ラットにおける急性および慢性の運動チック発現モデルの生成

サマリー

我々は、自由に振る舞うラットにおけるチック発現の急性および慢性の実験モデルを生成するためのプロトコルを提示する。モデルは、線条体カニューレ注入とその後_の GABA Aアンタゴニストアプリケーションに基づいています。急性モデルは一時的な注入を使用し、慢性モデルは皮下埋め込まれたミニ浸透ポンプを介して長期注入を利用する。

要約

運動チックは、トゥレット症候群および他のチック障害の主要な症状である突然の、急速な、再発運動である。このチック生成の病態生理は、大脳基底核の異常阻害、特にその一次入力構造、線条体に関連している。げっ歯類と非ヒト霊長類の両方の動物モデルにおいて、GABA_A 拮抗薬の局所的な適用は、ビキュリンおよびピクロトキシンなどの、線条体の運動部分への、運動チックの発現をもたらす局所的な抑制を誘発する。

ここでは、ラットの運動チックの急性および慢性モデルを紹介する。急性モデルでは、背部線条体に移植されたカニューレを通してビキュリン微小注射を行い、短い期間最長1時間持続するチックの発現を引き出す。慢性モデルは、皮下ミニ浸透ポンプを介したビキュクリンの連続注入を利用して、数日または数週間の期間にチック発現の延長を可能にする代替モデルである。

これらのモデルは、コルチコ-基底基底核経路全体におけるチック発生の行動および神経機構の研究を可能にする。モデルは注入のカヌラに加えて付加的な記録および刺激装置の注入を支え、電気および光学的刺激および電気生理学的記録のような広範な使用を可能にする。各方法には異なる利点と欠点があります:急性モデルは、運動の運動学的特性と、チック発現の前後の対応する電気生理学的変化と、チック発現に対する短期モジュレーターの影響を比較することができます。この急性モデルは簡単に確立できます。ただし、短期間に制限されます。慢性モデルは、より複雑である一方で、長期間にわたるチック表現に対するチックダイナミクスと行動効果の研究を実現可能にする。したがって、経験的クエリのタイプは、ティック式のこれら2つの補完的なモデルの間で選択を駆動します。

概要

チックスは、トゥレット症候群(TS)および他のチック障害の決定的な症状である。チックは、突然、急速、再発運動(運動チック)、または発声(ボーカルチック⁾¹として記述されています。チック式は、通常、時間(周波数⁾²および空間(強度、身体位置⁾³プロパティで、複数の時間スケール(時間、日、月、年)で変動します。これらの変更は、環境機能⁴、⁵、 行動状態^6、7、および自主的および一時的な抑制⁸などのさまざまな要因によって影響を受けます。

運動チックを支配する神経機構はまだ完全には理解されていないが、理論および実験的研究の増加は、その性質に関する新たな証拠を提供している⁹.現在、ticの発生の病態生理は、コルチコ基底核(CBG)ループを伴うと考えられているが、具体的には線条体の異常な阻害と関連している、第一基の基底核入力核^{10、11、12。}げっ歯類および霊長類の以前の研究は、ビキュクリンおよびピクロトキシン^{13、14、15、16、17、18}のような異なるGABA_Aアンタゴニストの局所適用によって線条体が抑制され得ることを実証した。この薬理的介入は、注射に対する反対側の一過性の運動チック発現につながり、したがって、顔および構築有効性を有するチック障害の堅牢な急性モデルを確立する。急性モデルは、誘発が容易であり、チック発現の前後の電気生理学的および運動学的記録と同時に電気および光学的刺激などの短期変調の効果を研究することを可能にする。しかしながら、急性モデルは注射後の短期間に限定される。急性モデルに基づいて、我々は最近、皮下移植されたミニ浸透ポンプ¹⁹を介して線条体へのビキュクリンの長期にわたる固定速度注入を利用するラットにおけるチック生成の慢性モデルを提案した。このモデルは、チック表現の期間を複数の日/週に拡張します。ビキュクリンの長期間にわたる絶え間ない放出により、薬理学的治療や行動状態などの様々な要因がチック発現に及ぼす影響を調べることができる。

ここでは、ラットにおけるチック発現の急性および慢性モデルを生成するためのプロトコルを提示する。特定の研究課題の機能として、プロトコルは、一方的対二国間移植、チックの部位(線条体の基腫組織に従う⁾¹⁸ およびインプラントカンヌラの角度(追加の埋め込み装置の位置に応じて)を含むパラメータの微調整を可能にする。慢性モデルで使用される方法は、部分的に市販製品に基づいていますが、チックモデルに適合するように重要な調整を行います。この記事では、これらのティック モデルをカスタマイズするために必要な調整について詳しく説明します。

プロトコル

すべての手順は、施設動物ケアおよび使用委員会によって承認され、監督され、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイドと研究における実験動物の使用とケアのためのバーイラン大学ガイドラインに従いました。この議定書は、国立保健省の実験動物実験のための全国委員会によって承認されました。

注:このプロトコルは、雌のロングエバンスラット(急性および慢性モデル)および雌のスプレイグドーレーラット(急性モデル)3-10ヶ月、280-350 gを利用しています。他の株、重量または年齢でこれらのモデルの実装は、異なる反応のために慎重にテストする必要があります。

1. 急性モデル

1. 手術前の準備
   1. インプラントカニューレ製剤
      注:インプラントカニューレは線条体への局所的なビキュクリンの注入を可能にする。
      1. ステンレス鋼を25G(OD 0.02'、ID 0.015'')のハイポチューブを切断し、インプラントカニューレを得る(図1、装置#1)。回転ツールを使用して、直線エッジを実現します。カニューレの長さは、移植ターゲットの深さ、カニューレの注入の角度、および最終的なセメントキャップの高さに依存します。移植ターゲット深度は、組織の損傷を防ぐために、最終的な注入ターゲットよりも2mm(0.079'')高くする必要があります。
         注: 埋め込まれた最も高いオブジェクトは、キャップの高さを決定します。
      2. 砂とインプラントカニューレの縁を滑らかにし、脳への追加のメカニック摩擦を防ぎます。30 G (0.01')の針を通して内部の障害物を取り除きます。
   2. ダミーの準備
      注:ダミーは、埋め込まれたカニューレの中に配置された取り外し可能な内部ワイヤです。ダミーは、移植されたカニューレをシールし、その閉塞を防止します。
      1. 回転工具で0.013'線を切断してダミーを作ります。ダミーは、インプラントカニューレの長さよりも長い3 mm (0.118'')でなければなりません(図1、デバイス#2)。
      2. ダミーが最後になるまでインプラントカニューレに差し込む。余分なワイヤーをカニューレにつまんで曲げます。曲がった部分は、ダミーが埋め込まれたカニューレから脱落するのを防ぎ、ラットがそれを取り除くのを防ぐために、インプラントカニューレと一緒にフラッシュする必要があります。
   3. インジェクター調製物
      注:インジェクターは、柔軟なチューブとインジェクションカニューレ(図1、デバイス#3)で構成され、線条体への直接ビキュクリン注入を可能にします。
      1. 70 cm (27.559'') フレキシブルポリマーマイクロボアチューブ (OD 0.06',ID 0.02'') をカットします (図 1,装置 #3.1)。
         注: フレキシブルチューブの長さは、実験ケージと輸液ポンプ機械の位置との距離によって定義されます。ラットが絡まないように、注射期間中にラットの自由な移動を可能にするのに十分な長さでなければなりません( 図3Aを参照)。
      2. ステンレス鋼をカット, 30 G (OD 0.012'', ID 0.007'')のハイポチューブを得るために注入カニューレを得る (図 1,装置 #3.2).回転ツールを使用して、直線エッジを実現します。それはインプラントカニューレよりも5 mm(0.197''')長く測定する必要があります:最終的な注入目標に到達するために脳内に埋め込まれたカニューレよりも2mm(0.079'')長く、柔軟なチューブに挿入するために3 mm(0.118')。
      3. 砂と注射カニューレの先端を滑らかにし、脳への追加のメカニック摩擦を防ぎます。直径0.005'のワイヤを挿入して、遮るものがないように確認します。
      4. 3 mm (0.118')の注入カニューレをフレキシブルチューブに挿入し、それらの間のジョイントを接着して、インジェクターを得ます。シアノアクリル酸 (CA) 接着剤と CA アクセラレータを使用します。
      5. 滅菌水で満たされた25G針(0.018'')の注射器を注入器に取り付け、洗い流します。これにより、注入カニューレから出てくる流れの向きがまっすぐで楽であることを保障する。重要なことに、流れがまっすぐでない場合は、30 G(OD 0.01')針の先端を使用して障害物を取り除き、射出カニューレ穴を拡大し、流れを再確認します。
   4. カニューレホルダーの準備
      注意:カニューレホルダーはステレオタックスアームに接続され、移植中にインプラントカニューレを保持します。カニューレホルダーは、カニューレホルダーベースとカニューレホルダーリードで構成されており、一緒に接着されています(図1、デバイス#4)。移植の間、カニューレホールダーベースは立体的な腕に付着し、カニューレホルダーの鉛はインプラントカニューレに取り付けられる。
      1. カニューラホルダーベース:ステンレス鋼の10cm(3.947'')をカットし、22 G(OD 0.028'、ID 0.017')のハイポチューブ(図1、装置#4.1)。
      2. カニューラホルダーリード:0.013'ワイヤーを所望のインプラントカニューレよりも長い3mm(0.118'')長さにカットします(図1、デバイス#4.2)。
      3. カニューレホルダーのリードをカニューレホルダーベースに挿入し、CA接着剤とCAアクセラレータを使用してジョイントを接着します。埋め込み時の組織損傷を避けるために、リードはインプラントカニューレよりも1mm(0.039'')短くする必要があります。
   5. ビキュリン調製:ビキュリンメチオジドを生理食塩水または人工脳脊髄液(ACSF)に溶解し、最終濃度1 μg/μLにします。溶解したビクキュリンを1mLの注射器に分け、アルミホイルで覆い、必要になるまで-20°Cで凍結します。必要に応じて、使用前にシリンジを解凍してください。
2. 手術
   1. ラットを設計されたチャンバーに入れることによって初期麻酔を誘発し、0.5-1 L/minの速度で酸素と混合された4-5%のイオブルランを送達する。次に、ラットの筋肉内(IMまたはIP)をケタミンとキシラジン(それぞれ100mg/kg)混合物で注入する。
   2. 電気クリッパーを使用してラットの頭を剃ります。
   3. ラットの耳にリドカインゲルを入れます。角膜乾燥や外傷を防ぐために、ラットの目に石油ゼリーを置きます。
   4. 耳の棒および歯棒を使用して立体的なフレームでラットを固定します。
   5. ポビトンヨウ素でラットの頭皮をスワブし、その後、アルコール拭きで領域を殺菌します。所望の切開線に沿って0.5-1%リドカイン溶液を皮下(SC)に浸潤する。メスの刃を使用して、頭皮に沿って切開を行います。
   6. 鼻隠しを縁に向けて引っ張って、外科領域を開きます。
   7. 綿棒を使用して、滅菌生理布地で頭蓋骨をきれいにします。出血の場合は、血液毛細血管を焼灼するために、発灼器を使用してください。このステップは、時間の経過に応じ、キャップの安定性に不可欠です。
   8. 4つの湾曲した止頭線(2つの前部、2つの後部)で筋膜を締め、外科部位を拡大する。
   9. ブレグマとラムダ座標を測定します。2 つのポイントのドーソベントラル (DV) 座標を 100 μm の範囲内に収まるようにレベル設定します。
   10. ステレオタックス装置を使用して、対象領域と埋め込まれるアンカーねじの座標を測定し、マークします。前肢領域におけるチック誘導のためのまっすぐな注入カニューレ座標は次のとおりです: AP: +1 へ +1.5, mL: ±2.5, DV: 3;後肢領域: AP: -0.4 へ -0.5, mL: ±3.5, DV:3^18,20.
       注:カニューレをまっすぐに移植することを妨げる複数のデバイスの移植の場合は、カニューレの注入角度とその座標を適宜変更します(前肢座標:AP:+2.7、mL:±2.5、DV:3、前から後方への角度15°)。
   11. 顕微鏡下で頭蓋骨に穴を開けます。1/4-1/2ビットサイズのカーバイドラウンドバーが付いている歯科ドリル機械を使用してください。脳損傷のリスクを最小限に抑えるために、掘削技術に応じてドリル速度を調整し、メカニック圧力を避けてください。脳が見えるまで、約1mmのドリル。綿棒で血液を吸収し、滅菌生理水で洗います。
       注:アンカーネジはキャップを安定させるのに役立ちます。ネジが両方半球と前後軸に沿って位置していることを確認します。
   12. カニューレ移植
       1. アンカーネジを穴にねじ込みます。ステンレス鋼#0 x 1/8サイズのネジを使用してください。
          注: アンカーネジの数は、埋め込まれたデバイスの合計数によって異なります。接地ネジ(例えば、電気的な録音や電気刺激のために)は、脳表面に到達する必要があります。
       2. カニューレホルダーをステレオタックスアームに取り付けます。
       3. インプラントカニューレをカニューレホルダーにスライドさせます。インプラントカニューレを脳に到達するまでゆっくりと穴の上に置きます。
       4. 脳の表面から始まる DV 座標を測定します。インプラントカニューレをインプラントターゲットまで下げます。綿棒で穴から出てくる血液を吸収し、滅菌生理水で洗い、十分に乾燥させます。
       5. ゲル接着剤を使用して頭蓋骨に埋め込まれたカニューレを接着します。乾くまで待ちます。
       6. インプラントカニューレに沿って歯科用セメントを塗布し、頭蓋骨に取り付けます。ダミー挿入を可能にするために、上端から2 mm(0.079'')を延長したままにしておきます。乾くまで待ちます。
          注:カニューレホルダーにセメントを置かないでください。
       7. カニューレホルダーを持ち上げ、埋め込まれたカニューレを所定の位置に残します。
       8. 埋め込まれたカニューレにダミーを挿入します。
       9. 記録アレイ、光ファイバー、刺激電極などの他のすべてのデバイスを埋め込みます。すべてのインプラントをカバーし、頭蓋骨の残りの部分の上に歯科用セメントを適用します。
       10. 室温リンガー溶液とカルプロフェン5mg / kg SC²¹の3 mLを注入する。
       11. それは意識を取り戻すまでラットを監視します(動物は直立し、気道を制御し、吸引の危険はありません)。完全な回復のためにそのホームケージにラットを返します。
3. マイクロインジェクション
   注: 注射中は、ビキュキュリンの流れがそのままであることを確認することが重要です。これは、インジェクタに小さな気泡を形成させ、その動きを監視することによって行うことができます。注射器の残りの容積は生理食糸で満たされてもよいので、ビキュクリンは無駄にされない。
   1. 注射器を25G針(OD 0.018')でビキュリン注射器に取り付けます。注入器の〜1/3-1/2を充填し、小さな気泡の形成を可能にする注射器を除去する。
   2. 25G針(OD 0.018')で無菌生理食糸で満たされた注射器に注射器を取り付けます。ビキュクリンが終わりに達し、小さな滴が出るまでインジェクターを充填します。
   3. 10 μL の精密ガラスマイクロシリンジのプランジャーを取り外します。
   4. 精密ガラスマイクロシリンジに短いフレキシブルポリマーチューブ(〜3cm、1.181')をカットして取り付けます。
   5. 短いフレキシブルチューブの他の端を1 mLの注射器、25Gの針(OD 0.018'')に無菌水で満たして接続します。
   6. 水が出るまで、短い柔軟性のチューブを通して精密ガラスマイクロシリンジに水を注入します。短いフレキシブルチューブを外します。
   7. 精密ガラスマイクロシリンジの~7 μLマークに到達するまでプランジャーを再挿入します。
   8. 精密ガラスマイクロシリンジを注入ポンプ機の運命のスロットに挿入します。
   9. インジェクタを精密ガラスマイクロシリンジに取り付け、0.35 μL/minのレートと総体積0.35 μLに設定します。
   10. インジェクタチップの下に紙拭きを入れます。インジェクタの気泡の位置をマークし、注入ポンプ機を起動し、ビキュキュリンの落下が現れるかどうかを確認します。射出後、気泡の位置を再度マークします。
       注: 2 つのマークの違いは、実験注入中の目的の違いに対応します。
   11. 実験ケージにラットを入れて、ダミーを取り除きます。
   12. 注入器を最後まで埋め込まれたカニューレに挿入します( 図3Aを参照)。
   13. 注入ポンプ機械を開始します。気泡が動いているか確認します。ストップウォッチを起動して、チック開始時間と終了時間を追跡します。
   14. 注射の1分後、インジェクターを取り外し、ゆっくりとダミーを再挿入します。
       注: 射出後にダミーを挿入すると、ビキュキュリンが射出ターゲットにプッシュされます。
4. ポストインジェクション
   1. 精密ガラスマイクロシリンジからインジェクタを取り外します。
   2. 空気で満たされた注射器を使用して、注入器から残りの溶液を洗い流します。滅菌水でインジェクターをきれいにし、インジェクターを通して空気を注入することによってそれを排出する。
   3. 精密ガラスマイクロシリンジを注入ポンプ機から取り外し、滅菌水で洗浄します。

2. 慢性モデル

1. 手術前の準備
   1. カニューレガイドの準備
      注意:カニューレガイドは注入管の一部であり、注入のカニューレを注入の間にカニューレのホールダーに付着させるために使用される。
      1. ステンレス鋼の12mm(0.472'')、25G(OD 0.02'、ID 0.015'')のハイポチューブをカットし、カニューレガイド(図2、デバイス#1)を得る。回転ツールを使用して、直線エッジを実現します。
      2. 手順 1.1.4 で説明されているように、カニューレホルダーを準備します。カニューレホルダーをカニューレガイドに挿入して、正しく取り付けられていることを確認し、取り外します。
   2. 注入カニューレ製剤
      注:注入カニューレは、注入管の一部でもあります。それは線条体の最終標的に埋め込まれ、ビキュリンの焦点注入を可能にする。
      1. ステンレス鋼、30G(OD 0.012'、ID 0.007'')のハイポチューブを切断し、注入カニューレを得る。回転ツールを使用して、直線エッジを実現します。全注入カニューレ長は、所望の注入深さと安全因子(〜1〜2mm、および 0.039''-0.079'')、注入カニューレ曲げ部分(2mm、0.079')、カニューレガイド(3mm、0.118')との重複、および水平部分(4 mm、0.157'')(図2、装置#2)。
         注: 急性モデルとは異なり、注入深度は最終的な注入ターゲットと等しくなります。
      2. 直径 0.005' のワイヤを注入カニューレに挿入し、目的の位置にある L 字型に曲げます。縦の部分は、所望の注入深さプラス4-5 mm(0.157''-0.197'')に対応し、水平部分は4mm(0.157'')長いです。
         メモ: 内側のワイヤーを挿入すると、曲げ時にカニューレが障害物にならないようにします。
   3. 柔軟なカテーテルチューブ調製
      注:それはまた、注入管のコンポーネントです。それは管アダプターを介してミニ浸透ポンプに注入カニューレを接続する。
      1. ポリエチレン(PE)-10チューブ(ID 0.011'、OD 0.025'')の8cm(3.149'')をカット(図2、デバイス#3)。
         注意:カテーテルの長さは、移植ターゲットとポンプの位置の間の距離によって決まり、ラットの頭頸部の自由な移動を可能にします( 図3Bを参照)。
   4. 輸液管の組み立て
      注:注入管は、ミニ浸透圧ポンプから脳にビキュクリンを伝導する。カニューレガイド、注入カニューレ、フレキシブルカテーテルチューブ、チューブアダプタ、フローモデレータで構成されています(図2)。
      1. 注入カニューレからインナーワイヤーを取り外します。顕微鏡下でカニューレを検査し、両側のエッジが開いてきれいになっていることを確認します。開いていない場合は、30 G (OD 0.01')ニードルを使用して開いてください。
      2. CA接着剤とCAアクセラレータを使用して、3mm(0.118'')の重なり合う3mm(0.118')の重なりに、注入カニューレの垂直セクションにカニューレガイドを接着します。
      3. 輸液カニューレの水平部分を柔軟なカテーテルチューブに挿入します。オーバーラップは、少なくとも 2 mm (0.079') でなければなりません。
      4. ポンプフローモデレータの半透明キャップを取り出します。これは短いステンレス鋼カニューレ管を明らかにする(図2、装置#5.1)。
         注: フローモデレータは、ミニ浸透圧ポンプキットの一部です。半透明のキャップ、短いカニューレ部分、白いフランジ、長いカニューレ部分で構成されています。長いカニューレ部分はミニ浸透圧ポンプに挿入され、短いカニューレ部分は管アダプターを介してカテーテルチューブに接続されます。
      5. チューブアダプター(図2、装置#4)を70%アルコールに浸します。材料が膨るにする前に、数分間待ちます。
      6. フロー モデレータの短いカニューラ部分にチューブ アダプタを取り付け、白いフランジに触れるまで(図 2、デバイス #5.2)チューブアダプタは、密閉された接続を形成するために空気中で収縮します。
      7. 柔軟なカテーテルチューブをチューブアダプタのオープンエンドに挿入し、フローモデレータの短いカニューレ部分に触れるまで挿入します。
      8. クリップスタンドを使用して長いカニューラ部分(図2、デバイス#5.3)を持ち、すべての接続を接着します。接続は、チューブアダプターとホワイトフランジ、チューブアダプタとフレキシブルカテーテルチューブ、そして最後に柔軟なカテーテルチューブと注入カニューレの水平部分の間にあります。接着剤が完全に乾燥するまで数時間待ちます(接着剤の種類によって異なります)。
         注:接続が緩んでしまわないようにPE互換の接着剤を使用してください。
      9. 27 G (0.014''') 鈍い針を持つ注射器を使用して、注入管の長いカニューレ部分を通して滅菌水を注入します。注入カニューレを通って水がスムーズに流れるか確認します。注入管を通して空気を注入して水を排出する。
   5. ミニ浸透圧ポンプのプライミング
      注:プライミングは、ポンプが注入直後に注入を開始することを可能にする起動手順です。
      1. 加熱浴に体温(~37°C)で水を充填します。小さなビーカーに滅菌生理布地を充填し、暖房浴中に置きます。
      2. ミニ浸透圧ポンプを紙のワイプで包み、クリップホルダースタンドを使用して開口部を上向きにして垂直に固定します。
      3. 27 G (0.014'') の鈍い針でシリンジを使用して ACSF でポンプを満たします。シリンジを取り外しながら、空気が入らないように ACSF を注入し続けます。ポンプの開口部に ACSF バブルが現れます。
         注: 最初の ACSF 注入は、ラットがチックが誘発される前に手術から完全に回復することを可能にします。必要に応じて、ビキュクリン充填ポンプは、次のポンプ交換を避けるために一次手術中に移植することができるが、それは最適ではない^19.
      4. 注射器、27 G (0.014'')鈍い針を注入管の長いカニューレ部分に取り付け、それを通してACSFを注入する。シリンジを取り外しながら、空気が入らないようにACSFを注入し続けます。ACSF バブルは、長いカニューレ部分に表示されます。
      5. 長いカニューレ部分をポンプに挿入し、バブルに泡立てる。ACSFバブルは、注入カニューレの先端に表示されます。
      6. ビーカーにポンプを置きます。このポンプを、注入管に取り付け、ポンプ注入前に少なくとも4〜6時間(〜37°Cで)用する。ポンプだけが生理油に接触することを確認してください。
   6. ポンプ注入手術
      1. 麻酔プロトコルに従ってラットを麻酔します。ステップ 1.2.1 を参照してください。
      2. 電気クリッパーを使用して、ラットの頭と背中を剃り、肩甲骨に少し後ろを付けます。
      3. 手順 1.2.3~1.2.11 に従って、手術の基本手順を実行します。切開は後頭骨まで頭皮に沿っているべきです。
      4. オートクレーブで大きな止(長さ約14cm、5.512')を殺菌します。切開を通して止軟体を挿入し、中間頸部線を通して皮膚の下で交互に開閉することによって、ラットの背中に皮下ポケットを作成します。
         メモ:ポケットは、ポンプを含むのに十分な大きさで、それがわずかに移動できるようにする必要があります。
   7. 小型浸透ポンプおよび注入管の注入
      1. カニューレホルダーをステレオタックスアームに取り付け、移植のために所望の位置に置きます。
      2. 暖房浴からポンプを取り出し、紙の拭き取りで覆われたラットの背中に置きます。
      3. カニューレホルダーの注入チューブのカニューレガイドをスライドさせます。
      4. 止まりでポンプを持ち、皮下ポケットにそっと挿入します。
      5. アンカーネジを埋め込みます。
         注:ポンプを挿入した後、ポケット開口部の閉塞を避けるために、カニューレの変位を避けるためにカニューレの注入前に、アンカーネジを埋め込みます。
      6. 注入カニューレをターゲットに埋め込み、ゲル接着剤を使用して頭蓋骨に接着します。乾くまで待ちます。前肢チック誘導の座標は、AP:+1~+1.5、mL:±2.5、DV:5です。
      7. 注入カニューレに沿って歯科用セメントを塗布し、頭蓋骨に固定します。乾くまで待ちます。
      8. 埋め込まれたカニューレを所定の位置に残してカニューレホルダーを持ち上げます。
      9. 他のすべてのデバイスを埋め込みます。すべてのインプラントをカバーし、頭蓋骨の残りの部分に歯科用セメントを適用します。ラットの自由な移動を可能にするために、皮下ポケットに十分な柔軟なカテーテルチューブを固定したままにしておきます。
         メモ:頭蓋骨とポケットの開口部の間に露出した部分がなく、カテーテルが曲がっていないか確認してください。
      10. 手順 1.2.12.10-1.2.12.11 に詳述されているように手術を確定します。
2. ポンプ交換手術
   注:各ミニ浸透圧ポンプタイプは、独自の所定の送達注入期間を有する。したがって、ポンプ交換手術は、有効期限前に行う必要があります。
   1. 手術前の準備
      1. 手順 2.1.5.1 - 2.1.5.2 を繰り返します。
      2. 27 G (0.014'') 鈍い針で注射器を使用してビキュクリンでポンプを充填します。注射器を取り除きながら、ビキュリンを注入し続け、空気が入るのを防ぐ。
      3. フローモデレータ(半透明のキャップに取り付けられている)をポンプの中に挿入します。
      4. ビーカーにポンプを置きます。ポンプ交換前に、ポンプを4〜6時間(~37°C)以上プライムします。
   2. 手術
      1. ラットを麻酔し(ステップ1.2.1.1を参照)、電気クリッパーを使用して背中を剃ります。
      2. ポビトンヨウ素でラットの背中を振り、その後、アルコール拭きで領域を殺菌します。0.5-1%リドカイン溶液(SC)で所望の切開線に沿って浸潤する。
      3. 埋め込まれたポンプの上の皮膚に切開を行います。室温のACSFでポケットを洗い、ガーゼパッドで乾かします。切開の近くの領域をカバーするためにオートクレーブ使い捨てドレープを使用してください。
      4. 止まりを使用して、フローモデレータからACSF充填ポンプを取り外し、廃棄します。
      5. 暖房浴からビキュリンで満たされたポンプを取り外します。ビキュキュリン充填ポンプからフローモデレータを取り外して廃棄します。
      6. ビキュクリン充填ポンプを、埋め込みフローモデレーターに静かに取り付けます。周囲の皮膚に触れないようにしてください。
         注:手順2.2.2.4-2.2.2.6は、気泡を防ぐために迅速に実行する必要があります。しかし,脳へのビキュクリンの急速な侵入を防ぐためにポンプをゆっくりと挿入すべきである。
      7. 鉗子を使用して、切開の2つのマージンを密接に押します。切開線をティッシュ接着剤で接着します。別の方法として、縫合糸を使用して切開を閉じます。
      8. ポビドネヨウ素で領域をスワブし、ステップ1.2.12.10-1.2.12.11に詳述されているように手術を確定します。

結果

ラットにおけるチック誘導のための急性および慢性モデルを生成するためのプロトコルを上に提示した。プロトコルは、手術と実験のための完全な準備をカバーしています(急性モデルの図1、 慢性モデルの 図2)。 線条体の運動領域へのビキュクリンの適用は、進行中のモーターチックの発現をもたらす。チックは、アプリケーションに対して反対側に表示され、短く、反復的な筋肉の収縮によって特徴付けられる。線条体の前部にビキュクリンの適用後、チックは通常ラットの前肢、頭および/または顎で発現し、後部注射後、後肢¹⁸でチックが発現する。急性モデル(図3A)では、ビキュクリンマイクロインジェクションの数分後にチックが現れ始め、数十分間続き、最終的には崩壊して¹⁸を停止する。慢性モデル(図3B)では、通常、ビキュキュリン充填ポンプ移植

ディスカッション

本稿では、自由に行うラットにおけるチック誘導のための急性および慢性モデルのプロトコルを詳述した。これらのプロトコルは、すべてのコンポーネントの調製、手術、および特定の研究ニーズを満たすためにカスタマイズに適応することができる実験プロセスを記述します。これらのモデルの根底にある主な原理は、線条体の運動領域へのビキュクリンの直接局所適用であり、これは^{、10、11、12}の病態生理学において重要な役割を果たすることが知られている。両方のモデルで、ビキュクリンはカスタムメイドの埋め込みカニューレを介してターゲットに送達される。特定のカニューレ注入ターゲットは、チック発現の所望の身体位置に依存する。線条体は^{、27、28、29、30}に組織されたソーマトピータで...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アンカーねじ	マイクロファスナー	SMPPS0002	#0 x 1/8 - なべ頭板金ねじ
Bicuculline methiodide	シグマ Aldrich	14343
シアノアクリレート (CA) アクセラレータ	Zap	PT29
シアノアクリレート (CA) 接着剤	BSI	IC-2000	この接着剤は、他の接着剤よりも強いことがわかりました
歯科用セメント	コルテン	H00322	ハイジェニックパーマ リペア マテリアル リライン レジン セルフキュア
グルー ゲル	ロックタイト		ウルトラゲル
コントロール止血	WPI	501242	約 14 cm サイズの止血剤で十分です
ハイポチューブ、極薄壁 25G	部品供給会社	HTX-25X
ハイポチューブ、レギュラーウォール 22G	部品供給会社	HTX-22R
ハイポチューブ、レギュラーウォール30G	コンポーネント供給会社	HTX-30R
輸液ポンプマシン	新時代ポンプシステム	NE-1000
ミニ浸透圧ポンプ	ALZET	2001	1.0µ1時間あたりのl、7日間
PE互換接着剤	CEYS		特殊難解プラスチック(PEに適しています)
PE-10カテーテルチューブ	ALZET	PE-10	ID = 0.28mm、OD = 0.61mm精密
ガラスマイクロシリンジ、10µl	ハミルトン	80065	1701 RNR 10µl syr (22s/51/3)
ティッシュ接着剤	3M	1469Sb	Vetbond
チューブアダプター	CMA	3409500
タイゴン マイクロボア チューブ、0.02 インチ ID * 0.06	OD 部品供給会社	TND80-020
ワイヤー 0.005 インチ	部品供給会社	GWX-0050
ワイヤー 0.013 インチ	部品供給会社	GWX-0130