植物由来製品の抗真菌効果を定量化するために設計された修飾寒天ベースの方法について述べています。このプロトコルを通じて、抗真菌活性に対する揮発性および不揮発性の寄与の両方を評価することができる。さらに、真菌に対する有効性は、単一の実験セットアップの主要な発達段階で測定することができる。
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この記事について
サマリー
要約
記載されたプロトコルは、微生物の量とその発生段階を正確に決定できるプラグ転送技術に基づいています。指定された数の胞子が寒天プレートに広がる。この寒天プレートは、培養が必要ない胞子を除いて、真菌が期待される発達段階に到達できるように、定義された期間インキュベートされる。胞子、ヒファ、または菌糸体で覆われた寒天プラグは、次に取り出され、試験対象の抗真菌化合物を含む寒天培地に移管され、真菌から離れた場所または接触した状態で配置されます。この方法は、液体抽出物と固体サンプル(粉末)の両方を試験するのに適用可能です。特に、生理活性混合物中の揮発性物質と不揮発性物質の相対的な寄与を定量化し、特に胞子、初期のヒファ、および菌糸体に対するその効果を決定するために適しています。
この方法は、バイオコントロール製品、特に植物由来製品の抗真菌活性の特性評価に非常に関連しています。実際に、植物の処理のために、結果は、アプリケーションのモードの選択を導き、トリガーのしきい値を確立するために使用することができます。
概要
果物や野菜の世界的な損失は、生産1の最大50%に達することができ、20世紀半ばから合成殺菌剤の広範な雇用にもかかわらず、主に畑や収穫後の貯蔵中に生じた食の腐敗から生じる2、3。これらの物質の使用は、深刻な環境および健康上の危険を表すため、再考されています。その使用の有害な結果が生態系全体に現れ、潜在的な健康への影響の証拠が5、6を蓄積したので、収穫前および収穫後の治療7、8、9のための古い予防戦略に代わる新しい選択肢が開発されている。したがって、私たちが直面する課題は2倍です。新しい殺菌戦略は、まず、植物病原体に対する食物保護の有効性のレベルを維持し、それに付随して、農業慣行の環境フットプリントを劇的に削減することに貢献しなければならない。この野心的な目標を達成するために、植物で進化した自然防御に触発された戦略は、その抗菌特性8のために1000種以上の植物種が強調されている....
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プロトコル
1. インノクラ製剤
- 実験の前に、 トリコデルマspp の5μLを置く。SBT10-2018胞子は、4°Cで保存されたジャガイモデキストロース寒天培地(PDA)で、コニディア形成42 を促進するために定期的な光暴露で30°Cで4日間インキュベートする(図1、パネルA)。
注: トリコデルマspp.SBT10-2018は木材から隔離されており、急速な成長と胞子回収の容易さのためにこの研究のモデルとして使用されています。この株は、我々の研究室によって保存されています。 - コニディアの回復 (図 1、パネル A)
- トリコデルマ菌糸体に0.05%トゥイーン-20の3 mLを置きます。
- 熊手を使用してコニジオフォアからコニディアを放出する。ヒファエが引き裂かれるのを防ぐために、菌糸体を押し下げないようにしてください。
- 溶液をマイクロピペットで迅速に回収し、寒天培地に吸収され、15 mLチューブに移さないようにします。
- ヘモサイトメーターを使用して胞子の総数を数え、3 x 106 の胞子/mLを含む溶液を準備する。
注: このステップは、ヒファエが抽出されるのを防ぐために慎....
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結果
異なるタイプの抗真菌化合物の作用様式を判別する定量的方法の能力を評価するために、3つの有名な抗真菌剤の有効性を比較した。カルベンダジンは、植物39、40の真菌疾患の広い範囲を制御するために広く使用されている不揮発性の合成殺菌剤である。胸腺下品精油は、主にその抗菌および抗真菌活性について記載されており、天然食品保存剤41として使用されている。ニンニクパウダーは植物由来のバイオ製品のモデルとして選ばれました。これは、揮発性有機硫黄化合物の存在に大きく起因する抗菌活性を有する自然療法として伝統的に使用されてきたが、また、不揮発性サポニンおよびフェノール化合物26の存在に起因し、このモデルに関連する複雑さを与える。
この定量的方法は、異なる発育段階で菌類の制御された量を含む寒天栓の移動に依存して、胞子から菌糸体へ異なる発生段階では、食品毒法では、5日間から7日間.......
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ディスカッション
ここで提示されるアプローチは、最小限に処理された植物由来の製品の抗真菌特性の評価を可能にする。このプロトコルでは、寒天表面上の胞子の均質な分布は、2mmガラスビーズを使用して達成される。このステップでは、ビーズを適切に配布し、再現性のある結果を得るためのハンドリングスキルが必要であり、最終的には真菌の成長の異なる段階で抗真菌効果の比較を可能にします。5mmのガラスビーズや、広がりの間に均質化しながら過度の回転が可変の成長直径を引き起こす可能性があることがわかりました。そのため、実験前に胞毛分布を習得するためのトレーニングをお勧めします。さらに、植物粉末を試験する必要がある場合は、寒天培地への製品の均質な分散に注意を払う必要があります。プレートの底部に粉が落ち着かないようにするために、溶融した媒体の温度が45°Cに達したときに(室温が24°Cの場合)寒天培地に混合する必要があります。この温度は、沈み込みを避けるために、局所室温に応じて調整する必要があります。
ここで説明する方法は貴重な洞察を提供できますが、いくつかの欠点を考慮する必要があります。この方法は、調製すべき寒天プレートの数.......
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謝辞
フランク・イェーツの貴重なアドバイスにとても感謝しています。この作品はSup'Biotechによって支えられていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| オートクレーブ-バキュクラフ 24B+ | メラグ | ||
| カルベンダジム | Σ | 378674-100G | |
| 蒸留水 | |||
| エッペンドルフ チューブ | ザルスタット | 72.706 | 1.5 mL |
| ファルコン チューブ | サルスタット | 547254 | 50 mL |
| 直径 5 ミリメートル ステンレス鋼管 | 小売店 | / | |
| 食品脱水機 | サンクスト | 6 トレイ | |
| ガーリック パウダー | オーガニックショップ | ||
| ガラスビーズ | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 >C |
| ナイフミル | ボッシュ | TSM6A013B | |
| 手動セルカウンター | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | 小売店 | ||
| 微生物学的安全キャビネット | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| マイクロピペット | メトラー・トレド | 17014407 | 100 - 1000 µL |
| マイクロピペット | メトラー・トレド | 17014411 | 20 - 200 µL |
| マイクロピペット | メトラー・トレド | 17014412 | 2 - 20 & マイクロ;L |
| シャー | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| シャー | ルシュテット | 82-1473 | 90 mm |
| ピペットコントローラー-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| ポテトデキストロース寒天 | シグマ | 70139-500G | |
| 精密スケール-RADWAG | グロッセロン | B126698 | AS220。R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| 逆顕微鏡 AE31E 三眼グロ | ッセロン | M097917 | / |
| 滅菌目盛り付きピペット | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| 胸腺エッセンシャルオイル | ドラッグストア | エッセンシャルオイル 100% | |
| Tips 1000 & micro;L | Sarstedt | 70.762010 | |
| ヒント20 µL | ザルスタット | 70.760012 | |
| ヒント200&マイクロ;L | Sarstedt | 70.760002 | |
| つまようじ | 小売店 | ||
| Trichoderma spp株 | LRPIA実験室 | ||
| Tween-20の株 | シグマ | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Σ | P1754-1L | |
| ピンセット | ラボボックス | FORS-001-002 | / |
参考文献
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. Intern....
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