アカゲザル脂肪由来幹細胞の単離・増殖・分化

サマリー

本稿では、酵素組織消化プロトコルを用いたアカゲザル由来脂肪由来幹細胞(ADSC)の単離について説明します。次に、細胞剥離、計数およびプレーティングを含むADSC増殖について説明する。最後に、ADSC分化は、特定の脂肪生成誘導剤を用いて記載される。さらに、分化を確認するための染色技術についても説明します。

要約

脂肪組織は、自己複製することができる多能性幹細胞の豊富でアクセス可能な供給源を提供します。これらの脂肪由来幹細胞(ADSC)は、機能的にはin vivo脂肪細胞と同様の一貫した生体外細胞系を提供します。生物医学研究におけるADSCの使用は、脂肪組織の代謝調節および機能の細胞調査を可能にする。ADSC分化は適切な脂肪細胞増殖に必要であり、次善分化は脂肪機能障害の主要なメカニズムです。ADSC分化の変化を理解することは、代謝機能障害と疾患の発症を理解するために重要です。この原稿に記載されているプロトコルに従うと、ADSC代謝機能を評価するためのいくつかのin vitro機能試験に使用できる成熟脂肪細胞が得られますが、これらに限定されませんグルコース取り込み、脂肪分解、脂肪生成、および分泌を測定するアッセイ。アカゲザル (Macaca mulatta) は、生理学的、解剖学的、進化的に人間と類似しているため、その組織と細胞は生物医学研究や治療法の開発に広く使用されています。ここでは、4〜9歳のアカゲザルから得られた新鮮な皮下脂肪組織および大網脂肪組織を使用したADSC分離について説明します。脂肪組織サンプルは、コラゲナーゼで酵素的に消化され、続いて濾過および遠心分離され、間質血管画分からADSCを単離します。単離されたADSCは間質培地で増殖し、その後、間質培地中の0.5 μg/mLデキサメタゾン、0.5 mMイソブチルメチルキサンチン、および50 μMインドメタシンのカクテルを使用して約14〜21日間の分化を行います。成熟脂肪細胞は分化の約14日目に観察される。この原稿では、in vitroでのADSCの単離、増殖、および分化のためのプロトコルについて説明します。アカゲザル脂肪組織からのADSCに焦点を当ててきましたが、これらのプロトコルは、最小限の調整で他の動物から得られた脂肪組織に利用できます。

概要

脂肪組織は、細胞、主に成熟脂肪細胞、および線維芽細胞、免疫細胞、脂肪由来幹細胞(ADSC)を含む間質血管画分との不均一な混合物で構成されています^1,2,3。初代ADSCは、白色脂肪組織から直接単離し、刺激して脂肪細胞、軟骨または骨細胞に分化させることができます⁴。ADSCは、in vitroでの多能性の維持や自己複製などの古典的な幹細胞特性を示します。そして、培養中のプラスチックに付着している^5,6。ADSCは、その多能性と非侵襲的技術を使用して大量に容易に収穫する能力があるため、再生医療での使用にとって重要な関心事です⁷。ADSCの脂肪分化は、脂質蓄積、インスリン刺激グルコース取り込み、脂肪分解、アディポカイン分泌など、成熟脂肪細胞を機能的に模倣する細胞を産生します⁸。成熟脂肪細胞に類似しているため、脂肪細胞の細胞特性や代謝機能の生理学的研究にADSCが広く使用されています。代謝機能障害および障害の発症は細胞レベルまたは組織レベルに由来するという考えを支持する証拠が増えています9,10,11,12。最適なADSC分化は、十分な脂肪組織拡張、適切な脂肪細胞機能、および効果的な代謝調節に必要です¹³。

この原稿に記載されているプロトコルは、標準的な実験装置と基本的な試薬を利用した簡単な手法です。原稿は最初に、機械的および酵素的消化を使用して新鮮な脂肪組織から一次ADSCを単離するためのプロトコルについて説明します。次に、間質培地におけるADSCの増殖および継代のためのプロトコルについて説明する。最後に、ADSCの脂肪生成分化のためのプロトコルについて説明します。分化後、これらの細胞は、脂肪細胞の代謝と機能不全のメカニズムをよりよく理解するための研究に使用できます。オイルレッドOおよびホウ素-ジピロメテン(BODIPY)染色を用いた脂肪分化の確認および脂肪滴検出のためのプロトコルについても説明します。これらのプロトコルの詳細は、アカゲザルの新鮮な大網脂肪組織から分離された一次ADSCに焦点を当てていました。私たちと他の人は、このプロトコルを使用して、アカゲザルの皮下および大網脂肪組織デポからADSCを首尾よく分離しました^14,15。使用した同じ量の組織について、皮下脂肪組織は大網脂肪組織と比較して、より密度が高く、より強靭であり、消化による細胞の生成が少ないことが観察されています。このプロトコルは、ヒト脂肪サンプルからADSCを単離するためにも使用されています¹⁶。

プロトコル

得られたすべての組織および手順は、ルイジアナ州立大学健康科学センターの施設内動物管理および使用委員会によって承認され、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施された(NIH出版物第85-12号、1996年改訂)。

1.バッファーと溶液の調製

1. 5%ペニシリン/ストレプトマイシン(ペン/連鎖球菌)および0.25 μg/mLの真菌阻害剤を1x PBSに添加することにより、滅菌5リン酸緩衝生理食塩水洗浄バッファー(5-PBS)溶液を調製します。1x PBSに2%ペン/連鎖球菌および0.25 μg/mLの真菌阻害剤を加えて、滅菌済みの2-PBS洗浄バッファー(2-PBS)溶液を調製します。洗浄バッファーは、将来の使用のために4°Cで保存でき、4週間以内に使用する必要があります。
   注:5-PBSバッファーは、剖検で得られた組織サンプルが非滅菌環境で収集されるため、汚染の可能性を最小限に抑えるために、脂肪組織の収集と初期洗浄に使用されます。
2. ハンク平衡塩溶液(HBSS)中の0.075%コラゲナーゼI型(125単位/mg活性)、2%ペン/連鎖球菌、および0.25 μg/mLの真菌阻害剤と1%ウシ血清アルブミンを組み合わせて、滅菌コラゲナーゼバッファー(CB)を調製します。CBは1時間以内に使用する必要があります。
3. α-MEMバッファーを使用して滅菌ADSC増殖培地を調製します。100 mLのウシ胎児血清(FBS)、5 mLの200 mM L-グルタミン溶液、500 μLの0.25 μg/mLの真菌阻害剤、および10 mLのペン/連鎖球菌溶液を394 mLのα-MEMバッファーに組み合わせます。ADSC増殖培地は4°Cで保存でき、4週間以内に使用する必要があります。
   注意: FBSの熱不活性化は必要ありません。
4. 上記で調製したADSC増殖培地と誘導剤を組み合わせて滅菌ADSC分化培地を調製し、最終濃度0.5 μg/mLのデキサメタゾン、0.5 mMイソブチルメチルキサンチン、50 μMインドメタシンを達成します。

2. ADSCアイソレーション

1. 組織の準備と消化
   1. 100 mm細胞培養皿4皿に~10 mLの5-PBSバッファーをピペットで入れます。
   2. ~50 gの脂肪サンプルを5-PBSを含む100 mmディッシュの1つに移します。採取した脂肪組織サンプルを、5-PBSを含む4つの培養皿に順次移して4回洗浄します。
   3. 脂肪サンプルを清潔な100 mm培養皿に移し、はさみまたは2つの滅菌メスを使用して脂肪組織を完全にミンチします。ミンチは、効率的で完全な酵素消化のために表面積を増やすことを可能にします。
   4. ミンチ脂肪組織を、13 mLのCBを含む50 mLのプラスチック円錐管に移します(CB15 mLあたり1〜3 cmの組織切片)。
   5. 培養皿を2 mLのCBですすぎ、培地を50 mLのプラスチック製コニカルチューブに移します。
      注:この時点で、50mLのプラスチック製コニカルチューブに組織を含む合計15mLのCBがあるはずです。
   6. 機械的組織消化を促進するために、25 mL血清学的ピペットを使用して数回ピペットを上下させます。
   7. 組織を含む50 mLのプラスチック製円錐管をロッカー上のロッカー上で37°Cの中速で30〜60分間インキュベートします。
2. 培養用ADSCめっき
   1. 組織を含む50 mLチューブに10 mLのADSC増殖培地を加え、酵素活性を中和します。25 mL血清学的ピペットを使用して数回上下にピペットし、脂肪組織凝集体を分離します。
   2. 液体部分を新しい滅菌50mLコニカルチューブに移し、固形物を残します。元の50 mLチューブを~7 mLの2-PBSバッファーで3回洗浄し、液体部分を50 mLチューブに移します。
   3. 500 x g で5分間遠心分離し、菌体ペレットを得た。細胞ペレットを乱すことなく、血清学的ピペットを使用してできるだけ多くの上清を慎重に除去します。デカントしないでください。
   4. 細胞ペレットを1 mLの1x赤血球(RBC)溶解バッファーに再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。5 mLのADSC増殖培地をチューブに加え、500 x g で5分間遠心分離してから、上清を注意深く除去して廃棄します。
   5. 5 mLのADSC増殖培地を加え、500 x g で5分間遠心分離して細胞ペレットを洗浄します。上澄み液を捨てる。
   6. ペレットを2 mLのADSC増殖培地に再懸濁し、70 μmのセルストレーナーを通して新しい滅菌50 mLプラスチックコニカルチューブにろ過します。
   7. セルストレーナーを追加の2 mLのADSC増殖培地ですすいでください。ADSCを含む懸濁液4 mLを50 mLコニカルチューブから滅菌済みの100 mm培養皿に移します。
   8. 50 mLのコニカルチューブを3 mLのADSC増殖培地で2回洗浄し、その液体をADSCを含む100 mmの培養皿に移し、培養皿に合計10 mLの培地を入れます。
   9. 図1Aに示すように、倒立顕微鏡で細胞を10倍の倍率で観察し、培地中の浮遊細胞を確認します。細胞は、CO2インキュベーター内で、5%_CO2および100%の相対湿度で37°Cに維持する必要があります。
   10. 24時間後、倒立顕微鏡で細胞を観察し、細胞の接着を確認します。プレートからADSC増殖培地を吸引し、10 mLの新鮮で温かい(37°C)培地と交換します。細胞が80%〜90%コンフルエントになるまで、48時間ごとに培地を取り外して交換します(図1B)。
       注:24時間までに細胞の少なくとも10〜20%が接着します。細胞培養物に、細胞の粒度、培地の濁度、胞子の成長などの汚染の兆候がないか確認します。細胞が80%コンフルエントになったら、増殖と凍結保存のために回収するか、分化を誘導することができます。ADSCは、効率的に増殖または分化する能力を失う前に、4〜6継代に拡張することができます。

3. ADSCの拡散

1. 細胞剥離
   1. アスピレーター/ピペットを使用してADSC増殖培地を除去します。コンフルエントなADSCを2 mLの滅菌室温PBSで2回すすぎます。
   2. PBSを吸引し、100 mm培養プレートあたり2 mLの0.25%トリプシン-EDTAを追加します。表面積全体がトリプシンで覆われていることを確認してください。
   3. ADSCが剥離するまで、プレートを5%_CO2 中で37°Cで~7分間インキュベートします。プレートをインキュベーターから取り出し、プレート内のトリプシン溶液を強制的にピペッティングして細胞を機械的に除去します。
   4. 2 mLのADSC増殖培地を除去された細胞に加え、穏やかにピペットで混合します。細胞を滅菌済みの50 mLプラスチックコニカルチューブに移します。細胞回収率を最大限に高めるには、培養皿を別の2 mLのADSC増殖培地ですすぎ、剥離した細胞を含むコニカルチューブに培地を移します。
   5. 50 mLコニカルチューブを500 x g で室温で5分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。細胞ペレットを乱すことなく上清を注意深くデカントする。
   6. 細胞ペレットを1 x 10 6細胞あたり5〜⁶ mLのADSC増殖培地に再懸濁します。
2. 細胞数とめっき
   1. 1.5 mLの微量遠心チューブで、上から10 μLの細胞溶液と10 μLの0.04%トリパンブルー溶液(PBSで1:10に希釈した0.4%トリパンブルー)を希釈し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
   2. 成長培地中の必要な数のADSCを再懸濁します。100 mmの培養皿の場合、10 mL ADSC増殖培地で^5細胞を ~3.0 x 10プレートし、72時間で80%のコンフルエント、または96時間で100%のコンフルエントを可能にします。
   3. インキュベーション前に倒立顕微鏡で皿を10倍の倍率で観察し、浮遊細胞の存在を確認します。セルを5%_CO2 および100%相対湿度で37°Cに維持する。
   4. 図 1Bに示すように、48時間ごとに増殖培地を吸引し、細胞が80%〜90%コンフルエントになるまで温かい(37°C)培地と交換します。
   5. セクション3.1と3.2の手順を適切な数の継代で繰り返し、目的のセル番号を取得します。
      注:継代5〜6の後、初代細胞は老化を起こしているように見えます。したがって、継代4により所望の細胞数を得ることを目指す。

4. ADSC脂肪分化

1. 80%〜90%のコンフルエントに達した接着ADSCからADSC増殖培地を吸引する。
2. ADSC細胞層を滅菌済みの室温PBSで素早くすすいでください。
3. ADSC分化培地を追加します。100 mm培養皿の場合、10 mLのADSC分化培地を追加します。
4. 培地は3日ごとに約14〜21日間交換してください。成熟脂肪細胞は一般に分化の14日後に観察される。
5. 図2Aに示すように、40倍の倍率で倒立光学顕微鏡下で細胞を調べ、脂肪滴の存在を確認しました。

5.脂肪細胞検出

注:このセクションでは、分化した脂肪細胞の脂肪滴検出に使用される染色プロトコルについて説明しますが、間葉系幹細胞マーカーであるCD105の免疫蛍光染色もADSC確認に使用できます。

1. オイルレッドO染色
   1. イソプロパノール中の0.5%オイルレッドOストック溶液を調製する。オイルレッドOストック溶液20 mLの場合、オイルレッドO100 mgをイソプロパノール20 mLに溶解します。0.2μmメンブレンを有する滅菌シリンジフィルターを通して溶液を濾過する。
   2. 分化培地を注意深く吸引し、細胞単層を乱さないようにウェルの側面に沿ってPBSを加えて細胞を2回洗浄します。
   3. 細胞からPBSを注意深く吸引し、細胞層を覆うのに十分な中性緩衝ホルマリン(NBF、10%)を加えます。室温で30〜60分間インキュベートします。
   4. ホルマリン固定工程では、オイルレッドO原液3部を蒸留水2部で希釈してオイルレッドO作動液を調製する。溶液を混合し、0.2μmメンブレンを有する滅菌シリンジフィルターを通して濾過する。作業溶液は最大2時間安定です。
   5. NBFを注意深く吸引し、細胞層を蒸留水で素早く洗浄(~15秒)します。水を吸引した後、細胞層を覆うのに十分な60%イソプロパノールを加え、室温で5分間インキュベートします。
   6. 5分間のインキュベーション後にイソプロパノールを注意深く吸引し、細胞層を覆うのに十分なOil Red O作業溶液を加え、室温で10〜15分間インキュベートします。
   7. Oil Red O作業溶液を注意深く吸引し、水が透明になるまで蒸留水で細胞層を数回洗浄します。
   8. PBSを細胞培養皿に加え、倒立顕微鏡下で細胞を調べて、分化と脂肪滴の存在を示します(図2B)。
2. ボディ染色
   1. 1.3 gのボディーを1 mLのDMSOに溶解して、5 mM BODIPYストック溶液を調製します。ストック溶液をPBSで1:25,000倍に希釈して、2 μg/mLのBODIPY作業溶液を調製します。
   2. 分化培地を注意深く吸引し、細胞単層を乱さないようにウェルの側面に沿ってPBSを加えて細胞を2回洗浄します。
   3. PBSを注意深く吸引し、細胞層を覆うのに十分なBODIPY作業溶液を加え、37°Cで30分間インキュベートします。
      注意: この時点から、プレートをホイルで覆って細胞を光から保護します。
   4. BODIPY作業溶液を注意深く吸引し、細胞層をPBSで3回洗浄します。
   5. 4%パラホルムアルデヒドを添加し、室温で15分間インキュベートして細胞を固定します。
   6. 固定バッファーを注意深く吸引し、細胞単層を乱さないようにウェルの側面に沿ってPBSを加えて細胞を2回洗浄します。
   7. PBSを細胞培養皿に加え、倒立蛍光顕微鏡下で細胞を調べて、分化の証拠と脂肪滴の存在を確認します(図2C)。FITC/EGFP/ボディピーFl/Fluo3/DiOクロマフィルターセットを使用した細胞を画像化します。励起波長は480nmでバンド幅は40nm、発光波長は535nmで帯域幅は50nmです。類似または適切なフィルターセット、および顕微鏡を使用することができる。

結果

アカゲザル脂肪組織サンプルから単離したADSCを培養プレート上に播種し、 図1に示す。プレーティング当日、細胞は非接着性であり、 図1Aに示すように培養皿に浮遊する。72時間以内に、ADSCは80%コンフルエントになり、脂肪細胞分化の準備が整います(図1B)。ADSCは、化学的誘導後に強い脂肪生成特性を示します。分化の14日後、成熟脂肪細胞を光学顕微鏡で観察することができます(図2A)。ADSC脂肪分化を確認するために、種々の染色剤を用いて、分化した成熟脂肪細胞の脂肪滴を可視化することができる。分化の14日目に、細胞を染色し、脂肪滴の可視化のためにオイルレッドO(図2B)およびBODIPY(図2C)で固定した。黒い矢印は分化した脂肪細胞を表す(

ディスカッション

ADSCの分離、増殖、分化のプロトコルは単純明快で再現性がありますが、適切な分離、健全な拡大、および効率的な分化を確実にするために慎重な技術が必要です。無菌の作業環境は、すべての細胞培養実験にとって重要です。細菌または真菌は、汚染された道具、培地または作業環境を介して細胞培養物に導入され得る。真菌汚染は培養物中の胞子増殖によって示され、細菌汚染は培地の濁度の存在によって示される。使用前にバイオセーフティキャビネットとすべてのピペット、ボトル、ツールを消毒し、バイオセーフティキャビネットを使用する少なくとも15分前に層流をオンにし、使用後にキャビネットとすべてのピペットを消毒して、汚染のリスクを減らすことをお勧めします。また、真空吸引用のノンフィルターピペットチップをオートクレーブし、使用後は滅菌水でアスピレーターを洗い流した後、70%エタノールを流すことをお勧めします。培地のみを含む培養皿を37°Cおよび5%_CO2 の加湿インキュベーターに数日間入れて、培地の無菌性をチェックすることができます。汚染された培養物は30分間漂白して廃棄する必要があります。細胞培養インキュベーターも消毒する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.4 % トリパンブルー	サーモフィッシャー	15250061
1.5 ml 微量遠心チューブ	ドットサイエンティフィック	707-FTG
100 % イソプロパノール	Sigma-Aldrich	PX1838-P
100 mm 細胞培養ディッシュ	コーニング	430167
3-イソブチル-1-メチルキサンチン	Sigma-Aldrich	I7018
50-mLプラスチック製の円錐形チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	50-465-232
70-µm細胞ストレーナー	Corning	CLS431751
a-MEM	Thermo-Fisher	12561056
アルミホイ	レイノルズラップ
BODIPY	Thermo-Fisher	D3922
ウシ血清アルブミン (BSA)	Sigma-Aldrich	05470
遠心分離機	Eppendorf	5810 R
コラゲナーゼ,タイプI	サーモフィッシャー	17100017
デキサメタゾン-水溶性	Sigma-Aldrich	D2915
ジメチルスルホキシド、DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
蒸留水	サーモフィッシャー	15230162
ウシ胎児血清、USDA承認	Sigma-Aldrich	F0926
菌類/アムホテリシンB(250 ug / mL)	サーモフィッシャー	15290018
ハンクス平衡塩溶液 (HBSS)	サーモフィッシャー	14175095
カバースリップ付き血球計算盤	シグマ・アルドリッチ	Z359629
インドメタシン	シグマ・アルドリッチ	I7378
倒立光学顕微鏡	ニコン	DIAPHOT-TMD
L-グルタミン (200 mM)	サーモフィッシャー	25030081
ラボラトリーロッカー、0.5 〜 1.0 Hz	信頼性の高い科学	モデル55 ロッキング
中性緩衝ホルマリン (10%)	Pharmco	8BUFF-FORM
オイル レッド O	シグマ-アルドリッチ	O0625
パラホルメルデヒド	シグマ-アルドリッチ	P6148
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	Thermo-Fisher	15140122
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4	Thermo-Fisher	10010023
赤血球 (RBC) 溶解緩衝液	Qiagen	158904
Serological ピペット、2 〜 25 mL	Costar Stripettes
標準加湿細胞培養インキュベーター、37 °C;C、5%CO2	Sanyo	MCO-17AIC
トリプシン-EDTA(0.25%)	サーモフィッシャー	25200056