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方法論記事

大腸癌幹細胞を研究するスフェロイドの3次元モデル

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DOI:

10.3791/61783

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2021年1月22日

 ,  ,  , 
1Département de la recherche, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR5286, Université de Lyon, Université Lyon 1, Centre Léon Bérard, 2UMR-S1113 - IRFAC INSERM, Université de Strasbourg

この記事について

サマリー

このプロトコルは、Caco2結腸腺癌細胞から3次元スフェロイドを生成し、増殖させる新規、堅牢、再現性培養システムを提示する。この結果は、化学療法への応答を含む癌幹細胞生物学を研究するためのこのアプローチの適切性に関する最初の概念実証を提供する。

要約

大腸癌は、異質性および腫瘍の発達、維持、および薬剤に対する耐性を担う癌幹細胞(CSC)の集団からなる階層的組織によって特徴付けられる。したがって、特定の標的化に対するCSC特性のより良い理解は、効果的な治療のための前提条件である。しかし、詳細な調査には適切な前臨床モデルの貧弱さがあります。in vitro 2次元(2D)癌細胞株は腫瘍生物学に関する貴重な洞察を提供するが、彼らは表現型および遺伝的腫瘍不均一性を複製しない。対照的に、3次元(3D)モデルは、ほぼ生理学的癌の複雑さと細胞の不均一性に対処し、再生する。この研究の目的は、CSC生物学を研究するための堅牢で再現性の高い3D培養システムを設計することであった。本手法は、Caco2結腸腺癌細胞から、サイズが均質な3Dスフェロイドを生成する条件の開発と最適化を説明する、長期培養に使用できるモデルである。重要なことに、スフェロイド内では、内腔様構造の周りに組織された細胞は、細胞増殖パターンの差動と、マーカーのパネルを発現するCSCの存在によって特徴づけられた。これらの結果は、化学療法に対する応答を含む細胞の異質性およびCSC生物学を研究するためのこの3Dアプローチの妥当性に関する最初の概念実証を提供する。

概要

大腸癌(CRC)は、世界における癌関連死の第2位の原因である。CRCの開発は、遺伝子変異および/またはエピジェネティックな変化の進行的な獲得および蓄積の結果である2、3、腫瘍抑制遺伝子の活性化および腫瘍抑制遺伝子3の不活性化を含む。さらに、非遺伝的要因(例えば、微小環境)は、発癌性転換に寄与し、そして促進し、したがってCRCs5の進化に関与することができる。重要なことに、CRCは、未分化CSCおよびバルク腫瘍細胞を含む異なる細胞集団で構成され、いくつかの分化形質を示し、これは正常な結腸暗号6,7における上皮の組織を連想させる階層構造を構成する。

CSCは腫瘍の外観8、その維持と成長、転移能力、および従来の治療法6、7に対する耐性を担うと考えられている。腫瘍内では、CSCを含む癌細胞は、その明確な突然変異およびエピジェネティックなプロファイル、形態学的および表現性の違い、遺伝子発現、代謝、増殖率、および転移電位の点で高レベルの不均一性および複雑さを示す9。したがって、がん生物学、腫瘍進行、および治療に対する耐性の獲得および有効な治療への翻訳をよりよく理解するために、この癌の異質性および階層を捉えるヒト前臨床モデルは重要である10,11である。

In vitro 2Dがん細胞株は、長い間使用されており、腫瘍の発達と治療分子の有効性の基礎となるメカニズムに関する貴重な洞察を提供してきました。しかし、元の腫瘍に見られる形質および遺伝的不均一性の欠如に関するそれらの限界は現在広く認識されている12。また、栄養素、酸素、pH勾配、及び腫瘍微小環境は再生されず、CSCs11,12を含む異なる細胞タイプの維持のために特に重要な微小環境である。これらの主な欠点を克服するために、いくつかの3Dモデルが実験的に対処し、癌の複雑さと不均一性を再現するために開発されました。事実上、これらのモデルは、腫瘍細胞異質性、細胞細胞相互作用、および空間的アーキテクチャを再現し、生体内12、13、14で観察されたものと同様である。新鮮な腫瘍から樹立された原発性腫瘍オルガノイドは、細胞系由来のスフェロイドと同様に、主に15,16個を採用している。

スフェロイドは、細胞を強制的に形成し、細胞凝集体で増殖させるために、足場を含まないまたは足場ベースの方法で培養することができる。足場を含まない方法は、非接着条件下での細胞の培養(例えば、吊り下げ法または超低添付プレート)に基づくが、足場ベースのモデルは、培養細胞12、13、14に天然、合成、またはハイブリッドバイオマテリアルに依存する。スキャフォールドベースのスフェロイドは、最終的なスフェロイド形成が使用される(バイオ)材料の性質および組成に依存するので、異なる欠点を提示する。これまで入手可能な足場を含まないスフェロイド法は基板の性質に依存しないが、それらは構造およびサイズ17、18で変化するスフェロイドを生成する。

この研究は、CSC生物学を研究するためにCaco2結腸腺癌細胞で構成される、サイズが均質であるスフェロイドの堅牢で再現可能な3D培養システムを設計することを目的としていた。Caco2細胞は、時間19,20の経過とともに分化する能力のために特に関心があり、ステムのような可能性を強く示唆している。従って、スフェロイドの長期培養は、化学療法に対する異なる応答を有する異なるCSC集団の存在を明らかにした。

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プロトコル

注: すべての試薬と材料の詳細は、 材料表に記載されています。

1. スフェロイド形成

  1. スフェロイド培養培地
    1. 4 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを添加したダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)からなる基底培地を調製する。
    2. ステップ1.1.1から基礎培地に10%のウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリンストレプトマイシン(ペン/ストレップ)を含むDMEM完全培地を調製する。













  3. figure-protocol-1


    2. &E





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結果

スフェロイドの大きさの均質性の欠如は、現在利用可能な3Dスフェロイド培養システム13の主な欠点の1つであるため、この研究の目的は、均質なスフェロイドを得るための信頼性と再現性の高いプロトコルを設定することであった。まず、理想的な作業条件を確立するために、Caco2細胞の異なる数を、専用プレートを用いてマイクロウェル/スフェロイド当たり50〜2,000細胞の範囲で試験した(表1)。事実上、これらのプレート内の各ウェルには1,200個のマイクロウェルが含まれ、ウェル当たり同数のスフェロイドの形成が可能であり、さらに重要なことに、マイクロウェル21当たり1個のスフェロイドの形成が可能となる。培養2日後、1回転楕円体当たり2,000個の細胞を含むウェルは単層として成長し、1回転楕円体当たり50個の細胞が小さく、非均質な回転楕円体を生み出した(図1A)。したがって、これら2つの条件は、さらなる分...

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ディスカッション

in vitro 3Dモデルは、2Dがん細胞培養の主な実験的欠点を克服し、微小環境や細胞の不均一性を含む典型的な腫瘍特徴をより再現する際に信頼性が高いように見えます。一般的に使用されるスフェロイドの3Dモデルは、足場を含まない(低い付着条件で培養)または足場ベース(培養細胞に生体材料を使用する)です。これらの方法は、使用される足場の性質に依存したり、構造やサイズが可変のスフェロイドを生じさせるため、異なる欠点を提示します。

本プロトコルは、結腸腺癌細胞株Caco2から、足場を含まない方法を用いて均質なスフェロイドを産生するための最適化条件を報告する。スフェロイドは、容易に収穫され、以前に報告された研究41に反して、彼らは正常に成長し、培養中のそれらの成長特性も分析することができる。さらに、この新しい方法により、スフェロイド(a)は活発に増殖し、(b)細胞死の非常に低い速度を提示し、(c)球内に内腔を形成するように編成し、そして(d)成分細胞の分化能力を示す。新しいアプローチの最終目的はCSC生物学の研究に用いられたことを考えると、CS...

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開示事項

著者は開示するものは何もない

謝辞

我々は、イメージングおよびアニパス・レケルシュ・ヒスオロジー・プラットフォーム(CRCL、CLB)を認める。私たちは、FOLFOXとFOLFIRIの種類の贈り物のためにセンターレオンベラード(CLB)病院の薬局にお世話になっています。また、ブリジット・マンシップが原稿を批判的に読んでくださったことに感謝します。この作業は、FRM(Equipes FRM 2018、DEQ20181039598)とインカ(PLBIO19-289)によってサポートされました。MVGとLCは、FRMとCFから支援を受け、ARC財団とセンター・レオン・ベラードから支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
37 & マイクロ;m リバーシブルストレーナー、ラージ STEMCELL Technologies2725050 mL コニカルチューブ
5-フルオロウラシルGift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)-ストック溶液、5 mg/100 mL; 最終濃度、50 & マイクロ;g/mL
アガロース SigmaA9539
Aggrewell 400 24-well platesSTEMCELL Technologies344111,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 - RabbitCell Signaling9661dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - RateBioscience/Thermo Fisher14-9896-82希釈率 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mLSTEMCELL Technologies07010
Anti-CD133 (13A4) - ラットInvitrogen14-133-82希釈 1:100
Anti-CD44 -RabbitAbcamab157107希釈 1:2000
Anti-PCNA - MouseDakoM0879希釈 1:1000
Anti-β-catenin - MouseSanta Cruz Biotechnologysc-7963希釈 1:50
黒マルチウェルプレートサーモフィッシャーサイエンティフィック237108
クエン酸一水和物SigmaC1909
CLARIOstar装置 BMG Labtechマイクロプレートリーダー
Dako ペン液体のバリアを作成するためのスライド上の円をマークするマーカーペン
Donkey 抗マウス IgG (H+L) 二次抗体、Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21202希釈率 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) 二次抗体、Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10037希釈率 1:1000
ロバ抗ウサギIgG(H + L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA212061:1000
ロバ抗ウサギIgG(H + L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA100421:1000
ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)グルタマックス(L-アラニル-L-グルタミンジペプチド)Gibco10569010
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco16000044
Fluorogel Mounting Medium with DAPIInterchimFP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11077dilution 1:1000
ImageJ softwareSpheroid image analysis
Irinotecan Gift from Pharmacy CLBストック溶液、20 mg/mL、最終濃度、100 & micro;g/mL
iScript 逆転写酵素 Bio-Rad1708891
LeucovorinGift from Pharmacy CLBストック溶液、50 mg/mL、最終濃度、25 & micro;g/mL
マトリゲル基底膜マトリックスコーニング354234基底膜マトリックス
ヌクレオスピン RNA XS キットMacherey-Nagel740902 .250
オキサリプラチンGift from Pharmacy CLBストック溶液、100 mg/20 mL;最終濃度、10 & micro;g/mL
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140130
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Gibco14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420B
SYTOX- GreenThermo Fisher ScientificS7020nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %)Gibco
Zeiss-Axiovert顕微鏡スフェロイドの画像を取得するための倒立顕微鏡
希釈希釈25300062

参考文献

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