方法論記事

ラットの骨格筋における線維-刺激性前駆腫(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)の同定、分離、および特徴付け

DOI：

10.3791/61750

⸱

2021年6月9日

 ,  ,  , 
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ラット骨格筋から線維-異量体形成前駆体(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)を単離する方法を概説する。筋肉損傷モデルにおけるラットの利用は、分析のための萎縮性筋肉からの組織の可用性の増加と、自由に動く動物の筋力と歩行を評価するための検証された方法のより大きなレパートリーを提供する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

線維-異形成前駆体(FAPs)は、筋形成前駆腫(MP)と共に、筋恒常性、傷害、および修復において重要な役割を果たす骨格筋の中に存在する間質細胞である。FAPsの同定および単離のための現在のプロトコルは、フローサイトメトリー/蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用し、これまでの 生体内機能 を評価する研究はマウスのみで行われてきた。ラットの大きな固有のサイズは、骨格筋傷害モデルにおけるFAPsのより包括的な分析を可能にします, 特に重度の萎縮性筋肉で、または研究者が複数の下流アッセイを行うためにかなりの組織質量を必要とする場合.ラットはさらに、動物の沈下や犠牲を必要としない筋肉機能アッセイの選択肢を増やし、連続評価を可能にすることで罹患率と動物の使用を最小限に抑えます。マウスに最適化されたフローサイトメトリー/FACSプロトコルは、種特異的であり、特に市販の抗体の特性によって制限される。それらはラットまたは非常に線維性の筋肉からFAPsを分離するために最適化されていません。.表面マーカーCD31、CD45、Sca-1、およびVCAM-1の微分発現に依存して、健康なラット骨格筋と両方からのFAPsとMPの同定と分離のためのフローサイトメトリー/FACSプロトコルが開発された。ラット特異的として、フローサイトメトリー検証された一次抗体は厳しく制限され、Sca-1を標的とする抗体の社内コンジュゲーションが行われた。このプロトコルを用いて、Sca-1の結合が成功することが確認され、FACS分離されたFAPsおよびMPの細胞培養および免疫染色によって、FAPsおよびMPのフローサイトメトリック同定が検証された。最後に、新しいFAPsのタイムコースを長期(14週間)ラット脱樹モデルで報告します。この方法は、研究者が新しい動物モデルでFAPsを研究する能力を提供する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

線維-異形成前駆細胞(FAPs)は、筋肉恒常性、修復、再生に重要な役割を果たす骨格筋中の常駐多能前駆細胞の集団であり、逆に、筋肉損傷に対する病理学的応答を媒介する。その名の通り、FAPはもともと線維芽細胞および脂肪細胞1に分化する可能性のある前駆体集団として同定され、慢性傷害および疾患における骨格筋の線維脂肪浸潤の主要なメディエーターであると言われた。さらなる研究は、FAPsが骨形成および軟骨形成の追加可能であることを明らかにした2、3、4。したがって、それらは間葉または間質前駆子3、5、6、7、8として文献でより広く公示されている。急性骨格筋損傷において、FAPsは、活性化された筋肉衛星細胞およびそれらの下流筋性前駆細胞(MP)の対応する1、9、10に有利な環境を提供するために一過性増殖することによって再生筋形成を間接的に助ける。正常な再生と並行して、FAPsはアポトーシスを受け、その数値をベースラインレベル1、9、10、11に戻します。対照的に、慢性筋損傷では、FAPはプロアポトーシス信号を上書きし、持続性9、10、11および異常な筋肉修復をもたらす。

IN Vivo研究では、現在までに1、7、9、10、11、12、13、14までのマウス動物モデルを利用した、FAPsが筋肉応答を媒介する細胞および分子機構を評価する。遺伝子組み換えマウスはこれらの分析に使用するための強力なツールですが、動物の小さなサイズは、外傷性脱化などの筋肉萎縮が深遠である長期的な局所的な傷害モデルでの研究のための組織の可用性を制限します。さらに、筋力と身体機能の測定には、ex vivoまたはマウスの終了を必要とするその際の測定、または筋肉収縮性能15、16、17、18、19、20の評価を可能にする手術および/または全身麻酔薬を必要とするインビボ法が必要です。 .ラットでは、十分に検証され、世界的に利用された筋肉機能分析、歩行分析などのより複雑な運動行動(例えば、坐骨機能指数、CatWalk分析)の分析に加えて存在し、目を覚まし、動物21、22、23、24で起こって行われる.これはさらに動物実験における最小の罹患率の原理、および使用される研究動物の数を最適化する。ラットはそれによって、FAPsの調査官に、タンパク質および細胞分析のためのより大きな負傷した筋肉容積の追加の柔軟性および警報動物における筋肉複合体静的および動的機能活性および行動の連続評価を行う能力を提供する。

FAPsは、フローサイトメトリーと蛍光活性化細胞分類(FACS)を使用して、主に全筋サンプルから同定され、単離されています。これらは、サイズ、粒度、および細胞表面または細胞内マーカー25の特異的組み合わせなどの特徴に基づいて複数の特定細胞集団を同定することができるレーザーベースのアッセイである。これは、骨格筋などの器官系の研究において非常に有利であり、恒常性および再生は複雑で多因子的なプロセスであり、多くの細胞タイプによって調整される。精細な研究では、マウス骨格筋1のフローサイトメトリック法を使用して、MPと同様にFAPsを同定した。彼らは、内皮(CD31)、造血薬(CD45)、または筋原性(Integrin-α7[ITGA7])由来の細胞に特異的な表面抗原を欠いていたが、間葉系幹細胞マーカーSca-1(幹細胞抗原1)1および線維化細胞細胞に分化された表面抗原を欠いていたため、FAPsが本質的に間葉系であることを実証した。他の研究は、代替幹細胞マーカーの発現に基づいて筋肉中間葉系前駆細胞の分離に成功したことを示した、血小板由来増殖因子受容体α(PDGFRα)2、7、8およびさらなる分析は、これらは、FAPs3と同じ細胞集団である可能性が高いことを明らかにした。正の選択マーカーとしてSca-1またはPDGFRαのいずれかを使用してフローサイトメトリーで一般的に識別される1,9, 10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 .PDGFRαの使用はヒト組織に対して優先的であるが、マウスSca-1の直接的なヒトホモロゲーとしては、まだ32を同定していない。さらに、他の細胞表面タンパク質は、MP(例えば、VCAM−1)のマーカーとして報告されており、FAPsの分離33の間に筋形成系統の細胞の指標としてITGA7に代わる可能性がある。

フローサイトメトリー/FACSは骨格筋1、9、10、11、13、29におけるFAPsの役割と病原性ポテンシャルを研究するための強力な方法論であるが、それは技術的に必要な試薬の特異性と最適化によって制限される。フローサイトメトリック同定とFAPsの単離はマウス動物モデル1、9、10、11、29で開発され、実施されているため、他のモデル生物の中でのFAPsの研究を希望する研究者にとっては課題となっています。処理対象の最適な組織サイズや、試薬や抗体の特異性や入手可能性など、多くの要因は、使用する種によって異なります。

新しい動物モデルでFAPsを研究するための技術的な障壁に加えて、それらは主に急性の有毒な設定で研究されています - 通常、筋肉内化学注射または心毒を介して。FAPsの長期的なダイナミクスの評価は、主にデュシェンヌの筋ジストロフィーの評価に限定され、mdxマウスモデル9、10、11、および肩筋筋症に対して同時腱管切れと脱用が行われる大規模なローテーターカフ涙などの組み合わせ筋損傷のモデル.慢性外傷性脱児の唯一の侮辱に対するFAPsの反応は、重工業、農業、および出生時外傷(上腕神経叢損傷)34、35、36、37で重大な罹患率を有する職場における事故において一般的に起こり、顕著な罹患率を有する、しばしば短期間の期間11、38に限定される。

ラットの腫性および線維性骨格筋の健康から、また重度の萎縮性および線維性骨格筋から、FAPおよびMPを同定し、単離する方法について述べる。まず、組織消化およびフローサイトメトリー染色プロトコルを用いたCD31-/CD45-/Sca-1-FAおよびCD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+MPの同定が実証され、その後の知見の検証は、FACS分離細胞の培養および免疫細胞化学染色を通じて行われる。この方法を用いて、ラットにおける長期隔離された脱用傷害モデルにおける新規のFA時間コースも報告する。

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プロトコル

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この議定書を実施する調査官は、地元の動物倫理委員会/ケア委員会の許可を受ける必要があります。すべての動物の仕事は、セントマイケルズ病院ユニティヘルストロント動物ケア委員会(ACC #918)によって承認され、カナダ動物ケア評議会(CCAC)が定めたガイドラインに従って行われました。フローサイトメトリープロトコルの概略を 図1に示します。下流のアプリケーションが FACS とその後の細胞培養である場合、すべてのステップは適切な無菌技術で完了する必要があります。

1. 筋肉の収穫

  1. 局所の生体および動物倫理委員会のガイドラインに従って適切な麻酔薬と犠牲を使用してラットを麻酔します。このプロトコルは、例として、成人雌ルイスラット(200〜250g)から胃頭筋を収穫する。ラットを2-3%イオブルランを用いて麻酔し、T61の心臓内注射によって屠殺した。
  2. 動物が犠牲になったら、後肢全体を剃って筋肉の位置を容易にし、収穫された組織の毛皮汚染を最小限に抑えます。
  3. 無菌メスを使用して、皮膚に2つの切開を行います:足首関節の円周の周りの最初の周りと足首から股関節への後肢の内側の正中線上の2番目。
  4. 皮膚と表面筋層を剥離して、大腿骨の内側および内側顆に由来し、アキレス腱で挿入する基礎となる胃腸炎を明らかにする。
  5. 鈍い解剖を使用して胃腸を周囲の組織から分離し、腱でのみ筋肉を取り扱い、クラッシュ傷害を避ける。
  6. 鋭いはさみでアキレス腱をできるだけ遠位に移すことによって、胃腸を挿入から分離する。切断したら、鉗子でアキレス腱をつかみ、下敷きの骨から胃腸を静かに剥がします。それでも筋肉を片手に鉗子で保持し、胃食道の2つの起源を見つけ、内側と内側の大腿骨顆で切断する。
  7. できるだけ多くの血液を除去するために、無菌のガーゼに対して優しく切除された胃腸をブロットします。無菌表面の筋肉をトリミングし、余分な結合組織だけでなく、アキレス腱を削除します。
  8. 重量ボートに筋肉を入れ、精密スケールを使用して重量を量る。このプロトコルは、200〜600 mgの範囲の湿った体重で筋肉を消化するように最適化されています。オペレータは、必要に応じて、他の下流アッセイのために過剰な収穫された組織を細分化することができる。
  9. さらに、流量サイトメトリーに使用する収穫した筋肉をさらに3~4個(約1〜2cm3)に分け、氷冷1x PBSに沈水します。すべてのサンプルが収穫されるまで氷の上で冷たく保ちます。

2. 筋肉の消化

  1. PBSから筋肉を取り除き、無菌10cm細胞培養皿に入れます。そっと裂け、そして、部分がおよそ3-4 mm3になるまで鉗子でティッシュを軽く引き裂き、できるだけ多くの結合組織を取り除く。十分にみじん切りにしたら、6 mL DMEM + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を含む無菌50 mL円錐状チューブに移します。
  2. コラゲナーゼII溶液(ストック濃度4800 U/mL)の365 μLに300 mMCaCl2溶液の10 μLを加え、コラゲナーゼ酵素を活性化します。活性化コラゲラーゼII溶液を、組織スラリーを含む50 mL円錐管に加えます。最終的なコラゲローゼII濃度は250 U/mLです。
  3. 37°C、240 x gで1時間シェーカーにチューブをインキュベートし、15分ごとに手動で旋回して、チューブの側面に付着した組織を取り除くようにします。
  4. 1時間後、シェーカーからチューブを取り出し、サンプルごとに100 μL(4,800 U/mL)と50μLのディスパーゼ(4.8 U/mL)を加えます。
  5. 溶液が均質になるまで血清学的ピペットを15〜20回使用したピペットサンプル。複数のサンプルを処理する場合は、サンプルのクロスコンタミネーションを避けるために、各サンプルに個別の滅菌ピペットを使用してください。
  6. 37°Cと240 x gで30分間シェーカーに再びインキュベートします。15分後、サンプルを手で振って、チューブの側面から付着組織を外します。

3. 単一細胞懸濁液の生成

  1. 10 G針の10 mLシリンジを通してサンプルをゆっくりと剪断し、10サイクルで使用します。
    注:1サイクルは、注射器に筋肉溶液を取り込み、チューブに戻す必要があります。過度の泡立ちが細胞死を余しにする可能性が高い39の原因となるため、剪断をゆっくりと完了して気泡を最小限に抑えるようにしてください。
  2. 40 μmのセルストレーナーを無菌50 mL円錐形チューブに置き、5 mL DMEM + 10% FBS + 1% P/Sを湿潤させます。
  3. ピペット1 mLのサンプルを細胞ストレーナーを介して一度に。









    11. figure-protocol-1









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結果

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Sca-1およびVCAM-1を含む新規抗体パネルを用いたフローサイトメトリーによるFAおよびMPの同定
ラット筋のFAPsを同定するためのゲーティング戦略は、マウス29のフローサイトメトリープロトコルに基づいており、CD31(内皮)およびCD45(造血)陽性細胞(系統[Lin]と呼ばれます)のゲートであり、リンジ陰性(Lin-陰性)からのFAPsマーカーSca-1およびMP MarkerGA7の蛍光プロファイルを調べる。市販のフルオロフォア結合、およびラットSca-1およびITGA7に対するフローサイトメトリー検証抗体がない場合、ラットSca-1::APC抗体を自己結合し、MPを同定するための代替戦略を実施しました。VCAM-1は、最近、ラットMP33 およびラット特異的な、共役した、フローサイトメトリー検証抗体を標的とするVCAM-1の単一の選択マーカーであることが示されたように、ITGA7とは対照的...

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ディスカッション

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ラットの筋肉のための最適化された、検証されたFAPs分離プロトコルは、生物学的または技術的な理由のためにマウスで実現不可能な傷害モデルを研究したい研究者にとって不可欠です。例えば、マウスは、慢性局所的、または長期脱退などの神経変性傷害を研究するための最適な動物モデルではない。生物学的には、マウスの短い寿命と急速な老化は、老化の交絡因子からの脱用による筋肉のイコナを正確に引き出すことを困難にする。技術的な観点から、重度の萎縮による筋肉量の大幅な減少は、効果的なフローサイトメトリック分析には不十分であろう。実際、マウスの FAPs 分離プロトコルは、正常な筋肉をグループ化して、並べ替えられた FAPs29の収率を上げることを提案しています。これは、分析のための十分な筋肉組織を得るための技術的な障壁を解決しながら, それは同時に筋肉固有のレベルでFAPsを評価することから研究者を制限します..特定の筋肉群は繊維型組成、血管化の程度、およびミトコンドリアの数47に本質的に異なるため、例えばフローサイトメトリック解析のために複数の異なる筋肉を組み合わせ...

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開示事項

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著者らは開示する矛盾はない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

オタワ大学のフローサイトメトリーコア施設と、セントマイケルズ病院ユニティヘルストロントのセントマイケルズ病院ユニティヘルストロントのフローサイトメトリーコア施設に、この原稿に記載されているフローサイトメトリー/FACSプロトコルの最適化に関する専門知識とガイダンスに感謝します。この作品は、デザインによる医学による新しいアイデア2018ファンド(MbDNI-2018-01)からJBに資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5 mL ポリプロピレン丸底チューブファルコン352063
5 mL ポリスチレン丸底チューブ 細胞ストレーナーキャップ付きファルコン352235
10 cm 細胞培養皿Sarstedt83.3902
12 ウェル細胞培養プレートThermoFisher130185
12 mm ガラスカバースリップ、No.2VWR89015-724
10 mLシリンジベクトン・ディッケンソン302995
15 mL遠心分離管FroggaBio91014
20ゲージ針ベクトン・ディッケンソン 305176
25mL 血清ピペットSarstedt86.1685.001
40µm細胞ストレーナーFisher Scientific22363547
50mL 遠心チューブFroggaBioTB50
AbC Total Antibody Compensation ビーズ サーモフィッシャーA10497
塩化アンモニウム、試薬グレードバイオショップAMC303.500
APCコンジュゲーションキット、50-100µgBiotium92307
Aquatex 水性埋込媒体メルク108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
ウシ血清アルブミン (BSA)BioshopALB001
塩化カルシウムBioshopCCL444.500
コラゲナーゼII型Gibco17101015
CountBright Plus アブソリュート カウンティング ビーズサーモフィッシャーC36995
デキサメタゾンミリポア シグマD4902
ディスパーゼギブコ17105041
ダルベッコ 'Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4.5 g/L D-グルコース
(+)L-グルタミン
(+)110 mg/L ピルビン酸ナトリウム
EDTAフィッシャーサイエンティフィックS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson
ウシ胎児血清ΣF1051
フローサイトメトリー シース液Beckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson--
蛍光 実装 媒体DakoS302380-2
ヤギ 抗マウス Alexa Fluor 555 二次抗体InvitrogenA21424
ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 488 二次抗体InvitrogenA11008
ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 555 二次抗体InvitrogenA21429
ヤギ血清Gibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) フェノールレッド
(+) L-グルタミン
(-) HEPES
ハンク's 平衡塩溶液 (HBSS) (1X)マルチセル311-513-CL
熱不活化馬血清Gibco26050-088
血球計算盤ライヒェルトN/A
HEPES、最小 99.5% 滴定シグマH3375
馬血清サーモフィッシャー16050130
ヒト トランスフォーミング成長因子 &β;1 (hTGF-β1)細胞シグナル伝達8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879別名 3-イソブチル-1-メチルキサンチン
イソプロパノールSigmaI9516別名 2-プロパノール
ルイスラット、女性チャールズ リバー キングストン004 (株コード)200-250 グラム
使用 LSRFortessa X-20卓上サイトメーターBeckton Dickenson--
微量遠心分離機EppendorfEP-5417R
MoFlo XDP Cell SorterBeckman Coulter--
マウス抗CD31::FITC 抗体Abcam ab33858クローンTLD-3A12
マウス抗CD45::FITC 抗体Biolegend202205クローンOX-1
マウス抗CD106::P E抗体バイオレジェンド200403別名 VCAM-1
マウス 抗 MHC 抗体Developmental Studies ハイブリドーマバンク (DSHB)該当なし別名 MF20
マウス 抗 Pax7 抗体Developmental Studies ハイブリドーマバンク (DSHB)該当なし
中性緩衝ホルマリン、10 %シグマ HT501128
オイル レッド Oミリポア ΣO0625
PE-Cy7 結合キットAbcamab102903
ペニシリン-ストレプトマイシンSigma P4333
リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4 (1X)Gibco10010-023(-)塩化カルシウム
(-)塩化マグネシウム
炭酸カリウム、試薬グレードBioshopPBC401.250
ウサギ抗線維芽細胞特異的タンパク質 1 (FSP-1) 抗体InvitrogenMA5-32347FSP-1 別名 S100A4
ウサギ抗インテグリン-a7 抗体Abcamab203254
抗ラミニン抗体シグマL9393
抗ペリリピン-1抗体Abcamab3526
抗SCA-1抗体ミリポアシグマAB4336
組換え抗コラーゲンI型抗体Abcamab260043Col1a1
ウサギ組換え抗PDGFRとしても知られていますアルファ抗体Abcamab203491
換えヒトFGF-塩基性GibcoPHG0266
アジ化ナトリウムシグマS2002
トン-X-100ッシャーサイエンティフィックBP151
グリタゾンミリポアシグマT2573
イーン-20バイオショップTWN510
340346 重ウサギウサギウサギウサギ組トリフィトロツ

参考文献

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