この技術は、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒およびタンパク質体の観察と分析のための全種サイズの樹脂セクションの迅速かつ簡単な調製を可能にする。
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方法論記事
全種サイズ樹脂断面の簡易ドライ断面化方法とその応用
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
種子中の細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態、大きさ、量は、種子の重量と品質を決定します。彼らは種子の異なる領域間で有意に異なっています。細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態を明確に表示し、それらの形態パラメータを正確に定量的に分析するためには、全種サイズのセクションが必要です。全体の種子サイズのパラフィンセクションは、種子中の貯蔵材料の蓄積を調査することができますが、厚いセクションの低解像度のために細胞や貯蔵材料の形態パラメータを定量的に分析することは非常に困難です。薄い樹脂部は高解像度を有するが、日常的な樹脂切断法は、大きな容積および高デンプン含量の成熟した種子の全種サイズのセクションを調製するのに適していない。本研究では、全種サイズの樹脂部を作製するための簡単なドライ切片方法を紹介する。この技術は、高デンプン含有量を有する大きな種子であっても、LRホワイト樹脂に埋め込まれたクロスおよび縦方向の全種サイズのセクションを調製することができます。全種サイズのセクションは、蛍光増白剤28、ヨウ素、およびクーマシーブリリアントブルーR250で染色することができ、細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の形態をそれぞれ明確に示す。得られた画像を定量的に分析して、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の形態パラメータを示すこともできます。
概要
植物の種子は、デンプンやタンパク質などの貯蔵材料を含み、人々にエネルギーと栄養を提供します。セルと保管材料の形状、サイズ、および量によって、シードの重量と品質が決まります。種子の異なる領域の細胞および貯蔵材料は、特にデンプン分岐酵素IIb1、2、3の阻害を伴ういくつかの高アミロース穀物作物について、著しく異なる形態を有する。したがって、種子の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態を調べることは非常に重要である。
パラフィン切片は、種サイズのセクション全体を調製する良い方法であり、種子の組織構造と種子4、5、6の異なる領域における貯蔵材料の蓄積を示すことができる。しかし、パラフィンセクションは通常、低解像度で6〜8μmの厚さを有する。したがって、細胞や貯蔵材料の形態を明確に観察し、定量的に分析することは非常に困難です。樹脂のセクションは、通常、1〜2 μmの厚さと高分解能を有し、細胞および貯蔵材料7の形態を観察し、分析するのに非常に適している。しかし、日常的な樹脂切断法は、特に大量の澱粉含有量の高い種子に対して、シードサイズのセクション全体を準備するのが難しい。したがって、種子の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態を観察し、分析する方法はありません。LRホワイト樹脂はアクリル樹脂であり、低粘度と強い透過性を示し、種子の樹脂部分、特に大量および高デンプン含有量の穀物成熟したカーネルの準備に優れた用途につながります。また、LRホワイト樹脂に埋め込まれた試料は、多くの化学染料で容易に染色でき、光顕微鏡または蛍光顕微鏡7の下で細胞や貯蔵材料の形態を明瞭に示すことができる。前回の論文では、LRホワイト樹脂に埋め込まれた成熟したシリアルカーネルの全種サイズのセクションを調製するためのドライセパリング方法を報告しました。この方法はまた、開発、発芽および調理された穀物カーネル8の全種サイズのセクションを準備することができます。得られた全種サイズのセクションは、特に種子8,9の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態差を明確に観察し定量的に分析するための、微量形態の観察および分析において多くの用途を有する。
この技術は、組織の微細構造と細胞の形状と大きさ、デンプン顆粒、および異なる種子領域のタンパク質体を光学顕微鏡を用いて観察したい研究者に適しています。細胞、デンプン顆粒、タンパク質体を示すために特別に染色された全種サイズのセクションの画像を形態解析ソフトウェアで解析し、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態パラメータを定量的に測定することができます。技術的な適用性と全種サイズのセクションアプリケーションを実証するために、我々は、トウモロコシと油糧種子菜種の成熟した種子と、この研究で米の開発、発芽、調理されたカーネルを調査しました。プロトコルには 4 つのプロセスが含まれています。ここでは、大量の澱粉含有量が多いためにシードサイズのセクション全体を準備する際に最も困難な成熟したトウモロコシカーネルを、工程を段階的に示すサンプルとして使用します。
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プロトコル
1. 樹脂埋め込み種子の調製(図1)
- トウモロコシ成熟したカーネルを10 mLの2.5%リン酸緩衝グルタルアルデヒド(0.1 M,pH7.2)で4°Cで48時間固定します。研究者は、研究目的と組織タイプに応じて、他の固定混合物、固定濃度、および固定条件を選択することができます。
- カーネルを取り出し、鋭利な両面ブレードを使用して2〜3mmの厚さに縦方向または経線状にスライスし、2.5%リン酸緩衝グルタルアルデヒド(0.1 M、pH 7.2)の10 mLに再び48時間固定します。
- 0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.2)の10 mLを毎回30分間洗浄します。
- エタノール水溶液(10mL)のグレードを30%から50%、70%、90%1回、30分間100%3回脱水します。
- エタノールで希釈したLRホワイト樹脂溶液の10mLのグレードを25%から50%、75%1回、4°Cで12時間12時間100%ずつサンプルに浸潤します。
- 埋め込む前に、サンプルの台座を準備します。2mL遠心分離機チューブに100%LRホワイト樹脂の0.25mLを加え、60°Cで48時間重合します。
- 純LRホワイト樹脂(0.5mL)と浸潤サンプルをペデスタ管付き遠心管に連続して加えます。解剖学的針でサンプルをまっすぐにし、オーブンで60°Cで48時間重合します。
2. 全種サイズのセクションを準備するためのドライセッティング (図1)
- 遠心管から組み込みカーネルを取り出し、鋭利な刃を使ってサンプルの周りに余分な樹脂を切り取ります。
- ウルトラミクロトーム(EM UC7)のサンプルホルダーに樹脂ブロックをクランプし、サンプル表面やサンプルの周囲の余分な樹脂をブレードで切り落とします。
- 完全な部分が形成されるまでガラスナイフでサンプルの表面を細かく研磨します。
- 切断する前に刃の端の上に約2mmの小さな銅フックを入れ、サンプルを2μmのセクションに切ります。フックの役割は、セクションの上向きのカーリングを避けることです。
- セクションが長くなったら、それをサポートするために、セクションの下にフックを置きます。
- 未処理のスライドに100μLの水を加え、ピンセットで完全な切れ目のない部分を水に慎重に移します。
- しわの部分を滑らかにするために、一晩で50°Cで平らなテーブルの上にサンプルを加熱し、乾燥させる。
- セクションが崩れたり涙を流したりする場合は、サンプルの各樹脂浸潤時間を12時間から24時間または48時間に延長します。
- セクションにナイフに平行な線がある場合は、サンプルブロックをしっかりとクランプします。セクションがナイフに垂直のいくつかの線を持っている場合は、新しいナイフを使用してください。
3. セクションの染色と観察
注:細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の組織構造と形態を観察するために、研究の目的に応じて特定の汚れでセクションを染色します。ここでは、蛍光増輝体28、ヨウ素溶液、およびクマシーブリリアントブルーR250をそれぞれ用いて、細胞壁、デンプン顆粒、およびタンパク質体を染色する。
- 細胞の形態を観察するために、40mLの0.1%(w/v)蛍光増輝体28水溶液を40mLコンパクトガラス染色瓶に10分間45°Cで染色し、5分間流水でリンスします。CCDカメラを搭載した蛍光顕微鏡で、断面を観察・撮影します。
- デンプン顆粒の形態を観察するために、40 μLのヨウ素溶液(0.07%(w/v)I2 および0.14%(w/v)KIを25%(v/v)グリセロールで1分間染色し、ヨウ素溶液を含むサンプルをカバースリップで覆います。CCDカメラを搭載した光学顕微鏡でサンプルを見て撮影します。
- タンパク質体の形態を観察するために、 45°Cで10分間、70mLコンパクトガラス染色瓶に10%(v/v)酢酸の40 mLでセクションを浸し、1%(w/v)クマシーブリリアントブルーR250で25%(v/v)イソプロパノールと10%(v/v)酢酸15°Cで15%の酢酸を40mLに染色します。 汚れた部分を流水で5分間洗い、乾かします。CCDカメラを搭載した軽顕微鏡で、断面を観察・撮影します。
4. 形態パラメータの定量的分析
- Zhaoらの手順に従って、異なる種子領域の細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の面積、長/短軸、および丸みについて、撮影した画像を正確に解析し定量的に分析する。
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結果
全種サイズの断面を得るための簡単なドライ断面法
LR-白色樹脂に埋め込まれた種全体サイズの部分を調製するための簡単なドライ切片方法を確立します(図1)。この方法は、2 μmの厚さの横断および縦方向の全種サイズのセクションを調製することができる(図2-5、補足図1-4)。例えば、油糧種子の成熟種子は、縦および縦方向に横断することができる(図2)。穀物作物の場合、成熟したカーネルはデンプン顆粒でいっぱいで、種全体の大きさのセクションを準備することは非常に困難です。本技術を用いて、大きなボリュームを持つ成熟したトウモロコシの横断的および縦方向の全種サイズのセクションも準備することができた(図4、補足図1)。また、開発中のカーネル(
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ディスカッション
種子は、食品、飼料、工業原料のための最も重要な再生可能資源であり、デンプンやタンパク質などの貯蔵材料が豊富です。細胞の形態と量、および貯蔵材料の内容と構成は、種子7、12の重量と品質に影響を与えます。ステテロロジーと画像解析技術は、組織領域内の細胞のサイズと量を測定することができますが、多くの研究室に欠けています。パラフィンと樹脂のセクションは、2次元(2D)画像を与え、細胞の真のサイズと量を分析する方法はありません。しかし、細胞は任意の平面でランダムに切断され、組織領域の少なくとも3つの異なるセクションから多くの細胞(100以上)の平均サイズは、細胞の2D形態パラメータ(長さ、幅、面積)を反映することができ、細胞領域を平均する領域領域の比率は、細胞の量を反映することができます。したがって、種子の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態を、その場で見て分析することは非常に重要である。パラフィンセクションは、特に大型種子7のために、全体の種子サイズのセクションを準備するのに...
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
中国国立自然科学財団(32071927)、揚州大学の人材プロジェクト、江蘇高等教育機関の優先アカデミックプログラム開発によって資金提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 酢酸 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| コンパクトガラス染色瓶(5人掛け) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Coomassie ブリリアントブルー R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (カバースリップ サンゴン バイオテック (上海) 有限公司) | ||
| 両面刃 | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| エタノールアブソリュート | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| フラット化テーブル | ライカ | HI1220 | |
| 蛍光顕微鏡 | オリンパス | BX60 | |
| 蛍光増白剤 28 | シグマ・アルドリッチ | 910090 | |
| ガラスストリップ | ライカ | 840031 | |
| グルタルアルデヒド 50% 水溶液 | サンゴン バイオテック (上海) Co., Ltd. | ||
| A600875 Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (グリセロール サンゴン バイオテック (上海) 有限公司) | ||
| ヨウ素 | サンゴンバイオテック(上海)有限公司 | ||
| イソプロパノール | ・サンゴン・バイオテック(上海)有限公司 | ||
| 光学顕微鏡 | オリンパス | BX53 | |
| LR 白色樹脂 | 寒天 科学 | AGR1281A | |
| オーブン | 上海 静洪 実験器具 Co.,Ltd. | 9023A | |
| ヨウ化カリウム | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| スライド | 三権生物科技(上海)有限公司 | ||
| F518101ピンセット | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| リン酸ナトリウム二塩基性十二水和物 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| リン酸ナトリウム一塩基性二水和物 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ウルトラミクロトーム | ライカ | EM UC7 |
参考文献
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