心筋保護に対する低体温の異なる程度の明確な影響は十分に評価されていない。本研究の目的は、ヒト心筋細胞系モデルにおける異なる低体温症治療に続く細胞死のレベルを定量化し、将来の詳細な分子研究の基礎を築くことであった。
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方法論記事
ヒト心臓筋細胞モデルにおける低体温症前処理に対する心筋保護のインビトロ評価
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
虚血/再灌流由来心筋機能障害は、心臓手術後の患者における一般的な臨床シナリオである。特に、虚血性損傷に対する心筋細胞の感受性は、他の細胞集団のそれよりも高い。現在、低体温症は、予想される虚血性侮辱に対してかなりの保護を与える。しかし、複雑な低体温症による分子変化の調査は依然として限定的である。そのため、臨床状態で観察されたような損傷を再現可能な方法で誘導できるin vivo状態と同様の培養条件を特定することが不可欠である。インビトロで虚血様の状態を模倣するために、これらのモデルの細胞は酸素/グルコース欠乏(OGD)によって処理された。また、心臓手術時に使用される標準時間温度プロトコルを適用しました。さらに、心筋損傷の定量的分析に、シンプルかつ包括的な手法を用いたアプローチを提案する。アポトーシス関連タンパク質のアポトーシスおよび発現レベルを、フローサイトメトリーおよびELISAキットを用いて評価した。本モデルでは、異なる温度条件が体外での心筋細胞アポトーシスに及ぼす影響に関する仮説を検証した。このモデルの信頼性は、厳密な温度制御、制御可能な実験手順、および安定した実験結果に依存します。さらに、このモデルは、低体温療法の開発に重要な意味を持つ低体温心保護の分子機構を研究するために使用することができます。
概要
虚血/再灌流由来心筋機能障害は、心臓手術1、2後の患者における一般的な臨床シナリオである。非パルスタイル低流動灌流および総循環停止期間中に、すべてのタイプの心臓細胞を含む損傷がまだ起こる。特に、虚血性損傷に対する心筋細胞の感受性は、他の細胞集団のそれよりも高い。現在、治療低体温症(TH)は、心臓手術3、4を受けている患者において予想される虚血性侮辱に対して実質的な保護を与える。THは、心臓手術中の冷却の定義に関するコンセンサスは存在しないが、14-34 °Cのコア体温として定義される5、6、7。2013年、国際的な専門家パネルは、全身低体温循環停止8の様々な温度範囲を分類するための標準化された報告システムを提案した。脳の脳波と代謝の研究に基づいて、彼らは低体温症を4つのレベルに分けた:深度低体温症(≤14°C)、深い低体温症(14.1-20°C)、中等度の低体温(20.1-28°C)、および軽度の低体温症(28.1-34°C)。専門家のコンセンサスは明確で均一な分類を....
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プロトコル
市販の試薬や器具に関する情報は、 資料表に記載されています。
AC16ヒト心筋細胞株は、BLUEFBIO(上海、中国)から購入したSV40形質転換ヒト線維芽細胞17と成体心室心臓組織からの初代細胞の融合に由来した。細胞株は、心筋細胞の特徴を多くの生化学的および形態学的特徴を開発する。また、細胞株は、ビトロ18,19において心筋損傷および心筋機能を評価するために広く用いられている。
1. 細胞培養
注:基底培養培地は、無血清のダルベッコの修飾されたイーグルの培地(DMEM)、10%のウシ胎児血清(FBS)、1%心臓筋細胞増殖サプリメント、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液で構成されています。使用前に4°C、前温37°Cで保存してください。
- 凍結保存されたヒト心筋細胞(HCM)細胞を液体窒素から取り出し、37°Cの水浴で解凍します。
- バイアルに小さな氷が残るまで、37°Cの水浴でバイアル(<1分)を軽く振ります。
- バイアルを無菌層流れフードに移します。70%のアルコールを浸した綿のボールでバイアルの外側を....
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結果
HCMの生存率に対するOGD暴露の効果は、CCK-8アッセイによって決定された。対照群で観察されたものと比較して、細胞生存率は時間依存的に有意に低下した(図2A)。再灌流後の異なる時期におけるHCMのアポトーシス率は、0から16時間までの特定の傾向を示し、アポトーシス率は徐々に増加し、16時間時点で最大速度に達した(図2B)。OGDとして12hの細胞活性を〜50%減少させたように、12hOGDは、その後の実験で細胞損傷を誘発するために使用された。
その後、アポトーシスの過程に対する温度の影響について検討した。OGD群で観察されたものと比較して、低体温症で治療した3群において生存細胞の割合が高かった(図3B)。さらに、深低体温群の細胞は、OGD群で観察された細胞よりも2.1倍高い生存率(>92%)が最も高かった。さらに、フローサイトメトリーの結果は、低体温がOGD条件下でHCMのアポトーシスを妨げてい.......
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ディスカッション
異なるタイプの細胞間の相互作用を含む無傷の動物の複雑さは、しばしばI/R傷害の特定の構成要素の詳細な研究を妨げる。そのため、インビボでの虚血後の分子変化を正確に反映できるインビトロ細胞モデルを確立する必要がある。OGDモデルに関する研究は、以前に報告されています13,22, そして多くの洗練された方法が確立されています23,24.OGDモデルの調製プロセスには、酸素欠乏とグルコース欠乏の2つの重要なステップが含まれます。本研究では、グルコース欠乏はグルコースフリー培地で細胞を培養して行い、酸素欠乏は窒素による置換によって達成されたが、これは現在OGDモデル25,26を調製するための十分に確立された方法である。ただし、細胞の種類によっては、:1)細胞の播種密度と2)OGD曝露の持続時間を含む.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究の一部は中国国立自然科学財団(81970265、81900281,81700288)、中国ポスドク科学財団(2019M651904)によって資金提供されました。中国の国家主要研究開発プログラム(2016YFC1101001、2017YFC1308105)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アネキシンV-FITC細胞アポトーシス検出キット | バイオテクノロジー、中国 | C1062M | |
| 心筋細胞増殖サプリメント | Sciencell、米国 | 6252 | |
| カスパーゼ3活性アッセイキット | バイオテクノロジー、中国 | C1115 | |
| カスパーゼ8活性アッセイキット | バイオテクノロジー、中国 | C1151 | |
| DMEM、グルコースなし | Gibco、米国 | ||
| Dulbeccoの改変されたワシ媒体 | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal wevine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| JC-1 Bio-Technologyによるミトコンドリア膜電位アッセイキット | 、中国 | C2006 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン溶液 | ギブコ、米国 | 10378016 | |
| 活性酸素種アッセイキット | 、中国 | S0033S | |
| 3ガスインキュベーター | メマート、ドイツ | ICO50 | |
| トリプシンEDTA(0.25%) | ギブコ、米国 | 25200056 |
参考文献
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
- Klein, P., et al. Less invasive ....
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