質量光測定による抗体-抗原アフィニティーの迅速な測定

サマリー

質量光計測(MP)を用いた抗原抗体親和性測定に対する単一分子アプローチについて述べています。MPベースのプロトコルは、高速で正確で、非常に少量の材料を使用し、タンパク質の改変を必要としません。

要約

抗原と抗体相互作用の特異性と親和性の測定は、医学および研究用途にとって極めて重要です。このプロトコルでは、この目的のために新しい単一分子技術、質量光測定(MP)の実装について説明する。MPは、抗体および抗原抗体複合体の分子質量および集団を単一分子レベルで検出し、定量化する、標識および固定化を含まない技術です。MPは数分以内に抗原抗体サンプルを分析し、結合親和性の正確な決定を可能にし、同時にタンパク質のストイキオメトリーとオリゴマー状態に関する情報を提供します。これは、タンパク質のピコモール量と高価な消耗品を必要としないシンプルで簡単な技術です。同じ手順を使用して、50 kDaを超える分子量を持つタンパク質に対するタンパク質結合を研究することができます。多価タンパク質相互作用の場合、複数の結合部位の親和性を単一の測定で得ることができる。しかし、測定の単一分子モードと標識の欠如は、いくつかの実験的な制限を課します。この方法は、サブマイクロモル相互作用親和性、20kDa以上の分子質量を持つ抗原、および比較的純粋なタンパク質サンプルの測定に適用すると最良の結果を与えます。また、基本的なデータ解析ソフトを用いて、必要なフィッティング・計算手順を実行する手順についても説明します。

概要

抗体は分子生物学のユビキタスツールとなり、医学と研究の両方の用途で広く使用されています。医学では、診断において非常に重要であるが、治療用途も拡大しており、新しい抗体ベースの治療法は常に^{1、2、3、4}を開発されている。抗体の科学的応用には、免疫蛍光^5、免疫沈降^6、フローサイトメトリー7、ELISA、およびウェスタンブロッティングなどの多くの不可欠な実験室技術が含まれる。これらのアプリケーションのそれぞれについて、結合親和性や特異性を含む抗体の結合特性の正確な測定を得ることは非常に重要です。

1990年に初の市販表面プラズモン共鳴(SPR)装置が導入されて以来、光学バイオセンサーは抗体特性の「ゴールドスタンダード」となっているが、ELISAを含む他の技術も抗体親和性^8,9を測定するために日常的に使用されている。これらの方法は、通常、分析された分子の固定化または標識を必要....

プロトコル

1. 流れチャンバを準備する

1. ガラスカバーリップをクリーニングする
   1. 蒸留水、エタノール、イソプロパノールを含む洗浄ボトルを使用して、水、エタノール、水、イソプロパノール、水の順序で24 mm x 50 mmのカバーリップを洗い流します。きれいな窒素の流れでカバースリップを乾燥させます。下の角を柔らかい先端の鉗子で押さえて、カバーリップを上から下にすすい込むのが重要です。カバースリップを同じ方向に乾かして、鉗子からの汚染を移動させないようにします(図2A)。
   2. 同様に、24 mm x 24 mm のカバーリップを蒸留水、エタノール、蒸留水でリンスします。きれいな窒素の流れでカバースリップを乾燥させます。
   3. カバースリップの作業側を特定し、きれいなカバースリップの表面に蒸留水を一滴置き、プロトコルのステップ3.1-3.2に従います。通常、24 mm x 50 mm カバースリップの片側にのみ、MP 測定に適した光学品質があります。
      注: フォーカス後、重大な表面の欠陥を検出でき、データ収集ソフトウェアに示されている「シグナル」値は 0.05% 未満である必要があります (図 1A-C)。ボックス内のすべてのカバーリップの作業面は、同じ方向に向いています。カバースリップクリーニングの効率をテストするために....

結果

我々は、MPベースアッセイ¹¹を用いてヒトα-トロンビン(HT)とマウスモノクローナル抗ヒトトロンビン抗体(AHT)の相互作用を以前に調べた。HTの分子質量(37kDa)は40kDa検出限界以下であるため、最大サンプル濃度は、質量分布の分解能に悪影響を及ぼすことなく、50nMの濃度制限を超えることができます。実験は、AHT抗体を固定25nM濃度で、HT濃度は7.5nM、15nM、30nM、60nM、120nMの滴定シリーズとして計画した。図3は、抗原抗体混合物および抗体のみのサンプルの分子質量分布を示す。ここでは、プロトコルで説明した方法を使用してデータを分析します。科学的なグラフ作成ソフトウェアは、自由なAHT、AHTを表す3つのガウス成分で質量分布を適合させるために使用されました。HT と AHT·HT₂.3つの成分の既知の分子質量値を固定し、3種に対して単一のピーク幅パラメータを取り付けた。ガウス成分の最適なピーク高さパラメータを、種濃度画分を得るためにEq. 3を用いて正規化した(表1.......

ディスカッション

ここで概説するマスフォトメトリーベースのプロトコルは、抗原抗体結合親和性を迅速かつ正確に測定する方法を提供します。MP分析では、非常に少量の材料を使用し、同じデータから、ストイチオメトリー、オリゴマー化、純度などの追加情報を評価できます(図5)。改質なしの場合、この方法は約5nM~500nMの範囲での解離定数の測定、および約20kDa以上の分子質量を有するリガンド分子に適用可能である。同じプロトコルは、抗原抗体結合を分析するだけでなく、結合パートナーの少なくとも1つの分子質量が50kDaより大きい場合にタンパク質とタンパク質の相互作用親和性を測定するためにも使用することができる。MP検出は非特異的であるため、高濃度のキャリアタンパク質または大きな分子質量不純物を含むサンプルに対してMP測定を行うことはできません。

SPRは、抗原抗体結合の特徴付けに一般的に使用され、両方の方法の直接比較は、アッセイの選択に役立つ可能性があります。SPRと比較して、MP結合アッセイはより速く、タンパク質固定化を必要としない。典型的な結合実験の.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AcquireMP	Refeyn		MPデータ収集ソフトウェア
反ヒトトロンビン	血液学技術	AHT-5020	RRID: AB_2864302
綿先端アプリケーター	Thorlabs	CTA10	レンズクリーニング用綿棒
カバースリップ 24x24 mm	グローブサイエンティフィック	1405-10
カバースリップ 24x50 mm	フィッシャーScientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP データ処理ソフトウェア
鉗子	電子顕微鏡 Sciences	78080-CF	カバースリップ用軟鉗子
人間 &α;-トロンビン	血液学技術	HCT-0020
液浸油	Thorlabs	MOIL-30
イソプロパノール	アルファ Aesar	36644
Microsoft Excel	マイクロソフト		スプレッドシート
OneMP	Refeyn		質量測光装置
Origin	OriginLab		科学グラフソフトウェア
PBS	Corning	46-013-CM	10x ストック
シリンジフィルター	ミリポア		SLGSR33SS バッファーとサンプルフィルタリング