この「トップダウン」アプローチでは、インタクトプロテインイオンは、オンラインLC分離後にエレクトロスプレーイオン化(ESI)によりMSに導入され、インタクトヒストンプロテオフォームのイオンを生み出します。さらに、目的のイオン(すなわち、プロテオフォーム)を、質量分析計で単離および断片化して、同定およびPTM局在化のために配列イオンを得ることができる。したがって、トップダウンMSは、プロテオフォームレベルの情報を保持し、同じプロテオフォーム15、16上の複数のPTMおよび端末切り捨ての接続性を捕捉する利点を有する。トップダウン実験は、定量的な情報を提供し、インタクトプロテインレベル17でバイオマーカーの洞察を提供することもできます。本明細書では、ソルガム葉からヒストンを抽出し、トップダウンLC-MSによって無傷のヒストンを分析するプロトコルについて述べている。

図1と図2に示すサンプルデータは、植え付け後の第2週に収集されたソルガム葉から取得したものです。収量の変動が予想されるが、このプロトコルは一般に特定のサンプル条件に対して無依存である。同じプロトコルは、植え付け後2、3、5、8、9、および10週間から採取されたソルガム植物葉組織に対して正常に使用されています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ソルガム葉材の準備

注:ソルガム植物は、パリエ、CAのフィールドの土壌で栽培されました。

  1. 植物から50 mL遠心分離チューブにソルガムの葉を収集し、すぐに液体窒素でチューブを凍結します。第一耕耕使用機から3番目と4番目の完全に浮かんだ葉を引き裂くことによって葉組織を収集する。
    注: フィールド条件、サンプルの増加、および収集の詳細については、公開されたレポート18を参照してください。
  2. 液体窒素で葉を粉砕し、すぐに遠心分離管に移します。
  3. 使用するまで-80°Cで挽いた葉を保管してください。各サンプルのヒストン分析のために約4gのクライオグラウンドリーフパウダーを取ります。

2. バッファーと材料の準備 (3 - 4 時間)

注:高濃度のストックソリューションは、事前に作ることができ、使用するまで保存することができます。しかし、すべての作業バッファーは、抽出の日に新鮮にする必要があります (ストックからの希釈と他の内容との混合によって) プロセス中に氷の上に配置します。特に推奨されない限り、実験全体を4°Cで行う必要があります。

  1. 連続撹拌しながらガラス容器に15mLの無菌水をヒートプレートに42.8gのスクロース(342.30 g/mol)で溶解して2.5Mスクロースを調製します。ショ糖が完全に溶解したら、ボリュームを50 mLに上げてください。スクロースは使用するまで4°Cで保管してください。
  2. 15 mL遠心分離管に1.576 gのトリスHClを10mLのH2Oで溶解して1MトリスpH8を調製します。NaOHでpHを8に調整し、pH紙で確認します。使用するまで4°Cで保管してください。
  3. DTT(154.25 g/mol)の231mgを秤量し、1.5mLの滅菌水に溶解して1Mジチオスレイトール(DTT)を調製します。DTTは新鮮にするか、保存された冷凍アリコートを使用する必要があります。
  4. (オプション)3種類の塩を混合して追加の阻害剤を調製します。18.38 mgのオルトバナジン酸ナトリウム(183.91 g/mol)を1mLの無菌水に調製し、1mLの無菌水に11.008mgのブチル酸ナトリウム(110.09 g/mol)を加えて別々にブティレートナトリウムを調製します。フッ化ナトリウム 4.199 mg (41.99 g/mol) を 1 mL の水に加えて、最終塩を調製します。3つの塩溶液を「追加阻害剤」(3つの化学物質のそれぞれ33 mM)のストック溶液として等量で混合します。
    注:バナデートナトリウムは、中性pHの下で0.1 mMより高い濃度で重合します。バナデートナトリウムを活性化し、公表されたプロトコル19に続いて最大の有効性を得るためにそれを非重合することをお勧めします。あるいは、活性化されたバナデートナトリウムが市販されている。本明細書において、バナデートナトリウムは意図的に活性化されなかったため、効能は低下しない。バナデートナトリウムはまだこのプロトコルについてテストされていません。
  5. 15 mL 遠心分離管に10mLのH2Oで0.952 gの無水塩化マグネシウム(95.2 g/mol)を溶解してMgCl2を1M調製します。1 M MgCl2は使用するまで 4 °C で保管してください。
  6. トリトンX-100の53.5 gと35mLの無菌水を混合して10%(v/v)トリトンX-100を調製し、水で50mLまで持ち込み、室温で保存します。
  7. 少なくとも一晩で樹脂のコンディショニングに使用される5%グアニジンバッファーpH7(「Gdnバッファ」と呼ばれる)を準備する - K2HPO4の870 mgを計量し、50 mLの無菌水と貯蔵°Cで溶解することによって0.1 Mリン酸水素二塩基(K2HPO4)を調製する。
  8. 0.7gのグアニジン塩酸塩を秤量し、0.1 M K2HPO4で最終体積14 mLに溶解する。pH用紙でチェックしてpHを7に調整します。
  9. 乾燥弱カチイオン交換(WCX)樹脂をグアニジン緩衝液pH 7に一晩浸漬する。上清を取り除き、新鮮な5%Gdnバッファーで再充填し、樹脂が完全に平衡化されるように一晩浸します(上清が元のバッファーと同じpHを持つまで)。
  10. 次のセクションで実験を開始する前に、表 1に基づいてEB1、EB2A、およびEB2Bバッファを作るために試薬を混合します。使用直前に新鮮なすべての阻害剤とDTTを追加します。
試薬在庫集中EB1EB2AEB2B
ボリューム (mL)ボリューム (mL)ボリューム (mL)
ショ糖2.5M4.41.250.5
トリス HCl pH81M0.250.1250.05
Dtt1M0.1250.06250.025
H2O20.2259.68754.375
プロテアーゼ阻害剤(PI)錠剤0.5ピル0.5ピル0.5ピル
追加阻害剤(オプション)33mM0.250.1250.05
MgCl2 1M0.1250.05
トリトンX10010%1.25
全体のボリューム25 mL12.5 mL5 mL

表 1: 抽出バッファー (EB) の構成。

  1. 表 2に基づいて核のリシス バッファー (NLB) を作成します。事前にNLBを準備し、使用するまで4°Cで保管してください。使用直前に1x(5 mLあたり0.5錠)で新鮮なPI錠剤を追加します。特定のボリュームについては、表 2を参照してください。
Nlb在庫集中ボリューム (mL)
塩化 ナトリウム5M0.4
トリス HCl pH81M0.05
トリトンX10010%0.5
Edta0.5M0.2
H2O3.85
PI錠0.5ピル
追加阻害剤(オプション)33mM0.05
全体のボリューム5 mL

表2:核リシス緩衝液(NLB)の組成。

3. 核分離手順

注:最初の日のステップ3.1-3.3を実行し、NLBバッファに-80 °Cで核を保存し、タンパク質精製のために翌日(またはそれ以降)を再開することをお勧めします(4時間)。このプロトコルの核分離ステップは、共同ゲノム研究所で使用されているソルガムChIP-seqプロトコルから適応された。追加の、ChIP-seqアプリケーションの核純度を確保するために、追加のウッシュおよびスクロース勾配分離が必要な場合があります。

  1. デブリの濾過(約0.5時間)
    1. 挽いた葉の粉末〜4gを秤量し、ドライアイスまたは液体窒素の上に置いて凍結したままにして、使用できる状態になるまで確保します。
    2. 0.2x(0.5錠剤、1サンプル当たり25mL)の最終濃度にEB1にプロテアーゼ阻害剤錠剤を添加します。バッファーに追加する前に、マイクロ遠心分離チューブ内の錠剤をプレクラッシュするためにミニチュアプラスチック害虫またはピペットチップを使用して、バッファー内の錠剤の溶解を支援します。材料の損失を防ぐために、PIタブレットを追加し、錠剤を溶解するためにバッファを超音波処理します。
    3. 冷凍挽いた葉の粉末に20mLのEB1を加え、穏やかに渦を加え、粉末が完全に懸濁するまで混ぜます。10分はやさしく混ぜ続けます。
    4. メッシュ100を通してフィルターし、フィルタされた材料を2mLのEB1を毎回リンスする。
      注: 濾液とフィルタされた破片の両方が緑色である必要があります。顕微鏡を用いて追跡する場合、この時点で濾液中の無傷の核および無傷の葉芽体を見ることができるはずです。大きな破片の大部分は不在/枯渇するべきである。メチレンブルーなどの染料をサンプルと混ぜます。20x、40x、および/または100xの目的を使用して視覚化すると、核は直径〜3〜5μmの濃い青/アクアマリン球として容易に観察できます。核に対しては、葉緑体の大きさは似ていますが、色は緑が多く、楕円形になることがよくあります。真空胞は核の大きさや形状にも似ていますが、メチレンブルー染料を容易に取り込むものではありません。
    5. 3,000 x g で結合濾液を4°Cで10分間、ペレットデブリや大きな細胞内小器官(核および葉芽細胞を含む)に遠心分離する。
      注:このスピン中にEB2Aを準備することをお勧めします(ステップ3.2.1を参照)。
    6. 上清をデカントし、ペレットを乱さないよう注意する。
      注:洗剤はまだ追加されていないので、ペレットは濃い緑色のままで、上清はせいぜい淡い緑色/黄色でなければなりません。
  2. 非標的小器官のリシス(約0.5時間)
    1. 0.4x(12.5 mL EB2Aあたり0.5錠)の最終濃度にプロテアーゼ阻害剤を添加してEB2Aを調製します。
    2. ステップ3.1.6からEB2Aの5 mLでペレットを再懸濁し、穏やかな混合で10分間氷の上でインキュベートします。
      注:洗剤濃度は、核ではなく、インタクトな細胞と葉巻を優先的に取り立てに最適化する必要があります。必要な量は、生物によって異なる場合があります。顕微鏡下での葉芽細胞のリシスと無傷の核の保持を確認することをお勧めします。
    3. 2,100 x g でペレットデブリおよび核に振るバケツローターで4°Cで15分間の遠心分離機。
      注:この段階では、上清は濃い緑色にする必要があり、葉緑体の溶菌と葉緑の放出がサイトゾルに放出するため、ペレットは前の段階で観察されたよりもはるかに緑色にする必要があります。
    4. 上清をデカントし、ペレットを乱さないよう注意する。
  3. 残りの細胞質汚染物質からの核の単離(〜0.5時間)
    1. 1xの最終濃度にプロテアーゼ阻害剤を加えることによって、EB2Bを調製します(5 mL EB2Bあたり0.5錠)。
    2. EB2Bの2mLのステップ3.2.3から粗核ペレットを再懸濁する。
      注:EB2BにはTriton X-100が含まれていないため、この時点で追加のリシスは発生しません。
    3. 2,100 x g でペレットデブリおよび核に振るバケツローターで4°Cで15分間の遠心分離機。
      注:小さな小器官および細胞質成分はペレットであってはならないので、上清に残るべきである。
    4. 上清をデカントし、ペレットを乱さないよう注意する。
    5. 250 μLのNLBを使用してペレットを再懸濁します(0.5 プロテアーゼ阻害剤錠剤を 5 mL にフレッシュに追加します)。
      注: 目標は、物質の損失を抑えて、最小量の NLB で核を再中断することです。NLBは非常に粘性があり、ペレットは不溶性の破片を多く含んでいるため、ピペットが非常に困難で、ピペットチップの内側にしがみつく傾向があります。このため、可能な限り同じピペットチップを再利用することをお勧めします。ピペットチップの残留材料に関係する場合は、チップの開口部で重力が材料を収集できるように、1分間、棚またはラックからピペットを吊り下げてください。ペレットを再懸濁させるために積極的にピペットしないでください。代わりに、ペレット化された材料がピペット先端に吸引されるまで、ピペットチップを攪拌棒として使用します。すなわち、大きなペレットの塊がピペットチップに引き込まれる限り、この段階にとどまるのは完全に問題ありません。
    6. 最大で渦15sは均質化し、部分的に材料を再懸濁する。4°Cで5分間ソニッケートし、-80°Cで保管してください。
      注:以降のステップでは、NLBの合計添加量は250 μLですが、サンプルの総見かけ量は不溶性の破片のために最大2倍になることに注意してください。サンプルは凍結され、核のリシスを助けるために解凍される。
  4. 核リシスとヒストン抽出(〜4時間)
    1. 解凍したサンプルに、5%Gdnバッファの750 μLを加えます。4 °Cで15分間のソニッケート。
    2. サンプルを1本の2mLチューブに移し、10,000 x g を4°Cで10分間回転させます。
      注: 上清は緑色に見える可能性があります。以下のクロマトグラフィーのステップは、タンパク質からほとんどの顔料を除去する必要があります。
    3. ステップ 3.4.1 および 3.4.2 で待機している間に、イオン交換クロマトグラフィーのクリーンアップ用にカラムを準備します。2 mLのアセトニトリルと4 mLの水でクロマトグラフィーカラムをすすいで、表面の汚染を最小限に抑えます。
    4. 200~300 μL の WCX 樹脂(5% Gdn バッファーで事前に調整)をクロマトグラフィーカラムに積み込みます。樹脂を落ち着かせてください。5%Gdnバッファーの1 mLで4回洗浄してください。残りの精製工程では、チューブとカラムを氷の上に置いておきます。
    5. クロマトグラフィーカラムを2 mLのコレクションチューブに載せなさい。ステップ3.4.2の上澄みを樹脂のベッドにゆっくりと積み込みます(チューブの側面からゆっくりと落とすようにしてください)。溶液を重力で流しましょう。溶液が流れ出る中、溶出液をカラムの上部に6~8回戻し、樹脂への最大結合を可能にします。次に、溶出を破棄します。
    6. 5%Gdnバッファーの2 mLをロードして、非ヒストンタンパク質をカラムから洗い流します。溶出を破棄します。
    7. 1 mL 20% Gdn バッファーを持つエルテヒストン。ヒストンタンパク質を含む溶出物を収集します。
    8. 3 kDaの分子量カット(MWCO)スピンフィルター(0.5 mL)を使用して、ステップ3.4.6から溶離液を脱塩します。使用前に、500 μL洗浄溶剤(3%ACNで0.2%のギ酸)をロードし、それを2回回転させてフィルターを洗浄します。
      注:MWCOフィルタの洗浄を開始し、樹脂クロマトグラフィーの手順を実行して時間を節約することをお勧めします。次のスピンフィルターのステップは~3~4時間かかります。
    9. ヒストンサンプルの最初の負荷500 μL、~25分間14,000 x g で回転し、体積を~100 μLまで下げます。その後、さらに400 μLのサンプルをロードし、14,000 x g で再び約 25 分間スピンします。サンプルの最後の100 μLをロードし、300 μLの洗浄溶媒でサンプルチューブを洗い流し、溶媒をフィルターにロードします。14,000 x g で再び約 25 分間スピンします。
    10. 400 μL洗浄溶剤をロードし、14,000 x g で~25分間回転し、体積を~100μL以下に減らします。各サイクルは、塩濃度を5分の1に減少させます。さらに3サイクル繰り返し、グアニジン濃度を〜0.01%にします。フィルターをクリーンなコレクションチューブに逆にし、1,000 x g で 2 分間スピンします。精製ヒストンサンプルを-20°Cまたは-80°Cで保存して分析します。
      注: 最後のステップで長く回転(30~40分)、サンプルの体積を最小限に抑えて高濃度を得ることをお勧めします。ボリュームは50~70 μLまで下がることができるはずです。

精製ヒストンの質量分析

  1. 液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)データ取得
    1. メーカーのプロトコルに従って、ビチンチオン酸(BCA)アッセイによりタンパク質濃度を推定します。
      注: BCA は総タンパク質濃度の推定値のみを提供できますが、ヒストン精製の品質は提供できません。MSインストルメンテーションがヒストン精製の品質を確認するために容易に利用できない場合は、ウェスタンブロットを使用することができます。前の報告で説明したように210nmの紫外線吸光度検出と結合した逆相LCも20.20を用いることができる。クロマトグラムは、サンプルの品質をチェックするための既知の標準と比較することができます。しかし、異なる生物は異なる溶出プロファイルを有することができる。したがって、同様の生物からのヒストン標準を使用することを強く推奨します。
    2. C18逆相(RP)分析カラム(例: 3 μm 300 Å、カラム内径75μm、外径360μm、長さ70cm)およびC18トラップカラム(例えば、3.6 μm、カラム内径150μm、外径360μm、長さ5cm)をデュアルポンプナノフロー液体クロマトグラフィーシステム(e.g.、WatersAc NanoAc)に対して行う。バイナリ溶媒はA:水中の0.1%のギ酸、B:アセトニトリル中の0.1%のギ酸である。
      注:デュアルポンプLCには、洗浄ポンプと勾配ポンプが含まれています。両方のポンプは、各解析の 2 つの段階を経て、トラップ 段階と分析段階を行います。トラップ段階では、洗浄ポンプがトラップカラムに流れ込み、勾配ポンプが分析カラムに流れ込みます。分析段階では、トラップ列が分析列と結合され、勾配ポンプが両方の列に流れます。洗浄ポンプは、その後、廃棄物に行きます。
    3. トラップ段階:最初にヒストンサンプルの1~2μgをトラップ列にロードするようにLCメソッドを設定します。洗浄ポンプでサンプルを3μL/min 5%溶媒Bで10分間脱塩します。分析ポンプを平衡化用に0.3 μL/min 5%の溶媒Bにセットします。
    4. 分析段階:勾配ポンプ(0.3 μL/min)を5%Bから始め、15分で30%にランプを設定します。その後、100分で41%Bに増加し、最後に95%Bまでの高い有機洗浄を行います。
      注: グラデーションは、個々の列の保持プロファイルに応じて最適化できます。通常、全長のヒストンは、指定されたLC条件で30~40%B前後で溶出します。より長い勾配は、より多くのヒストンプロテオフォームをキャプチャするためにMS2スペクトルの数を増加させるために使用することができます。
    5. 電子転写解離(ETD)機能を備えた高解像度MS(例えば、サーモオービット・フュージョン・ルモス等)でデータ依存的な取得方法を設定します。インタクトプロテインモードを使用し、製造元が提案したとおりに必要なすべてのキャリブレーションを実行します。重要なパラメータは以下のとおりです。これらは使用する機器に固有のものです。
      1. MS1:スキャン範囲600~2,000 m/z、解像度 120k(m/z 200)、4マイクロスキャン、AGCターゲット1E6、最大注入50ms。
      2. MS2: 解像度 120k;1マイクロスキャン;AGCターゲット1E6;データ依存MS/MS:ETD(25ms反応時間、最大射出時間500ms)および高エネルギー衝突解離(HCD、28%の正規化された衝突エネルギー、±5%のステップエネルギー、最大注入時間100ms)0.6 Daの分離ウィンドウ。最高充電状態の優先順位。
      3. 動的除外: 120 s タイム ウィンドウ、±0.7 Da マス ウィンドウ。5 より低い充電状態と未定の請求状態を除外します。
    6. 実際のサンプルを実行する前に、新しい列にペプチドまたはヒストン標準のいくつかの注射を実行して平衡化し、システムをチェックします。多数のサンプルを実行する場合は、サンプル間に短いブランクまたはスッシュを追加して、持ち越しを最小限に抑えます。次のサンプルの前に、開始条件(5%溶媒B)でカラムを15~20分間平衡させます。
      注:長いLC勾配とMS2のためのより高い最大注入時間は、より多くのヒストンプロテオフォームを識別するためのスペクトル品質を向上させることができます。
  2. LC-MSデータ処理とプロテオフォームの同定
    1. (ソルガム)タンパク質配列を、JGI(https://genome.jgi.doe.gov)またはユニプロト(https://www.uniprot.org/)からFASTA形式で取得する。
    2. MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) を使用して、計測器の生データ ファイル (*.raw) を mzML 形式に変換します。
    3. データ処理用の TopPIC スイート22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) をダウンロードします。プログラムは、コマンド ラインまたはグラフィカル インターフェイスを使用して実行できます。
    4. TopPIC スイートの TopFD を使用して、ステップ 4.2.2 から、mzML ファイルからスペクトルをデコンボルテージします。デフォルトのパラメータを使用できます。ただし、狭い分離ウィンドウが使用されるため、「前駆体ウィンドウ」(-w) を 1 m/z に縮小する必要があります。
    5. プロテオフォームを識別するには、TopPIC スイートで TopPIC を使用します。既定のパラメーターのほとんどは使用できます。スペクトルとプロテオフォームカットオフタイプをFDR(検出率偽)に設定し、カットオフ値を0.01(1%FDR)または必要に応じて設定します。「プロテオフォーム誤差許容誤差」を5(ダルトン)に設定します。手順 4.2.1 から FASTA ファイルをロードし、ステップ 4.2.4 から "*_ms2.msalign" ファイルを読み込みます。次に、検索を開始します。
      注:「プロテオフォーム誤差耐性」設定は、同様の質量(±5 Da)を持つプロテオフォームを1つとして組み合わせます。これにより、プロテオフォーム数の冗長性を低減できます。ただし、大きな許容差は小さいか、または全く質量差のないプロテオフォームをマージするので、注意して使用する必要があります。このパラメータは、TopPIC バージョン 1.3 以降でのみ使用できます。
    6. 同定されたプロテオフォームは、出力の「*_html」フォルダの下にあるTopviewモジュールを使用して、"*_proteoform.csv"ファイルで調べることができます。
    7. TopPICを使用して上記のステップから生成されたプロテオフォームリストは、ヒストンPTMに質量シフトとしてアノピンを付けます。個々の PTM をローカライズするには、修正リストを含める必要があります。詳細な説明は、TopPIC マニュアルを参照してください。あるいは、次のステップに進み、情報に基づくプロテオミクスパッケージ23(https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics) を使用して補完的なデータ分析を行う。
    8. 指示に従い、PbfGenモジュールを使用して、計測器の生データをPBFファイルに変換します。次に、ProMex モジュールを使用して MS1 データをデコンボルトして ms1ft ファイルを出力します (機能リスト、各機能は質量と保持時間の一意の組み合わせを表します)。
    9. ステップ4.2.6でTopPICから同定されたタンパク質リストを使用して、情報に基づいたプロテオミクス用の焦点を合わせるFASTAを作成します。
      注:多数の可変PTMを使用して、情報プロテオミクスを使用してゲノム全体を検索すると、非常に遅く、クラッシュを引き起こす可能性があります。したがって、標的タンパク質のみを含めることによってFASTAのサイズを小さくすることが推奨される。
    10. サンプル ファイルの形式に従ってヒストン PTM を検索する対象変更リストを作成します。含まれる一般的なPTMは、リジンアセチル化、リジンモノメチル化、リジンジメチル化、リジントリメチル化、セリン/スレオニン/チロシンリン酸化、タンパク質N末端アセチル化、メチオニン/システイン酸化である。ソルガムの場合、タンパク質N末端モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化を加える必要があります。
      注: 情報に基づいたプロテオミクスは、リストで指定された PTM のみを検索します。不特定のPTMが存在する場合、プロテオフォームは同定されず、または他のプロテオフォームに誤認され得る。ただし、検索時間を最小限に抑えるために PTM リストはできるだけ短くする必要があります。
    11. ステップ4.2.8のファイル、ステップ4.2.9からの焦点を合わせるFASTA、およびステップ4.2.10からの修正リストを使用してプロテオフォームを識別するためにMSPathFinderモジュールを実行します。デフォルトのパラメータを使用できます。
    12. すべての結果ファイルをロードすることで、結果を LcMsSpectator で視覚化できます。
      注:他のバイオインフォマティクスツールは、独自の強み24、25、26、27、28を持つトップダウンデータを処理し、視覚化するために利用可能です。ソルガムおよび他の多くの生物は、データベース内のヒストンPTMに関する既知の情報を制限している。最初に TopPIC を使用して、PTM からの質量シフトを識別します。この分析は、既知の PTM と未知の PTM の両方を容易に検出できます。次に、検出された PTM を、TopPIC で PTM リストを指定するか、他の補完的なツールを使用して、ターゲットを絞った方法で検索できます。

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結果

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プロトコルに従って、ヒストンを抽出し、LC-MS 分析を使用して識別できます。生データと処理結果は、アクセスを介して MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) で入手できます: MSV000085770。代表的なサンプル(MassIVEからも入手可能)のTopPIC結果に基づいて、303ヒストンプロテオフォーム(106 H2A、72 H2B、103 H3、および22 H4プロテオフォーム)を同定しました。共精製リボソームプロテオフォームも検出されており、LCの初期に溶出するのが一般的です。それらは通常、同定されたプロテオフォームの約20%から成るが、LC勾配の後の段階で溶出するヒストンプロテオーフォームと重複しない。最新のTopPICまたは情報に基づいたプロテオミクスパッケージで、結果を簡単に視覚化できます。デモでは、生のMSファイルを直接ロードし、プロテオフォームの同定を手動で調べることができる情報プロテオミクスパッケージを使用してデータビジュアライゼーションに焦点を当てます。両方のソフトウェアパッケージは異なるアルゴリズムとパラメータを使用していることに注意してください。報告されたプロテオフォームの数は...

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ディスカッション

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提示されたプロトコルは、ソルガムの葉(またはより一般的には植物葉)サンプルからヒストンを抽出する方法を説明します。ヒストンの平均収量は、4~5gのソルガム葉材料あたり2〜20μgと予想されます。材料はLC-MSによる下流ヒストン分析のために十分に純粋である(ほとんどが約20%リボソームタンパク質汚染を有するヒストン)。低い収率は、サンプルの変動、またはプロトコル全体での誤った取り扱い/障害の可能性のために得られる可能性があります。核のリシスステップの前に核の完全性を維持することは重要です。したがって、積極的な渦とピペッティングは、NLBを追加する前に避けるべきです。また、ペレットから上清を除去する際に核の喪失が起こる。ピペットの際にペレットを破壊しないように注意する必要があります。トリトンX-100濃度1%を、非標的オルガネラを選択的にリセアするように最適化したが、核は選択的に取り除かないようにした(ステップ3.2)。他の組織や生物に最適な洗剤濃度は異なることがあり、実験的に決定する必要があります。濾過プロセス中の上清の色変化は、葉緑体の非効率的な放出や葉の粉砕の不十分な粉砕などの潜在的な問題を示している可能性があります。可能であれば、...

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謝辞

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大量分析実験を支援してくれたロナルド・ムーアとトーマス・フィルモア、データ沈着に対するマシュー・モンローに感謝します。この研究は、米国農務省(USDA;)から、ソルガム(EPICON)プロジェクトにおける干ばつ反応のエピジェネティックな制御を通じた米国エネルギー省(DOE)生物環境研究からの助成金によって資金提供されました。CRIS 2030-21430-008-00D)、およびローレンス・バークレー国立研究所とDOEの間でDOE(契約DE-AC02-05CH11231)が主催する共同バイオエネルギー研究所(JBEI)を通じて。研究は、生物環境研究室が主催するDOE科学利用者施設事務所である環境分子科学研究所(EMSL)(grid.436923.9)を使用して行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセトニトリルフィッシャーケミカルA955-4L
ジチオスレイトール(DTT)シグマ43815-5G
EDTA、500mM溶液、pH 8.0EMD Millipore Corp324504-500mL
ギ酸サーモサイエンティフィック28905
ニジン塩酸塩シグマG3272-100G
MgCl2シグマM8266-100G
リン酸カリウム、二塩基性シグマP3786-100G
プロテアーゼ阻害剤カクテル、cOmplete 錠剤ロシュ5892791001
酪酸ナトリウムシグマ303410-5Gヒストン脱アセチル化酵素阻害剤
ナトリウム (NaCl)シグマS1888
ナトリウムに使用フッ化物シグマS7020-100Gホスファターゼ阻害剤に使用
トバナジン酸ナトリウムシグマ450243-10Gホスファターゼ阻害剤に使用
糖シグマS7903-5KG
トリスHClフィッシャーサイエンティフィックBP153-500g
トリトンX-100グマT9284-100ML
弱い陽イオン交換樹脂、メッシュ100-200 分析 (BioRex70)Bio-Rad142-5842
Disposables
クロマトグラフィーカラム (Bio-Spin)BIO-RAD732-6008
メッシュ 100 ろ布ミリポアシグマNY1H09000これは、植物核抽出用のシグマキット(カタログ#CELLYTPN1)の一部です。同じメッシュサイズの同様のフィルターを使用できます。
マイクロピペットチップ (P20, P200, P1000)シグマ
チューブ、50mL/15mL、遠心分離機、コニカルジェネシーサイエンティフィック28-103
、マイクロ遠心分離機、1.5/2mLシグマ
<ストロング>機器
分析天びんフィッシャーサイエンティフィ01-912-401
ビーカー(50mL –2L)
冷却付き微量遠心分離機フィッシャー・サイエンティフィック13-690-006
マイクロピペット
冷却付きスイングバケツ遠心分離機フィッシャー・サイエンティフィ
ボルテックフィッシャー・サイエンティフィック50-728-002
ウォーターバス ソニケーター フィッシャー・サイエンティフィ15-336-120
グア塩化オルショシチューブック ック ス ック

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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