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細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

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Research Article

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

DOI: 10.3791/61775

October 2, 2020

, , , ,

1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology,Western University, 3Department of Oncology,Western University, 4Lawson Health Research Institute

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Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

この実験プロトコルでは、乳がん細胞および組織サンプルからのBCSCの単離、ならびにBCSCの表現型と機能を評価するために使用できるin vitro および in vivo アッセイについて説明します。

Abstract

乳がん幹細胞(BCSC)は、遺伝性または後天性の幹細胞のような特徴を持つがん細胞です。頻度が低いにもかかわらず、乳がんの開始、再発、転移、治療抵抗性の主な原因です。乳がんを治療するための新しい治療標的を特定するためには、乳がん幹細胞の生物学を理解することが不可欠です。乳がん幹細胞は、CD44、CD24などのユニークな細胞表面マーカーの発現およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)の酵素活性に基づいて単離および特徴付けられます。これらのALDH高CD44+CD24- 細胞はBCSC集団を構成し、下流の機能研究のために蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって単離することができます。科学的問題に応じて、異なるインビ トロ および インビボ の方法を使用して、BCSCの機能的特性を評価することができます。ここでは、乳がん細胞の不均一な集団と乳がん患者から得られた原発腫瘍組織の両方からヒトBCSCを単離するための詳細な実験プロトコルを提供します。さらに、BCSC機能の評価に使用できるコロニー形成アッセイ、マンモスフェアアッセイ、3D培養モデル、腫瘍異種移植アッセイなど、下流のin vitro および in vivo 機能アッセイを強調しています。

Introduction

ヒト乳がん幹細胞(BCSC)の細胞的および分子的メカニズムを理解することは、乳がん治療で直面する課題に取り組むために重要です。BCSCの概念の出現は21世紀初頭にさかのぼり、CD44 + CD24-/低乳がん細胞の小さな集団がマウスで不均一な腫瘍を生成できることが判明しました1,2。その後、アルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性が高い(ALDHhigh)ヒト乳がん細胞も同様の幹細胞様特性を示すことが観察されました3。これらのBCSCは、自己複製および分化が可能な細胞の小さな集団を表し、バルク腫瘍の不均一な性質に寄与する1、2、3。進化的に保存されたシグナル伝達経路の変化がBCSCの生存と維持を促進することを示唆する証拠の蓄積4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 .さらに、細胞外因性微小環境は、異なるBCSC機能を指示する上で極めて重要な役割を果たすことが示されている15、16、17。これらの分子経路とBCSC機能を調節する外的要因は、乳がんの再発、転移18、および治療に対する耐性の発達に寄与しており19,20,21、治療後のBCSCの残存存在は、乳がん患者の全生存に大きな課題をもたらします22,23。.したがって、これらの因子の前臨床評価は、乳がん患者のより良い治療結果と全生存期間の改善を達成するために有益である可能性のあるBCSC標的療法を特定するために非常に重要です。

いくつかのインビトロヒト乳癌細胞株モデルおよびインビボヒト異種移植片モデルが、BCSCを特徴付けるために使用されています24、25、26、27、28、29。連続継代のたびに細胞株が継続的に再増殖する能力により、これらはオミクスベースおよび薬理ゲノム研究を実施するための理想的なモデルシステムになります。しかし、細胞株は、患者サンプルで観察された不均一性を再現できないことがよくあります。したがって、細胞株データを患者由来のサンプルで補完することが重要です。BCSCを最も純粋な形で単離することは、BCSCの詳細な特性評価を可能にするために重要です。 この純度を達成することは、BCSCに特異的な表現型マーカーの選択に依存します。 現在、ALDH高CD44 + CD24-細胞表現型は、最大純度の蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、バルク乳がん細胞集団からヒトBCSCを区別および分離するために最も一般的に使用されています1、3,26。さらに、自己複製、増殖、分化などの単離されたBCSCの特性は、in vitroおよびin vivo技術を使用して評価できます。

例えば、インビトロコロニー形成アッセイは、異なる処理条件30の存在下で50個以上のコロニーを形成するために単一細胞が自己複製する能力を評価するために使用することができる。マンモスフェアアッセイは、足場非依存条件下での乳がん細胞の自己複製の可能性を評価するためにも使用できます。このアッセイは、無血清非接着培養条件における各連続継代において、単一細胞がスフェア(BCSCと非BCSCの混合物)として生成および増殖する能力を測定する31。さらに、3次元(3D)培養モデルを使用して、 in vivo 微小環境を厳密に再現し、潜在的なBCSC標的療法の活性の調査を可能にする細胞-細胞間および細胞-マトリックス相互作用を含むBCSC機能を評価できます32。in vitroモデルの多様なアプリケーションにもかかわらず、in vitroアッセイのみを使用して in vivo 条件の複雑さをモデル化することは困難です。この課題は、マウス異種移植片モデルを使用して in vivoでのBCSC挙動を評価することで克服できます。特に、このようなモデルは、乳癌転移33を評価し、疾患進行中の微小環境との相互作用を調査し34、 in vivo イメージング35、および抗腫瘍剤34の患者特異的毒性および有効性を予測するための理想的なシステムとして役立つ。

このプロトコルは、不均一な乳がん細胞のバルク集団から最大純度でヒトALDH高CD44 + CD24-BCSCを単離するための詳細な説明を提供します。また、3つのin vitro技術(コロニー形成アッセイ、マンモスフェアアッセイ、および3D培養モデル)と、BCSCのさまざまな機能を評価するために使用できるin vivo腫瘍異種移植アッセイの詳細な説明も提供します。これらの方法は、BCSC生物学の理解および/または新規BCSC標的療法の調査を目的として、ヒト乳がん細胞株または初代患者由来の乳がん細胞および腫瘍組織からのBCSCの単離および特性評価に関心のある研究者による使用に適しています。

Protocol

同意した乳がん患者から直接患者由来の外科的または生検サンプルを収集することは、施設倫理委員会によって承認された承認された人間の倫理プロトコルの下で実施されました。患者由来の異種移植片モデルを生成するために使用されたすべてのマウスは、施設が承認した動物施設で維持および収容された。マウスを用いた患者由来の異種移植片モデルからの腫瘍組織は、施設動物管理委員会によって承認された承認された倫理プロトコルに従って生成された。

1. 細胞株の作製

  1. バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下ですべての細胞培養および染色手順を実行します。滅菌済みの細胞培養皿/フラスコおよび試薬を使用してください。
  2. ヒト乳がん細胞を37°Cに維持し、ウシ胎児血清(FBS)および各細胞株に特異的に必要な成長因子を添加した定義培地に5%CO2 を入れます。





  11. &B

Figure 1

Figure 2






Figure 3





Representative Results

記載されたプロトコルは、細胞株または解離した腫瘍組織のいずれかからの乳癌細胞の不均一な集団からのヒトBCSCの単離を可能にする。特定の細胞株または組織サンプルについて、汚染された非BCSC集団が変動する可能性があるため、BCSCを最大純度で単離するための均一な単一細胞懸濁液を生成することが重要です。 厳格な選別戦略を適用すると、汚染された非BCSCの存在が最小限に抑えられ、乳がん細胞の割合を収集する能力が得られます。癌細胞のバルク集団と区別する細胞表現型を示す幹細胞のような特徴を持つ。ALDH酵素活性の増強、高レベルの細胞表面マーカーCD44を発現し、CD24の低/陰性発現を示すヒト乳癌細胞は、ALDH高CD44+CD24-表現型を有し、BCSCに分類することができる。バルク集団におけるBCSCの割合は、細胞株または患者によって異なる可能性があり(図2)、多くの場合、疾患の病期に依存し、より侵攻性の乳がんは通常、BCSCの割合が高くなります26、36、37。

単離されたBCSCは、異なるin vitro および in vivo アッセイを実行するために使用でき、その挙動および機能をバルクおよび/または非BCSC集団の挙動および機能と比較することができます。例えば、単一の乳癌細胞が自己複製し、50個の細胞のコロニーを生成する能力は、コロニー形成アッセイによって評価することができる(図3A)。足場に依存しない実験条件下でBCSCが自己複製する能力は、マンモスフェアアッセイによって評価でき、可変の球数、サイズ、および球開始能力を分析し、BCSCの存在と機能と相関させることができます(図3B)。最適な結果を得るには、さまざまな乳がん細胞株または乳がんサンプルの播種細胞密度を決定することが重要です。細胞密度が高いと細胞凝集につながり、細胞活性が誤って解釈される可能性があるため、これはSLDAを実行する場合に特に重要です。

BMEで乳がん細胞を培養することで、BCSCはin vivo条件を再現する3D構造を形成することができます(図3C)。線維芽細胞、内皮細胞、および/または免疫細胞などの他の微小環境細胞タイプの存在下での乳癌細胞の3D培養は、BCSCの3D増殖における微小環境の役割を調査するための追加の能力を有する38,39。3Dオルガノイドの生成に必要な具体的な細胞数は、細胞株や患者の腫瘍源によって異なるため、大規模な実験の前に培養条件と細胞数を最適化することが重要です。

最後に、in vivoマウス異種移植片モデルを使用して、非BCSCまたはバルク細胞集団と比較したin vivoでのBCSCの成長(図4)の自己複製、分化、および/または腫瘍開始能力の違いを理解することができます。多くの場合、外因性因子または治療薬の存在下で観察されるin vitro細胞応答は、in vivo設定を代表するものではなく、in vitro観察は、可能な限りin vivo研究で補完されるべきであることを示唆しています。in vivo異種移植片モデルを使用すると、細胞の不均一性と腫瘍構造が保存されるため、これらのモデルは、ヒト患者の微小環境を厳密に模倣するシステムとして機能します。生体内LDAは、がん細胞の特定の混合集団(BCSCまたは非BCSC)における腫瘍開始細胞の割合を決定するために実行できます40,41。使用される細胞希釈の範囲は最適化されるべきであり、目的の細胞集団における開始細胞の割合に依存する。理想的には、これらの希釈液には、腫瘍形成がなく、その間の妥当な範囲の細胞用量まで、100%の腫瘍形成をもたらす用量を含める必要があります。一次サンプル中の腫瘍開始細胞の頻度は変動する可能性があり、乳房腫瘍の数が非常に少ないか、腫瘍開始細胞の集団が非常に不均一である場合、LDAを実行することは特に困難な場合があります42。このような場合、乳がんの生物学を理解するには、より多くの細胞を注入する方が適切です。

Figure 4
図4:BCSC機能を評価するためのin vivo異種移植アッセイ。MDA-MB-231乳癌細胞を、図1に記載されるようにFACSによって単離し、プロトコルセクション9.1〜9.8(5 x 105細胞/マウス;4匹のマウス/細胞集団)に記載されているように、雌NSGマウスの右胸部乳腺脂肪パッドに注射した。原発性乳房腫瘍の成長動態は、ALDHhiCD44 + CD24-(■)集団とALDH低CD44低/-CD24+(□)集団で示されています。データは平均±として表されるS.E.M. * =同じ時点でのそれぞれのALDH低CD44低/-サブセットよりも有意に異なる腫瘍サイズ(P<0.05)。この図はクローカーら26から改作された。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

著者は開示するものは何もありません。

Disclosures

この実験プロトコルでは、乳がん細胞および組織サンプルからのBCSCの単離、ならびにBCSCの表現型と機能を評価するために使用できるin vitro および in vivo アッセイについて説明します。

Acknowledgements

研究室のメンバーの有益な議論とサポートに感謝します。乳がん幹細胞と腫瘍微小環境に関する私たちの研究は、カナダがん研究協会研究所および米国陸軍国防総省乳がんプログラム(Grant # BC160912)からの助成金によって資金提供されています。V.B.はウエスタン・ポスドク・フェローシップ(ウエスタン大学)の支援を受けており、A.L.A.とV.B.はどちらもカナダ乳がん協会の支援を受けています。CLは、カナダ政府からのバニエカナダ大学院奨学金によってサポートされています。

Materials

細胞 ください ズ
7-アミノアクチノマイシンD(7AAD)BD51-68981E提案:0.25 µg/1x106
アセトンフィッシャーA18-1
アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)基質Stemcell Technologies1700ALDEFLOUR Assay kitの一部として市販されている。ALDH基質調製については、製造元の指示に従って
基底膜抽出物(BME)Corning354234商品名Matrigel
で販売されています細胞培養プレート:6ウェルコーニング877218
細胞培養プレート:60mmコーニング353002
細胞培養プレート:96ウェル超低接着コーニング3474
セルストレーナー:40ミクロンBD352340
コラーゲン幹細胞技術7001PBS中の3mg/mLコラーゲンを1:30希釈液で調製
コラゲナーゼSigma 110888070011x
コニカルチューブ:50 mLFisher scientific05-539-7
クリスタルバイオレットSigmaC6158ディ
スパーゼステムセルテクノロジー79135U/mL
DMEM:F12Gibco11330-0321x、L-グルタミンおよび15 mM HEPES付き
DNAseSigmaD50520.1 mg/mL 最終濃度
FBSAvantor Seradigm Lifescience97068-085 
フローチューブ:5mlBD352063ポリプロピレン丸底チューブ
メタノールフィッシャー84124
マウス抗ヒト CD24 抗体BD 561646R-フィコエリトリンおよびシアニン色素 結合 クローン:ML5
マウス 抗ヒト CD44 抗体BD555479R-フィコエリトリン結合、クローン:G44-26
N、N-ジエチルアミノベンズアルデヒド (DEAB)Stemcell Technologies1700ALDEFLOUR Assay kitの一部として市販されています。製造元の指示に従ってください DEAB調製
PBSWisent Inc311-425-CL1x, カルシウムおよびマグネシウムなし
Trypsin-EDTAGibco25200-056
Mammosphere Media組成
B27Gibco17504-441x
bFGFSigmaF200610 ng/mL
BSABioshopALB00304%
DMEM:F12Gibco11330-0321x、L-グルタミンと 15 mM HEPES
EGFシグマE964420 ng/mL
インスリンシグマ166345 µg/mL
3D オルガノイド培地 組成
A8301Tocris2939500 nM
B27Gibco17504-441x
DMEM:F12Gibco11330-0321x、L-グルタミンおよび 15 mM HEPES
EGFシグマE96445 ng/mL
FGF10Peprotech100-2620 ng/mL
FGF7Peprotech100-195 ng/mL
GlutaMaxInvitrogen35050-0611x
HEPESGibco15630-08010 mM
N-アセチルシステインSigmaA91651.25 mM
神経反射 &β;1Peprotech100-035 nM
ニコチンアミドΣN06365 mM
NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
R-spondin3R&D3500250 ng/mL
SB202190SigmaS7067500 nM
Y-27632Tocris12545 µメートル

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