この実験プロトコルでは、乳がん細胞および組織サンプルからのBCSCの単離、ならびにBCSCの表現型と機能を評価するために使用できるin vitro および in vivo アッセイについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
乳がん幹細胞(BCSC)は、遺伝性または後天性の幹細胞のような特徴を持つがん細胞です。頻度が低いにもかかわらず、乳がんの開始、再発、転移、治療抵抗性の主な原因です。乳がんを治療するための新しい治療標的を特定するためには、乳がん幹細胞の生物学を理解することが不可欠です。乳がん幹細胞は、CD44、CD24などのユニークな細胞表面マーカーの発現およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)の酵素活性に基づいて単離および特徴付けられます。これらのALDH高CD44+CD24- 細胞はBCSC集団を構成し、下流の機能研究のために蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって単離することができます。科学的問題に応じて、異なるインビ トロ および インビボ の方法を使用して、BCSCの機能的特性を評価することができます。ここでは、乳がん細胞の不均一な集団と乳がん患者から得られた原発腫瘍組織の両方からヒトBCSCを単離するための詳細な実験プロトコルを提供します。さらに、BCSC機能の評価に使用できるコロニー形成アッセイ、マンモスフェアアッセイ、3D培養モデル、腫瘍異種移植アッセイなど、下流のin vitro および in vivo 機能アッセイを強調しています。
概要
ヒト乳がん幹細胞(BCSC)の細胞的および分子的メカニズムを理解することは、乳がん治療で直面する課題に取り組むために重要です。BCSCの概念の出現は21世紀初頭にさかのぼり、CD44 + CD24-/低乳がん細胞の小さな集団がマウスで不均一な腫瘍を生成できることが判明しました1,2。その後、アルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性が高い(ALDHhigh)ヒト乳がん細胞も同様の幹細胞様特性を示すことが観察されました3。これらのBCSCは、自己複製および分化が可能な細胞の小さな集団を表し、バルク腫瘍の不均一な性質に寄与する1、2、3。進化的に保存されたシグナル伝達経路の変化がBCSCの生存と維持を促進することを示唆する証拠の蓄積4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14
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プロトコル
同意した乳がん患者から直接患者由来の外科的または生検サンプルを収集することは、施設倫理委員会によって承認された承認された人間の倫理プロトコルの下で実施されました。患者由来の異種移植片モデルを生成するために使用されたすべてのマウスは、施設が承認した動物施設で維持および収容された。マウスを用いた患者由来の異種移植片モデルからの腫瘍組織は、施設動物管理委員会によって承認された承認された倫理プロトコルに従って生成された。
1. 細胞株の作製
- バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下ですべての細胞培養および染色手順を実行します。滅菌済みの細胞培養皿/フラスコおよび試薬を使用してください。
- ヒト乳がん細胞を37°Cに維持し、ウシ胎児血清(FBS)および各細胞株に特異的に必要な成長因子を添加した定義培地に5%CO2 を入れます。
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結果
記載されたプロトコルは、細胞株または解離した腫瘍組織のいずれかからの乳癌細胞の不均一な集団からのヒトBCSCの単離を可能にする。特定の細胞株または組織サンプルについて、汚染された非BCSC集団が変動する可能性があるため、BCSCを最大純度で単離するための均一な単一細胞懸濁液を生成することが重要です。 厳格な選別戦略を適用すると、汚染された非BCSCの存在が最小限に抑えられ、乳がん細胞の割合を収集する能力が得られます。癌細胞のバルク集団と区別する細胞表現型を示す幹細胞のような特徴を持つ。ALDH酵素活性の増強、高レベルの細胞表面マーカーCD44を発現し、CD24の低/陰性発現を示すヒト乳癌細胞は、ALDH高CD44+CD24-表現型を有し、BCSCに分類することができる。バルク集団におけるBCSCの割合は、細胞株または患者によって異なる可能性があり(図2)、多くの場合、疾患の病期に依存し、より侵攻性の乳がんは通常、BCSCの割合が高くなります26.......
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ディスカッション
乳がんの転移と治療に対する抵抗性は、世界中の女性の死亡の主な原因となっています。乳がん幹細胞(BCSC)の亜集団の存在は、転移の増強に寄与する26、43、44、45、46および治療抵抗性21、47、48に寄与する。したがって、将来の治療の焦点は、より良い治療結果を達成するためにBCSCを根絶することを目指すべきであり、これには、in vitroおよびin vivoの両方の方法を使用してBCSCの機能特性を単離および特徴付けるための正確な方法が必要です。
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
研究室のメンバーの有益な議論とサポートに感謝します。乳がん幹細胞と腫瘍微小環境に関する私たちの研究は、カナダがん研究協会研究所および米国陸軍国防総省乳がんプログラム(Grant # BC160912)からの助成金によって資金提供されています。V.B.はウエスタン・ポスドク・フェローシップ(ウエスタン大学)の支援を受けており、A.L.A.とV.B.はどちらもカナダ乳がん協会の支援を受けています。CLは、カナダ政府からのバニエカナダ大学院奨学金によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 7-アミノアクチノマイシンD(7AAD) | BD | 51-68981E | 提案:0.25 µg/1x106 |
| アセトン | フィッシャー | A18-1 | |
| アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)基質 | Stemcell Technologies | 1700 | ALDEFLOUR Assay kitの一部として市販されている。ALDH基質調製については、製造元の指示に従って |
| 基底膜抽出物(BME) | Corning | 354234 | 商品名Matrigel |
| で販売されています細胞培養プレート:6ウェル | コーニング | 877218 | |
| 細胞培養プレート:60mm | コーニング | 353002 | |
| 細胞培養プレート:96ウェル超低接着 | コーニング | 3474 | |
| セルストレーナー:40ミクロン | BD | 352340 | |
| コラーゲン | 幹細胞技術 | 7001 | PBS中の3mg/mLコラーゲンを1:30希釈液で調製 |
| コラゲナーゼ | Sigma 11088807001 | 1x | |
| コニカルチューブ:50 mL | Fisher scientific | 05-539-7 | |
| クリスタルバイオレット | Sigma | C6158 | ディ |
| スパーゼ | ステムセルテクノロジー | 7913 | 5U/mL |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x、L-グルタミンおよび15 mM HEPES付き |
| DNAse | Sigma | D5052 | 0.1 mg/mL 最終濃度 |
| FBS | Avantor Seradigm Lifescience | 97068-085 | |
| フローチューブ:5ml | BD | 352063 | ポリプロピレン丸底チューブ |
| メタ | ノールフィッシャー | 84124 | |
| マウス抗ヒト CD24 抗体 | BD 561646 | R-フィコエリトリンおよびシアニン色素 結合 クローン:ML5 | |
| マウス 抗ヒト CD44 抗体 | BD | 555479 | R-フィコエリトリン結合、クローン:G44-26 |
| N、N-ジエチルアミノベンズアルデヒド (DEAB) | Stemcell Technologies | 1700 | ALDEFLOUR Assay kitの一部として市販されています。製造元の指示に従ってください DEAB調製 |
| PBS | Wisent Inc | 311-425-CL | 1x, カルシウムおよびマグネシウムなし |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Mammosphere Media組成 | |||
| B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
| bFGF | Sigma | F2006 | 10 ng/mL |
| BSA | Bioshop | ALB003 | 04% |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x、L-グルタミンと 15 mM HEPES |
| EGF | シグマ | E9644 | 20 ng/mL |
| インスリン | シグマ | 16634 | 5 µg/mL |
| 3D オルガノイド培地 組成 | |||
| A8301 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x、L-グルタミンおよび 15 mM HEPES |
| EGF | シグマ | E9644 | 5 ng/mL |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | 1x |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 10 mM |
| N-アセチルシステイン | Sigma | A9165 | 1.25 mM |
| 神経反射 &β;1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| ニコチンアミド | Σ | N0636 | 5 mM |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| R-spondin3 | R&D | 3500 | 250 ng/mL |
| SB202190 | Sigma | S7067 | 500 nM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µメートル |
参考文献
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Shipitsin, M., et al.
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