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方法論記事

腰椎不安定性のマウスモデル

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DOI：

10.3791/61722

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2021年4月23日

 ,  ,  , 
1Spine Research Institute, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Integrative Medicine, Huashan Hospital, Fudan University

この記事について

サマリー

L3-L5棘間プロセスの切除、上頭およびスピン間靭帯、麻痺性筋肉の剥離による腰椎間椎間板変性マウスモデルを開発しました。

要約

椎間板変性(IDD)は、腰痛につながる一般的な病理学的変化である。病理過程を理解し、新薬を評価するためには、適切な動物モデルが望まれている。ここでは、手術後1週間からIDDを発症する、外科的に誘発された腰椎不安定性(LSI)マウスモデルを導入した。詳細には、麻酔下のマウスは、腰部皮膚切開、L3-L5棘プロセス暴露、麻痺性筋肉の剥離、プロセスおよび靭帯の切除、および皮膚閉鎖によって手術された。L4–L5 IVDが観測に選ばれました。LSIモデルは、初期段階でのエンドプレート内の空隙率および肥大による腰体IDDを開発し、椎間板容積の減少、中間段階でのパルポスの核の収縮、腰椎(L5)の骨損失を後段階で発症する。LSIマウスモデルは、強力な操作性、特殊な機器の要件、再現性、安価で比較的短い期間のIDD開発の利点を有します。しかし、LSI手術は、手術後最初の1週間以内に炎症を引き起こす外傷である。したがって、この動物モデルは、腰椎IDDの研究に適している。

概要

椎間板変性(IDD)は、老化や若者の多くの要因によって引き起こされる一般的に見られる1.IDDに苦しむ患者のための手術は、腰痛や運動障害を引き起こし、通常は後の段階で、または重症例で行われ、非ユニオンまたは感染症などの潜在的なリスクを有する2。理想的な非手術治療は、IDD機構の包括的な理解を必要とする。IDD動物モデルは、IDDのメカニズムとIDD治療の評価の研究のための重要なツールとして機能します。

大きな動物は、霊長類、羊、ヤギ、イヌ、ウサギなどのIDDモデルに、人間の解剖学的構造との類似性が大きく、椎間板(IVD)3、4、5、6、7、8のサイズの面で強い操作性のために選ばれました。しかし、これらの動物モデルは時間がかかり、コストがかかる9.マウスIVDは、アスペクト比の幾何学的測定に基づくヒトIVDの表現が悪く、パルポス核対ディスク面積比、および正規化高さ10。サイズの差にもかかわらず、マウス腰椎IVDセグメントは、圧縮およびトーション剛性11のようなヒトIVDに類似した機械的特性を示す。また、マウスIDDモデルは、低コスト、比較的短いIDD開発、および更なる機械学的研究12、13、14、15で利用される遺伝子組み換え動物および抗体のためのより多くの選択肢の利点を有する。

実験的に誘発されたIDDモデルは、インデューサーやアプリケーションとは異なります。例えば、コラゲラーゼ誘導細胞外マトリックス(ECM)変性は、ECM再生研究16に適している。遺伝子組換え表現型は、IDDプロセスおよび遺伝療法における遺伝子機能の研究に適している。アヌラス線維症切開および煙モデルは、外傷および非炎症誘発IDD12,18を模倣する。

脊髄不安定性(SI)は、平衡状態にあっては不調の不安定な脊柱を引き起こします。これは、靭帯や筋肉などの周囲の支持組織の弱さによる腰部運動セグメントの異常な動きによって引き起こされる可能性があります。脊髄融合後の手術19も一般的に見られる。SIはIDDの主な原因と考えられています。そこで、ヒトIDDプロセス20,21を模したSIマウスモデル(腰椎に焦点を当てた)の開発を目指す。

プロトコルでは、腰椎3番目(L3)を腰椎第5(L5)の切除によって腰椎不安定性(LSI)マウスモデルを確立する手順を、上腕および内棘靭帯と共に第5(L5)の脊椎プロセスを腰椎に設定する手順を導入した(図1A,B)。この動物モデルは、エンドプレート(EPs)の肥大および多孔性によって示されるように、手術後早くも1週間のIDDを発症する。IVD容積は、IDDの程度を示す増加したIVDスコアと共に、16週間を通じて手術後2週間減少し始める。詳細で視覚化された手順は、研究者が研究室でLSIマウスモデルを確立し、必要に応じてIDD研究に適用するのに役立つと考えています。

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プロトコル

記載された調査は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイドラインに準拠しており、上海伝統医科医科動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。すべての外科的操作は深い麻酔下で行われ、動物は処置の間のどの段階でも痛みを経験しなかった。

1. 前工程準備

  1. 器械の殺菌: 手術の前にオートクレーブ(121 °C 15分)の外科器具を蒸気殺菌する。金属容器に器具を詰め、手術に使用されるまで維持します。
  2. 手術プラットフォームのセットアップ:手術のために少なくとも60 cm x 60 cmのベンチ領域を割り当てる。75%のアルコールで表面を清掃し、使い捨ての医療用タオルで覆います。無菌の外科用器具パック、試薬、外科用アイテムを、領域の上部1/3内の使い捨て医療タオルの上に置きます。残りの2/3の領域を外科手術のために清潔にしておきます。熱サポートのための外科用パッドの下にホットパッドを追加します。
  3. 動物の準備
    1. 誘導室に動物(C57BL/6Jマウス、雄、8週齢)を入れます。イオフルランの誘導レベル4%、酸素用の4 L/分で気化器をオンにします。動物が完全に麻酔を受けた後、鼻コーンで麻酔薬を維持し、麻酔下で麻酔薬をイオブルランの場合は1.5%、手術中に酸素の場合は0.4 L/分のレベルで維持します。呼吸のために動物を監視します。
    2. クロルテトラサイクリン塩酸塩眼軟膏を塗布し、手術中の角膜乾燥を防ぎます。
    3. 小さな動物トリマーを使用して、下部胸部領域から仙骨領域の上部に側側表面の外科領域を剃る。剃った毛皮をティッシュワイプで取り除きます。
    4. 剃った部分に脱毛クリームを塗り、3分以下にしておきます。ガーゼでクリームを取り出し、0.9%の滅菌生理食いの2 mLで洗い流します。
    5. カスタムメイドの外科用円筒形パッド(図2A)をマウスの腹部の下に置き、腰椎を上げて手術を容易にします。

2. 腰部第3の光腰の第5(L3-L5)のスピンプロセスへの露出

  1. 人差し指を使って、より外側にある腰椎の皮下棘プロセスに触れ、胸椎と仙椎と比較して腰部領域を識別します。
  2. 75%アルコールを使用して皮膚をすすいでください。スカルペルブレードを使用して、中胸部領域から股関節までの木材領域上で3〜4cmの中線皮膚切開を行い、鼻隠しを露出させます。
  3. 棘の先端に挿入された後筋膜の形態によって腰椎を識別する。詳細には、第1の仙骨(S1)筋膜に第3腰椎(L3)は、その「V」形状によって他の筋膜とは異なる。最後の「V」チップは、第1の仙骨(S1)筋膜に接続し、最初の「V」先端はL3のスピンプロセスに対応する(図2B)。
  4. 両側のL3 からL5 までの棘の過程に沿って後部麻痺筋切開をメスの刃で横方向に作る(図2C)。出血を減らすためにファセットに向かって切開深さを制御する。
  5. 2つの眼筋鉗子を使用して筋肉層を分離し、L3 からL5 の棘プロセスおよび上頭緊張を露光する。

3. 靭帯と共にL3-L5の棘プロセスの切除

  1. 金星せん断を使用して、個々のスピンプロセスを分離して、異棘靭帯を切断する(図2D)。
  2. 金星せん断を伴う間緊張靭帯とともに、L3-L5のスピンプロセスを解剖する(図2E)。
  3. 皮膚切開を無菌シルク編組(縫合サイズ5.0)で縫合し、パラ椎体筋の再付着を行わない。
  4. クロルテトラサイクリン塩酸塩眼軟膏を手術部位に塗布する。
  5. 鎮痛のためのLSI手術の直後にブプレノルフィン-SR(マウス体重のグラムあたり25 uL)を投与する。
  6. 動物を温かいチャンバーに入れ、麻酔からの回復中に監視します。動物を家のケージに戻す前に、食物と水の摂取量を監視してください。
  7. 操作後の最初の3日間、動物を1日1回監視します。動物は正常な食欲を持ち、膿、出血、または腫脹の徴候なしで治癒するべきである。彼らは移動に軽度の障害を持っている可能性があります。
  8. L3-L5椎骨からの後部椎筋の剥離によってのみ、恥の操作を行います。

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結果

LSIマウスモデルは、IDD機構、IDD処理、エンドプレート(EP)硬化症などの変性、およびEP20、21、22、23における感覚的インネレーションの研究に適用される。LSIマウスは、識別されるように、IVDの体積と高さの減少、EPボリュームの増加、およびIVDおよびEPスコアの増加によって、IDDおよびEP変性変化を発現する。

解剖および固定下部胸部および腰椎を、前述の20,21に示した高分解能マイクロコンピュータ断層撮影法(μCT)によって調べた。肋骨付き下部胸部腰椎は、L3–L5椎骨の同定のために含まれていた(図3A)。<...

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ディスカッション

椎骨の後部椎筋を剥離し、上頭突性靭帯と副鼻腔間靭帯を切除した脊椎不安定性マウスモデルを開発しました。我々は、より顕著な棘プロセスを有する腰椎に同様の手術を行った。LSIマウスモデルは、腰椎に同様のIDDを開発しました。

LSIモデルの利点は、強力な操作性、特別な機器の要件、再現性、およびIDD開発の比較的短い期間が含まれます。

ここでは、操作中の成功率を向上させるためにいくつかの重要なポイントを示します。これらはまた、重要な手順です。まず、下背部の毛髪を取り除き、できるだけ明確に、傷口に残った毛髪を剃った毛がアナフィラキシー反応を引き起こす可能性があるためである。第二に、円筒形パッドまたは他のパッドは、腰椎を上げるのをお勧めします。第三に、切開深度と出血を制御するためにマイクロハサミを使用します。手術中にヘマトコアリアが気づいたら、マウスは手術中または手術後に生き残れないため、操作を中止し、マウスを犠牲にします。第四に、麻痺筋の再付着は、再付着が不安定さを構成する可能性があるため...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は中国の国立自然科学財団(81973607)と中国科学技術省の必須医薬品研究開発(2019ZX09201004-003-032)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
クロルテトラサイクリン塩酸塩眼軟膏上海総合製薬有限公司H31021931目の乾燥を防ぎ、創傷感染を防ぐ
C57BL/6J 雄マウスTian-jiang Pharmaceuticals Company (Jiangsu, CN)SCXK2018-0004動物モデル
使い捨て医療用タオルHenan Huayu Medical Devices Co., Ltd.外科手術のための20160090
吸入麻酔器具MIDMARKMatrx 3000麻酔
イソフルランShenzhen RWD Life Technology Co., Ltd.1903715麻酔
リドカイン塩酸塩Shandong Hualu Pharmaceutical Co., Ltd.H37022839鎮痛医療用
縫合針上海浦東金環医療製品有限公司20S0401J縫合皮膚
眼科鉗子上海医療機器(グループ)有限公司外科器具工場JD1050をクリップ
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金星はさみMingren医療機器長さ:12.5cm筋肉と棘突起をクリップします
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参考文献

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