生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

Summary

本稿は、生細胞の原形質膜における分子拡散を測定するためのスポット変異蛍光相関分光法(svFCS)顕微鏡を構築する方法に関するプロトコルを提示することを目的としている。

Abstract

原形質膜組織に関連するものを含む生細胞における動的な生物学的プロセスは、それぞれナノメートルからマイクロメートルおよびマイクロ秒から分の範囲の様々な空間的および時間的スケールで起こる。このような広範囲の生物学的プロセスは、従来の顕微鏡検査アプローチに挑戦する。ここでは、カスタマイズされた古典的な蛍光顕微鏡を使用してスポット変動蛍光相関分光法(svFCS)測定を実施する手順を詳述します。このプロトコルには、svFCSセットアップの特定の性能チェックと、生理学的条件下での生細胞の原形質膜上のsvFCSによる分子拡散測定のガイドラインが含まれています。さらに、コレステロールオキシダーゼ処理によって原形質膜ラフトナノドメインを破壊する手順を提供し、原形質膜の側方組織におけるこれらの変化がsvFCS分析によってどのように明らかにされるかを実証します。結論として、この蛍光ベースの方法は、適切な空間的および時間的分解能を有する原形質膜の側方組織に関する前例のない詳細を提供することができる。

Introduction

原形質膜組織の複雑さ
細胞膜組織化の現在の理解は、いくつかの態様¹を考慮に入れなければならない。第一に、複合脂質組成は、細胞タイプ間だけでなく、単一の細胞(膜小器官/原形質膜)内でも変化する。その上、関連するまたは内因性の膜タンパク質は、ほとんどが動的多量体複合体で組織化され、大きなドメインが膜の外側に伸びており、膜貫通ドメイン単独の領域よりも有意に広い領域を占める。さらに、膜関連タンパク質は、タンパク質機能を調節する役割を果たす特異的な脂質結合または脂質相互作用能力を示す。これらは、脂質²の局所組成およびアクセシビリティに直接依存する。

最後に、膜タンパク質の固有の不斉構造および脂質の分布のために、2つの膜小葉の間にかなりのレベルの非対称性が観察される。実際、合成と加水分解の間の脂質代謝バランスは、小葉間の脂質フリップフロップと組み合わされて、そのような不斉分布を生成する。二重層を横切る任意の輸送は、極性頭部群を膜の疎水性内部を通って移動させるのに必要な自由エネルギーによって制約されるので、通常は選択的トランスポーターによって支援される。細胞型ごとに、非対称性はしっかりと維持される傾向がある。全体として、これらの因子は、原形質膜の横方向の不均一性または区画化に寄与する^3,4。

我々は、10分の1から数百ナノメートルおよびマイクロ秒から秒のスケールで動的横方向の不均一性に寄与する二重層内および二重層全体にわたる固有の分子拡散を考慮に入れることによって、原形質膜のこの表現を豊かにする。例えば、脂質依存性膜ナノドメイン(コレステロールとして定義されるいわゆる脂質いかだ、およびスフィンゴ脂質に富むシグナル伝達プラットフォーム)は、原形質膜の区画化に寄与する^5,6。しかしながら、膜組織の現在の見解は、脂質ラフトのみに限定されない。膜ナノドメインは、組成、起源、および機能においてより複雑で不均一である。それでも、原形質膜におけるそれらの存在は緊密に配位されなければならず、タンパク質と脂質との間の動的相互作用は、膜ナノドメイン^の空間分布および化学修飾において重要であるようである^1,3,7,8。

svFCSの原理と原形質膜の組織をプローブするためのその応用
膜ドメインの解析は、主に生物物理学的手法によって多くの進歩を遂げているが、原形質膜の局所組織を決定する決定要因は、適切な空間的および時間的分解能で洗練される必要がある。個々の分子の追跡に基づく決定要因は、優れた空間精度を提供し、異なる運動モード^9,10,11,12の特性評価を可能にするが、古典的な低いカメラフレームレートでは時間分解能が限られており、かなりの数の軌道を記録するためにより多くの実験的努力を必要とする。あるいは、膜成分の拡散係数は、フォトブリーチング後の蛍光回収(FRAP)¹³または蛍光相関分光法(FCS)¹⁴によって評価することができる。後者は、主にその高感度および選択性、顕微鏡的検出体積、低侵襲性、および広いダイナミックレンジのために、より注目を集めている¹⁵。

FCSの概念的基礎は、約50年前にMagdeと同僚によって導入されました^16,17.これは、蛍光発光のゆらぎを高い時間分解能(μsからsまで)で記録することに基づいています¹⁸。その現代版では、生細胞における測定は、関心領域内(例えば、原形質膜)内に位置する小さな共焦点励起体積(〜0.3フェムトリットル)によって行われる。観察体積に出入りする蛍光分子の拡散によって発生する蛍光シグナルは、非常に高い時間分解能(すなわち、検出器上の各光子の到達時間)で収集される。次に、信号を計算して自己相関関数(ACF)を生成し、そこから分子が焦点体積内にとどまる平均時間_td(拡散時間)が抽出され、観察体積中に存在する平均粒子数(N)とともに、ACFの振幅に反比例する。この最後のパラメータは、観察体積内の分子濃度に関する有用な情報である可能性があります。

それ以来、バイオフォトニクスの機器が急速に発展し、生命系で起こる動的現象の記述を可能にするため、ますます多くのFCSモダリティが実装されています。それでも、分子種は拡散係数値のより重なり合う分布を経験するであろうが、これは通常、分子が時間¹⁹において非線形の関係で拡散する異常な拡散特性によって反映され、この異常な部分拡散の生物学的意味を特定することは困難である。過去には、この困難は、FRAPによる分子拡散を1つの領域からではなく、さまざまなサイズの領域から記録し、それによって追加の空間情報を提供することによっていくらか克服されてきました。これにより、例えば、膜マイクロドメイン20、^21、22の概念化が可能^となった。

この戦略のFCS測定への変換(すなわち、いわゆるスポット変動蛍光相関分光法(svFCS))は、観察の焦点体積のサイズを変化させることによって確立され、蛍光の変動を異なる空間スケールで記録することを可能にする²³。したがって、svFCSアプローチは、研究された分子の分子拡散モードおよび膜分配のタイプ(単離されたドメイン対連続ドメイン²⁴)の同定および決定を可能にする間接的な空間情報を提供する。この場合^23,25の検出ビーム半径サイズに対応するウエスト(ω)値によって定義される様々な空間スケールの関数として拡散時間_tdをプロットすることによって、所与の生理学的条件における所与の分子の拡散法則を特徴付けることができる。したがって、svFCSは、時間領域²⁶における単一粒子追跡への完全な類似体である。ブラウン拡散制約の下では、拡散時間_tdとウエストωとの間に厳密に線形の関係が期待されるべきである(図1)^23,25。このスキームからの拡散法則の逸脱の起源は、細胞骨格メッシュワーク、分子クラウディング、ナノドメインにおける動的分割、またはこれらと他の効果の任意の組み合わせ(図1)などの非排他的な理由に起因する可能性があり、実験的にテストする必要があります²⁵。

ここでは、ゼロから構築されたカスタムメイドのsvFCS光学系を日常的に使用するために必要なすべての制御チェックポイントを提供し、その実験的アプローチに関する以前のプロトコル^{レビュー27,28}を補完します。また、概念実証として、脂質ラフトナノドメインに局在することが知られている原形質膜グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質であるThy1-GFPのsvFCS拡散法則(DL)の確立のためのセットアップの較正、細胞の準備、データ取得、および解析に関するガイドラインを提供します²⁹。最後に、コレステロールオキシダーゼ処理による脂質ラフトナノドメインの部分的な不安定化がThy1-GFPの拡散特性にどのように影響するかを実証する。さらに、svFCS セットアップをゼロから構築する方法の詳細については、補足資料を参照してください。

Protocol

1. カスタムメイドのsvFCSセットアップを組み立てるための設定仕様

注:提案されたsvFCSセットアップのシンプルさにより、光子回復の効率を確保しながら、低コストで簡単な設置、操作、およびメンテナンスが可能になります。詳細については、「 補足資料」を参照してください。

1. 実験室と安全性
   1. 約21°Cで安定した部屋にシステムを設置します。
   2. パッシブ(またはアクティブ)光学テーブル上の直接の気流を避け、光学アライメントのレーザー安全規則に従ってください。
2. ハードウェアとソフトウェア
   メモ: 補足資料 では、図 2 に示すインストール手順 の詳細を参照してください。
   1. LabVIEWでは、多機能集録ボードがほとんどのコントローラを駆動するステートマシンとイベントストラクチャーアーキテクチャを使用して、メインの集録/制御ソフトウェアを作成します。
      メモ: 相関器、レーザー、およびパワーメータは、独自のソフトウェアによって制御または監視されます。
   2. ハードウェアおよびソフトウェアのインストール手順は、使用するハードウェアに応じて調整します。
3. オプティカル・セットアップ
   メモ: 図 3 は、次のセクションで光アライメントの品質を制御するために使用される光ベンチモジュールを示しています。すべての光学素子の仕様は、 材料表に記載されています。セットアップを構築する手順は、補足資料で広く詳しく 説明されています。このシステムは、連続波レーザー、浸漬水対物レンズを備えた電動倒立顕微鏡、単一の光子計数モジュールに結合されたアバランシェフォトダイオード検出器、およびハードウェア相関器で構成されています。振動のないヒーターを備えた顕微鏡インキュベーションチャンバは、生細胞での実験のための温度を制御するために特別に設計されています。慣例により、XY軸は光路の垂直平面に対応し、Z軸は光路に対応する。

2. 実験実施前の毎日のチェックポイント

1. 励起経路を制御します(図3、 および)。
   1. すべてのアイリスダイヤフラムを開きます。
   2. パワーメーターでレーザー出力を測定し、最初の虹彩を完全に開いたままにします。
   3. 半波長板(HWP)を回して最大電力を求めます。
   4. レーザー出力が通常よりも低い場合は虹彩を使用してアライメントを確認し、必要に応じてL1とM1を交互に動かします。
   5. 実験実験ノートの検出力値に注意してください。
2. 検出パスを制御します(図3、 &)。
   1. 水、カバースリップ、および2 nMローダミン6G(Rh6G)溶液の液滴を対物レンズの上に置きます。
   2. 蛍光信号(APDのカウント数、LabVIEWソフトウェアで記録)が通常よりも低い場合は、Rh6Gソリューションを作り直し、対物レンズの位置とカバースリップの番号を確認するか、気泡がある場合は除去します。
      1. 蛍光信号が通常よりも低い場合は、パワーメーターを光路の内側に配置してビームをブロックします。
      2. APDをオフにします(以下、APDはAPDと単一光子計数モジュールを指します)。
      3. サンプルを削除します。
      4. 対物レンズをクリーニングし、反射ターゲットと交換します。
      5. 光路からパワーメーターを取り外して、反射ターゲットのレーザービームを確認します。ターゲットのビームが中央に配置され、後方反射がライン 上の最初の虹彩に達することを確認します(図3)。
      6. そうでない場合は、M2でセンターの位置決めを調整するか、ダイクロイックミラーで背面反射を調整します。
      7. 顕微鏡の結合が正しければ、対物レンズを押し戻し、水滴、カバースリップ、およびより濃縮されたRh6G溶液(すなわち、200nM)の液滴を加え、従来の測定(数μW)よりも低いレーザー出力を設定します。
      8. APDをオンにし、強度信号を監視しながら、それぞれのXYZ調整ネジでAPDとピンホールの位置合わせを交互に最適化します(LabVIEWソフトウェア)。
      9. カバースリップを変更し、低濃度のRh6G(2nM)を追加します。ピンホールをZ軸に沿って動かして、分子の輝度比が大きくなり、ウエストが最小になる位置を見つけます。
      10. 信号が下がるまで虹彩を閉じます:レーザービームサイズは対物レンズの背面開口サイズに達します(すなわち、最小ウエストサイズ、 補足資料を参照)。
      11. 相関関係子ソフトウェアを起動し、データを記録します(データ記録についてはセクション7を参照)。
      12. ACFを確認すると、低ノイズが表示され、ウエストサイズが小さく、1分子あたりのカウントレートが1秒あたりに高くなります(データ分析とウエストサイズ評価についてはセクション7を参照)。

3. svFCS データの記録と分析に関する一般的な考慮事項

1. (1)蛍光記録およびACF生成(相関関係子ソフトウェア)、(2)データの予期しない廃棄、保持データの平均、適切なモデルとのフィッティング(自家製Igor Proソフトウェアを使用)、(3)拡散法則プロット(自家製MATLABソフトウェア1)、および(4)オプションの拡散法則比較(自家製MATLABソフトウェア2)。さまざまなソフトウェアプログラムは、要求に応じて利用可能です。
   メモ: ハードウェア相関器の最小サンプリング時間は 12.5 ns (サンプリング周波数 80 MHz) です。これは、溶液中の自由に拡散する小分子の典型的な常駐時間よりも少なくとも1,000低く、共焦点観察体積内の膜タンパク質の拡散時間よりも¹⁰⁶ 小さい時間分解能を提供する。

4. 細胞培養とトランスフェクション

1. 5%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 U/mL)、およびL-グルタミン(1 mM)を添加した完全なダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を使用して、8ウェルチャンバーカバーガラスに#1.0ホウケイ酸ガラス底に10,000細胞/ウェルの密度でCos7細胞を播種します。
2. 細胞を5%CO2を含む加湿雰囲気中で37°Cで₂₄ 時間培養する。
3. 培地を除去し、1ウェルあたり300μLの新鮮な完全培養培地を添加し、細胞を37°Cで30分間プレインキュベートした。
4. eGFP 25と融合させたThy-1タンパク質をコードするプラスミドDNAを^{0.5μg、無血清DMEM} の50μLで希釈する。渦は簡単に混ぜる。
5. 1.5 μL の DNA トランスフェクション試薬を 50 μL の無血清 DMEM に希釈し、溶液をよく混合します。
6. 希釈したトランスフェクション試薬を調製したDNA溶液に直接加え、直ちに化合物を混合する。
7. 調製した混合物を室温で10〜15分間インキュベートする。
8. 結合されたDNA/トランスフェクション試薬複合体を各ウェルの培地上に10μL滴下し、プレートを穏やかに旋回させてホモジナイズする。
9. 細胞を37°Cで5%_CO2 で3時間インキュベートする。
10. インキュベーション後、DNA/トランスフェクション試薬複合体を含む培地を400μLの新鮮な完全DMEMと交換し、svFCS実験の前に細胞を16時間培養します。

5. svFCS測定用細胞の調製

1. 培養液を除去する。
2. 10 mM(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES)、pH 7.4(HBSS/HEPES)を添加した^Ca2+ および^Mg2+ を含む無血清ハンクス平衡塩溶液(HBSS)バッファーで細胞を2〜3回穏やかに洗浄します。
3. すべてのsvFCS取得中にHBSS/HEPESバッファー内のセルを維持します。

6. 薬理学的治療

1. 培養液を取り出し、10 mM HEPES、pH 7.4(HBSS/HEPES)を添加した無血清HBSSで細胞を2~3回洗浄します。
2. HBSS/HEPESバッファー中の1 U/mLのコレステロールオキシダーゼ(COase)溶液で細胞を37°Cで1時間インキュベートします。
3. 溶液を除去し、svFCS測定を行いながら、HBSS/HEPESバッファー中の0.1 U/mLのCOaseの存在下で細胞を維持します。

7. スポットサイズキャリブレーション

1. 顕微鏡チャンバーを37°Cで予温する。
2. 段階希釈によりRh6Gの標準2nM溶液を調製する。
3. 2 nM Rh6G 溶液 200 μL を水浸漬対物レンズ上に置いたガラスカバースリップに滴下します。
4. すべてのハードウェアとソフトウェアを起動します。
5. 使用する蛍光プローブの輝度と光安定性に応じて、(1)安定している蛍光強度(LabVIEWソフトウェア上)、(2)ACF形状(相関器ソフトウェア上)に従って、この電力を適合させます。 (3)小さなウエストサイズと1分子あたりの高い計数率(毎秒1分子あたりの光子、典型的には毎秒1分子あたり数十〜数百の光子)を与えるフィッティングパラメータ。
   注:ACF(G(0)と呼ばれる)の振幅は、分子の数(すなわち、蛍光プローブの濃度)に反比例する。ウエストサイズのキャリブレーションの場合、これは優れた品質管理候補パラメータです。したがって、G(0)は、ウエストのサイズと濃度をリンクさせるため、毎日同じ濃度で類似している必要があります。細胞測定では、FCSは低濃度の方が正確であるため、適切なパラメータフィッティング抽出ではG(0)を高くする必要があります。
6. svFCS照明/検出顕微鏡ポートをLabVIEWソフトウェアで設定します。
7. APD をオンにします。
8. 信号が下がるまで虹彩を閉じて最小のウエストサイズを得るか、ウエストサイズを大きくするために閉じます。
9. 統計的再現性を向上させるために、選択した期間(すなわち実行)のいくつかのACF(通常は相関器ソフトウェアでそれぞれ20秒間持続する10回の実行)を記録します。
10. APD をオフにします。
11. Igor Proソフトウェアを使用して、分子集合体による強い変動を伴う実行を確認して破棄します。この手順は手動で実行します — ユーザーがトレーニングを受けた後は、ユーザーに依存しない必要があります。
12. 保持された ACF の平均を 3D 拡散モデルに当てはめます。
13. フィッティングパラメータから平均拡散時間 を抽出し、「.txt」ファイルに保存します(ファイル形式はIgor Proソフトウェアによって決定されます)。
14. 平均強度(蛍光トレースから抽出)を分子数(ACFから抽出)で割ることによって、1 秒あたりの 1 分子あたりのカウント速度 (良好なパフォーマンス指標) を確認します。
    メモ:この値が高く、同じ集録パラメータに対して日常的に安定していることを確認してください。
15. 37°Cにおける水溶液中のRh6Gの拡散係数(D)を知り(7.13参照)、以下に従って実験ウエストサイズωを計算する。
16. FCS拡散法則をプロットするために必要なすべてのウエストサイズ変更に対して、およびsvFCSデータ集録の新しい実験シリーズの前に、手順を適用します。

8. セル上のsvFCSデータ集録

1. 488 nmのビームパワーを2~4 μWの間で測定および調整します。使用する蛍光プローブの輝度と光安定性に応じて、このパワーを調整して、フォトブリーチングを低く保ちながら(つまり、LabVIEWソフトウェアで安定した強度トレースを)、1分子あたり高いカウントレート(通常は1分子あたり毎秒数千個のフォトン)を実現できるようにします。
2. 測定を開始する前に、サンプルを37°Cで10分間平衡化します。
3. 落射蛍光照明顕微鏡をLabVIEWソフトウェアで設定します。
4. 適切な蛍光プローブの位置と(低い)蛍光シグナル強度を持つ細胞を選択します。
   メモ:蛍光が低いほど、FCS測定値は良好です(ステップ8.1を参照)。
5. svFCS照明/検出顕微鏡ポートをLabVIEWソフトウェアで設定します。
6. APD をオンにします。
7. 選択したセルをLabVIEWソフトウェアでxyスキャンを実行します。
8. zスキャンを実行し、上部の原形質膜を選択して最大蛍光強度で共焦点スポットを見つけ、データ取得を開始します。2つの膜間の分離を最大にするために、好ましくは細胞の核領域においてスキャンを行う。
9. 5秒間持続する20回の実行の1つのシリーズを、それぞれ相関関係子ソフトウェアで記録します。
   メモ: 各実行の時間が、ノイズの少ない ACF を取得するのに十分な長さであることを確認してください。長い買収は、フォトブリーチングまたは予期せぬ実質的な変動(例えば、凝集体)の影響を受けやすい。実行数、持続時間、および系列数をサンプルに適合させますが、再現性のために同じ実験の大部分内で一定であることを確認してください。
10. APD をオフにします。
11. Igor Pro ソフトウェアで予期しない実行を破棄します。
12. 平均ACFを2種の2D拡散モデルに当てはめます。このモデルを標的分子の拡散挙動のタイプに適合させる。
13. 継ぎ手パラメータを前のファイルに保存します(ステップ7.13を参照)。
14. 少なくとも 10 個の異なるセルで 10 ~ 15 回の一連の記録を実行し、ステップ 8.3 ~ 8.13 を再現します。取得した単一のファイルに、ウエストサイズ情報と10〜15枚の録音のフィッティングパラメータが含まれていることを確認してください。
15. 単一の拡散法則を確立するには、200〜400nmの間で変化する少なくとも4つのウエストサイズを分析します。この範囲は回折光学限界によって定義されますが、対物レンズ(開口数)とレーザー(波長)に依存します。
    注:ウエストサイズのキャリブレーションは絶対的ではなく、ある程度の不確実性があるため、xおよびy誤差(すなわち^ω2および_td)を考慮に入れた専用のMATLABソフトウェア²⁸が拡散法則に合うように構築されました。
16. MATLABソフトウェア1を起動し、少なくとも4つのウエストサイズの実験に対応するすべての「.txt」ファイルを含むフォルダを選択します。
17. プロット<_d>対<^ω2>、すなわち拡散の法則ではない。2つの主要なパラメータを抽出することができます:y軸切片(_t0)と有効拡散係数(Deff、傾きに反比例)。

9. 異なる実験条件比較の拡散法則

注:必要に応じて、異なる実験条件のセクション7と8を再現してください。これらの拡散法則がt0およびD eff値²⁸に従って類似しているかどうかを判断するために、専用ソフトウェア(_MATLABソフトウェア2)が開発されました。2 つの仮説 (2 つの値が異なるか、または誤警報 (PFA) の確率より上に設定されたしきい値で 2 つの値が異なっていないかの 2 つの仮説をテストします。5%の任意のPFA値(T = 3.8)は、2つのパラメータ(t0またはDeff)間の有意性の上限と見なされ、2つの値が同一である確率は5%しかないことを示します。

1. 比較する各条件の特性拡散則値を含む「.xls」ファイルを作成します(_{つまり、未}処理(NT)および処理済み(COase)条件のt0、t0エラー、_DeffおよびDeffエラーを含むファイルをテーブルとして)。
   1. MATLAB ソフトウェア 2 を起動します。
   2. 「.xls」ファイルを選択します。
   3. 生成された色分けされた2Dプロットを分析します。ここで、t0とD_eff統計検定は、それぞれX軸とY軸にプロットされます(図4)。Tが高いほど、比較された値の差は大きくなります。

10. コレステロール濃度測定

1. 細胞処理と溶解
   1. Cos7細胞を4 ×¹⁰⁵ 細胞/ウェルの6ウェルプレートに3連で播種し、37°Cで2mLの完全DMEM中で5%_CO2 で一晩インキュベートして、細胞がプレートに付着できるようにします。
   2. 培養液を取り出し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄した。
   3. 1 U/mLのCoaseを含む(または対照用ではない)HBSS/HEPESバッファー1 mLを加え、5%_CO2と共に37°Cで1時間インキュベートします。
   4. 培地を0.1 U/mLのコースを含む1 mLのHBSS/HEPESと交換し、5%_CO2と共に37°Cで1時間インキュベートします。
   5. 溶液を取り除き、細胞を回収する。
   6. PBSで細胞を3回洗浄し、室温で400× g で5分間遠心分離する。
   7. 細胞をラジオイムノ沈降アッセイバッファー(25 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl、1% NP40、10 mM、MgCl 2、1 mM エチレンジアミン四酢酸、₂% グリセロール、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル)で氷上で30分間溶解します。
   8. 溶解液を10000× g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を回収する。
2. メーカーの推奨に従って、作業溶液を使用した修正ブラッドフォードのタンパク質アッセイによって、各サンプルの総タンパク質濃度を定量します。
3. コレステロール濃度測定
   1. 酵素的に総細胞コレステロール値を決定するには、メーカーの推奨に従って適切なキット(例えば、Amplex Red Cholesterol Assay Kit)を使用してください。
   2. 各反応について、5μgのタンパク質を含むサンプルをAmplex Red試薬/西洋ワサビペルオキシダーゼ/コレステロールオキシダーゼ/コレステロールエステラーゼ作用溶液と混合し、暗所で37°Cで30分間インキュベートする。
   3. 520 nmの励起を使用して蛍光を測定し、マイクロプレートリーダーを使用して560〜590 nmでの発光を検出します。
   4. 最終値からバックグラウンドを減算し、標準曲線を使用してコレステロール濃度を決定します。
   5. タンパク質のμgあたりのコレステロールのngで最終的なコレステロール含有量を計算します。

Results

我々は、Cos-7細胞で発現したThy1-GFPについてDLを生成した(図4、黒四角)。拡散法則は正のt0値(19.47ミリ秒±2ミリ秒)を有し、Thy1-GFPが原形質膜のナノドメイン構造に閉じ込められていることを示す。Thy1-GFPを発現する細胞のコレステロールオキシダーゼ処理は、DL t0値を7.36±1.34ミリ秒にシフトさせた(図4、灰色の四角)。この観察は、Thy1-GFP閉じ込めの性質がコレステロール含有量に依存し、脂質ラフトナノドメインと関連していることを確認する。これら2つの拡散法則は、t0およびDeff値に関して、上述の統計的検定(ステップ9.1.3を参照)によれば異なることが示されている。さらに、我々は、COaseで処理された細胞に対する非処理Cos-7細胞における総細胞コレステロールの濃度を評価した。COase処理では、総コレステロール含有量の小さいながらも有意な減少が観察されます(図5)。この酵素は原形質膜の外側の小葉でアクセス可能なコレステロールプールにのみ作用するので、観察されたコレステロールの減少は原形質膜にのみ関連しており、脂質ラフトナノドメインの不安定化をもたらすと仮定する。

図1:異なる形態の膜組織についてスポット変動FCSによって確立されたシミュレートされた蛍光相関分光法(FCS)拡散法則。 (上パネル)膜組織の模式的表現 - (A)自由拡散、(B)メッシュワークバリア、および(C)トラップ/ドメイン閉じ込め - 単一の分子(赤)の軌道を描画します。青い丸は腰ωの膜とレーザー光の交点を示す。(下パネル)FCS拡散法則は、拡散時間tdを半径^ω2の2乗の関数としてプロットすることによって表される。拡散則投影(緑色の破線)は、自由拡散の場合に(A)原点(t0=0)において時間軸をインターセプトする。(B)メッシュワーク障壁がある場合の負軸(t0<0)に、またはトラップおよびドメイン(脂質ラフト)がある場合の(C)正軸(t0_>0)に。D はブラウン運動の横方向拡散係数です。Deff、有効拡散係数;D_マイクロ、メッシュワークトラップ内の微視的な拡散係数;Dinは、ドメイン内部の拡散係数;Doutは、ドメイン外の拡散係数;L、正方形ドメインの側面のサイズ。r_D は円形ドメインの半径です。この数字は、彼とマルゲ⁶から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:svFCSハードウェア制御の概略図 コンピュータは、シリアル(顕微鏡、外部シャッター)、USB(XYZ圧電ステージ、相関器)、PCI(アクイジションボード)のさまざまな通信プロトコルを介してすべてのデバイスを制御します。DAQ:データ集録ボード、APD:アバランシェフォトダイオード、SPCM:シングルフォトンカウンティングモジュール、DO:デジタル出力。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:svFCSセットアップの励起光路と発光光路の模式図 svFCSセットアップには、(1)ファイバ488nmレーザの出力がコリメートされ、(2)1/2波長板と偏光ビームスプリッタの組み合わせが光パワーを設定する、(3)チューブレンズフリー電動顕微鏡を通過した後にサンプルに集束されたレーザビーム、および(4)蛍光が単一のフォトンカウンティングモジュールに結合されたアバランシェフォトダイオードにコンフォカル状の検出経路を介して検出される、 これはハードウェア相関器に信号を配信します。シンプルさは、システムに感度、堅牢性、使いやすさを与えます( 補足資料で広くコメントされています)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:Cos-7で表されるThy1-GFPの拡散解析から生成されたsvFCS拡散法則。 処理なし(NT、黒四角)およびコレステロールオキシダーゼ処理後のCos-7細胞(COase、灰色の円)のsvFCS拡散法則。グラフの挿入は、提示された2つのsvFCS拡散法則の間の有意差の統計的検定を表す(Mailfert et ^al.28による)。テスト値(T)は、両方の拡散法則が異なる場合、3.8に設定されたしきい値を超える必要があります。高いほど、拡散法則の差は大きくなります。T の値は色分けされています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:Cos-7細胞における総コレステロール含有量の比較。 Cos-7細胞を無処理(NT)または1U/mLのコレステロールオキシダーゼ(COase)で1時間処理した。データは、3 連の 1 つの実験の例を表しています。両側の不対応の t検定を使用して、統計的差を評価しました(α=0.05)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

材料の表: svFCS のセットアップに必要な光学素子のリスト。

補足資料: このドキュメントでは、svFCS セットアップをゼロから構築する方法について説明します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

ここでは、標準的な蛍光顕微鏡へのsvFCSモジュールの実装、FCS拡散法則解析のおかげで生細胞中の原形質膜組織のダイナミクスを解読するための強力な実験的アプローチについて説明しました。概念的には、svFCSは、照明領域²³のサイズを変化させながら時間領域における蛍光の相関測定という単純な原理に基づいている。この戦略は、顕微鏡測定からナノスコピック情報を推論するのに役立っており、定常状態25および生理学的プロセス30、31^、32、33における原形質膜組織に寄与する主な物理化学的要素を解読するのに役立つ。全体として、これらのsvFCS分析は、様々な細胞型における脂質依存性ナノドメインの存在と、異なるシグナル伝達事象の同調におけるそれらの直接的な意味合いを明確に実証している。

このフレームワーク内では、光子収差を最適化し、光収差を最小限に抑えるためにsvFCSセットアップを構築する際に考慮する必要がある光学的側面がいくつかあります。したがって、svFCS測定を行う際にチューブレンズを取り外すことができる顕微鏡を使用することをお勧めします。さらに、単一の虹彩がsvFCSセットアップにおいて重要な役割を果たします:それは対物レンズの後方開口部でのビームサイズを変えるので、効果的なウエストサイズ(すなわち、有効励起量)を直接変化させます。ビーム直径は、最小のウエストサイズ³⁴を得るために、客観的な背中の瞳孔に収まるべきである。このオプションは、ウエストサイズの調整に役立ち、光子バジェットの最適化を保証し、実装が簡単です。最後に、光路に沿って最小限の数の光学部品が使用されます。系が複雑でないほど、失われる光子は少なくなります。これらのオプションはすべて、svFCS 実験の堅牢性を大幅に向上させます。

プロトコル自体に関しては、いくつかの重要なステップを考慮する必要があります。最も重要なのは、svFCS測定を成功させるために不可欠な光路の適切なアライメントです(プロトコル、セクション2)。これは、300μWのレーザー照明下で約200kHzの2nM Rh6G溶液からの蛍光シグナルを分析することによって確認するのは簡単です。すべての虹彩を開く必要があり、ACFは重要な振幅(通常はG0〜1.5〜2.0)を持つ必要があります。もう1つの重要な点は、細胞とsvFCS分析のためのそれらの準備に関するものです(プロトコル、セクション4〜8)。それらの密度は、観察される単離された細胞が分析に利用できるように適合させなければならない。非接着細胞は、ポリ-L-リジン溶液を用いてチャンバー付きカバーガラス上に固定化されなければならない。細胞標識からの蛍光シグナルは強すぎてはならず、または適合が困難な非常に平坦なACFをもたらし、適合パラメータは重要な誤差を伴う。さらに、細胞内の非均質な標識および蛍光凝集体は、svFCS測定を解釈することを非常に困難にする。最後に、コレステロールオキシダーゼ処理は細胞生存率に影響し、svFCS分析は治療後1時間を超えてはならない。また、上部原形質膜からの蛍光変動は支持体に付着していないため記録した方がよく、支持体との物理的相互作用による分子の拡散を妨げるおそれがない。

svFCS技術には、検出量を調整するためのモダリティの多様性により、さまざまなアプローチで使用するのに十分な進歩があり、生細胞におけるさまざまな生物学的プロセスを研究することが可能になりました。励起体積のサイズを調整する代替手段は、可変ビームエキスパンダ³⁵を使用することである。また、z方向³⁶に沿って原形質膜の切片からの蛍光シグナルを記録することにより照明領域の大きさを単純に変調することも可能である。これは、拡散則^37,38を導出するための理論的枠組みが開発された標準的な共焦点顕微鏡上で行うことができる。

svFCS法は、原形質膜の不均質な側方組織の特性評価に必要な時空間分解能を提供するが、幾何学的閉じ込めモードは相互に排他的ではない。一方向または他の方向への_t0の偏差は、排他的に、支配的な閉じ込めモード²⁵を明らかにする。さらに、本svFCS法の別の重要な限界は、古典的な光回折限界(〜200nm)から生じる。これは、細胞原形質膜内の分子を閉じ込めるドメインよりも疑いなく大きい。したがって、閉じ込めの分析は、拡散の法則から外挿されたt0値から推測される。

この欠点は、代替方法を実装することによって克服されています。当初、ナノアパーチャで穿孔された金属膜を使用して、非常に小さな膜領域(すなわち、75〜250nmの間で変化する半径の単一ナノメートルアパーチャの光学回折限界以下)を照らす可能性を提供しました³⁹。単離ドメイン組織の理論的拡散法則から予測された遷移レジームがこのように報告され、ナノメートル膜の不均一性の特徴的なサイズの精緻化と脂質依存性ナノドメインが占める表面積の定量的推定を可能にした³⁹。あるいは、近接場走査型光学顕微鏡⁴⁰または平面光ナノアンテナ⁴¹を用いたナノメートル照明も開発されている。最近では、誘導放出枯渇(STED)とFCSを組み合わせることで、非常に高い空間分解能で拡散法則を文書化するための強力で敏感なツールが提供されました。このSTED-FCSは、短期間に起こるナノスケールの分子拡散特性へのアクセスを提供し、原形質膜における脂質プローブの動的組織化の研究を可能にする^42,43。しかし、STEDプロセスにおける蛍光の不完全な抑制は、FCSにおける自己相関曲線の解析に課題を投げかけている。

この困難を克服するために新しいフィッティングモデルが開発され、拡散時間および平均分子数測定値⁴⁴の精度が向上した。最後に、原形質膜での分子拡散が遅い場合、svFCS原理は、画像相関分光法⁴⁵によって記録されたデータに適用することができる。最近、原子間力顕微鏡(AFM)とイメージング全反射FCS(ITIR-FCS)を組み合わせることで、ナノドメイン⁴⁶の密度が高いため、原形質膜、特にパーコレーション閾値に近い膜構成で分子拡散を妨げるメカニズムの性質の微細化に寄与することが実証されている。

結論として、svFCSによる拡散法則の確立は、動的集団脂質と膜タンパク質の会合によって生じる局所的な不均一性を推測するための実験的証拠を提供してきた。Wohlandと同僚⁴⁶が述べているように、「FCS拡散法則分析は、動的情報から解像度限界以下の構造的および組織的特徴を推測するための貴重なツールであり続ける」。それでも、原形質膜で起こる分子事象のダイナミクスをよりよく理解できるように、拡散法則の解釈を洗練させる新しいモデルを開発する必要があります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SM1ねじ式リテーニングリング用	アリグメントツール	Thorlabs	SPW602
アバランチフォトダイオードおよび単一光子計数モジュール(SPCM)	単一光子計数モジュール、アバランチフォトダイオード	Excelitas	SPCM-AQRH-15
	BNC 50 & Omega; プラグ対50 Ω プラグリード 2 m	RS Components	742-4315
	同軸ケーブル415シンチコネクタ、RG-316、50、オメガ;コネクタ付き、1.22 m、RoHS2	RSコンポーネント	885-8172
	ティー50&オメガ;RFアダプターBNCプラグからBNCソケット0→1GHz	RSコンポーネント	546-4948
	Brennenstuhl 2.5 m、8ソケットタイプE –フレンチエクステンションリード、230 V	RSコンポーネント	768-5500
	スコット、6 Wプラグイン電源 5 V dc 、 1.2 A 、1出力スイッチモード電源、タイプC	RSコンポーネント	452-8394
	Crystek CCSMACL-MC-24 リファレンスオシレータ電源ケーブル RFアダプタ	RSコンポーネント	792-4079
蛍光フィルタリング	535/70 ETバンドパス、AOI 0°彩度直径25 mm	AHF	フィルターF47-539
	レーザービームスプリッターzt488 RDC、AOI 45°クロマ 25.5 x 36 x 1	mm AHF フィルター	F43-088
	496/LP BrightLine HC ロングパスフィルター、AOI 0°彩度直径 25	AHF フィルター	F37-496
ハードウェア相関器	80 MHz デジタル相関器	Correlator.com	Flex02-12D
レーザー	レーザー LASOS LDM-XT ファイバー結合、488 nm、65 mW	Lasos	BLD-XT 488100
レーザー安全	高性能ブラックマスキングテープ、1 インチ x 180 フィート (25 mm x 55 m) ロール	ソーラブ	T743-2.0
	レンズティッシュ、小冊子あたり25枚、小冊子5	Thorlabs	MC-5
	レーザー安全メガネ、ライトオレンジレンズ、可視光透過率48%	Thorlabs	LG3B
顕微鏡	ツァイス アクシオーバー 200M 電動倒立蛍光顕微鏡 ファインフォーカシングと粗いフォーカシング、リフレクタータレット回転、対物レンズノーズピース回転、カメラポートの切り替え、内部ライトシャッター	カールツァイス
	C-アポクロマート 40x/1,2 W Korr.selected for FCS (D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR	Carl Zeiss	421767-9971-711
	アダプター W0.8 / M27x0.75 H "5"	Carl Zeiss	000000-1698-345
	ミドルリング W0.8 - W0.8 H "5"	Carl Zeiss	000000-1698-347
光路	D25.4mm ミラー、保護シルバー	Thorlabs	PF10-03-P01
	D25.4mm、F = 60.0.mm、可視アクロマー
	D25.4mm、F = 35.0.mm、可視アクロマー
	25 & マイクロ;m ピンホール	Thorlabs	P25S I
	25.4mm マウント ゼロ、オーダー 1/2 波長板 488 nm	Thorlabs	WPH10M-488 (HWP)
	20mm 偏光ビームスプリッター キューブ 420-680 nm	Thorlabs	PBS201
	回転ステージ 56 mm x 26 mm ネジ式 ID	Thorlabs	RSP1/M
	52 mm x 52 mm キネマティックプラットフォームマウント	Thorlabs	KM100B/M
	調整可能なプリズムクランプ	Thorlabs	PM3/M
	ビームブロック - アクティブエリア 19 mm x 38 mm	Thorlabs	LB1/M
	アイリスダイヤフラム 1 mm 〜 25 mm 絞り	Thorlabs	ID25/M
	左利き用キネマティックシリンドリカルレンズマウント	Thorlabs	KM100CL
	1 インチ光学ホルダー、M4 タップ	Thorlabs	MFF101/M
	1インチ スタッカブル レンズ チューブ	Thorlabs	SM1L03
	スタッカブル レンズ マウント 1インチ 光学使用可能な深さ ½	Thorlabs	SM1L05
	1インチ光学使用可能深度用スタッカブルレンズマウント 2インチ	Thorlabs	SM1L20
	小型光学レール 600mm、メートル	Thorlabs	RLA600/M
	小型光学レール 75mm、メートル	Thorlabs	RLA075/M
	小型光学レール 150mm、メートル	Thorlabs	RLA150/M
	レールキャリア、ざぐり穴 1 インチ x 1 インチ	Thorlabs	RC1
	レールキャリア、垂直ダブテール	Thorlabs	RC3
	高精度平行レンズ マウント 1 インチ	Thorlabs	LM1XY/M
	½ " (12mm) ダブテール平行移動ステージ	Thorlabs	DT12/M
	レールクランプ	Thorlabs	CL6
	メートルXYZトランスレーションステージ(PT102を含む)	Thorlabs	PT3/M
	ブラックゴム引き生地	Thorlabs	BK5
	ボールドライバーキット/ 6ツール	Thorlabs	BD-KIT/M
	アダプター、外部M6 x 1.0スレッドおよび外部M4 x 0.7スレッド付き	Thorlabs	AP6M4M
	取り付けベース、25 mm x 58 mm x 10 mm、5パック	Thorlabs	BA1S/M-P5
	25.4mm光学用レンズマウント	Thorlabs	LMR1/M
	SM1 FC/APCアダプター	Thorlabs	SM1FCA
	キネマティックミラーマウント 1インチ光学	Thorlabs	KM100
	シリコンパワーヘッド、400-1100nm、50mW	Thorlabs	S120C
	12.7 mmポストホルダー、スプリング式六角ロック蝶ネジ、 L = 50 mm、5パック	Thorlabs	PH50/M-P5
	ポストホルダー、バネ付き六角ロック式つまみネジ、L=20 mm	Thorlabs	PH20/M
	12.7 mm x 50 mm ステンレス製光学ポスト、M4 スタッド、 M6 タップ穴、5 パック	Thorlabs	TR50/M-P5
	12.7 mm x 75 mm ステンレス製光学ポスト、M4 スタッド、 M6 タップ穴、5 パック	Thorlabs	TR75/M-P5
	USB電源およびエネルギーメーターインターフェース	Thorlabs	PM100USB
	12.7 mm x 30 mm ステンレス製光学ポスト、M4スタッド、 M6タップ穴	Thorlabs	TR30/M
	12.7 mm x 20 mm ステンレス製光学ポスト、M4 スタッド、 M6 タップ穴	Thorlabs	TR20/M
	750 mm 長い構造レール (検出ボックス)	Thorlabs	XE25L750/M
	長さ350mmの構造レール(検出ボックス)	Thorlabs	XE25L350/M
	クイックコーナーキューブ(25mmレール用	Thorlabs	XE25W3
	直角ブラケット(25mmレール用	Thorlabs	XE25A90
	黒のポスターボード 20インチ x 30インチ(508mm x 762mm)、厚さ1/16インチ(1.6mm)、厚さ	Thorlabs	TB5
	ヒンジ(25mmレールエンクロージャ用)	Thorlabs	XE25H
	レールエンクロージャ用リッドストップ	Thorlabs	XE25LS
	M4 キャップスクリューキット	Thorlabs	HW-KIT1/M
	M6 キャップスクリューキットおよびハードウェアキット	Thorlabs	HW-KIT2/M
	テーブルクランプ、L字型、5パック	Thorlabs	CL5-P5
	SM1 リング作動式アイリスダイヤフラム (Ø0.8 - &オスラッシュ;12 mm)	Thorlabs	SM1D12D
	Ø1 "SM1マウントすりガラスアライメントディスク、w/Ø1 mm 穴	Thorlabs	DG10-1500-H1-MD
	ハニカム光学テーブルトップ、Standa	Standa	1HB10-15-12
	光学テーブルサポート、Standa	Standa	1TS05-12-06-AR
サンプルナノポジショニング	精密 XYZ ナノポジショニング	Physik Instrumente	PI P527-3.CD
	デジタルマルチチャンネルピエゾ株式会社、3チャンネル、-30〜130 V サブDコネクタ、静電容量センサー、	Physik Instrumente	PI E727-3.CD
温度チャンバー	ツァイス200M倒立顕微鏡インキュベーターシステムMATT BLK	デジタルピクセル
	デュアルチャネルマイクロプロセッサ温度コントローラー	ピクセル	DP_MTC_2000_DUO
	2つの振動フリーヒーターモジュール	デジタルピクセル	DP_150_VF
	PT100温度センサー	デジタルピクセル	DP_P100_TS
Biological試薬および材料
細胞培養およびトランスフェクション	Cos7細胞	ATCC®	CRL-1651&貿易;
	8-well Lab-Tek	Thermo Fisher Scientific	155411PK
	Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11965092
	Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044
	L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
	PBS buffer	Thermo Fisher Scientific	14190144
	PenStrep	Thermo Fisher Scientific	15140122
	PolyJet Transfection Reagent	SignaGen Laboratories	SL100688
コレステロール含有量測定	Amplex Red Cholesterol Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	A12216
	Protease Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific	87786
	Phosphatase Inhibitorカクテル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	78420
	ROTI ナノクオンツ ワーキングソリューション	ロス	K880
	GloMax ディスカバー マイクロプレートリーダー	Promega	GM3000
svFCS 測定	HBSS バッファー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14025092
	ヘペスバッファー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15630080
	コレステロールオキシダーゼ	Sigma-Aldrich	C8868
	ローダミン 6G	Sigma-Aldrich	83697-1G