Method Article

発見駆動型宿主間相互作用のためのラベルフリー定量プロテオミクスワークフロー

DOI:

10.3791/61881

⸱

October 20th, 2020

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、質量分析ベースのプロテオミクスによる感染時の宿主と病原体の相互作用をプロファイルするプロトコルを提示する。このプロトコルは、標識のない定量を使用して、1回の実験で、宿主(例えばマクロファージ)と病原体(例えば クリプトコッカス・ネオフォルマン)の両方のタンパク質の存在量の変化を測定する。

Abstract

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質量分析(MS)ベースの定量プロテオミクスの技術的成果は、様々な条件下で生物のグローバルプロテオームを分析するための多くの未知の道を開きます。この強力な戦略は、微生物病原体と所望の宿主との相互作用に適用され、感染に対する両方の視点を包括的に特徴付ける。本明細書において、ワークフローは、不滅のマクロファージ細胞の存在下で、致命的な疾患クリプトコッカス症の原因物質である真菌性の栄養性細胞内病原体である クリプトコッカス・ネオフォルマンの 感染者のラベルフリー定量(LFQ)について説明する。このプロトコルは、単一の実験で病原体細胞と哺乳類細胞の両方に適切なタンパク質調製技術を詳述し、液体クロマトグラフィー(LC)-MS/MS分析のための適切なペプチドサブミッションをもたらす。LFQの高スループットの一般的な性質は、タンパク質の同定と定量の広いダイナミックレンジだけでなく、任意の宿主病原体感染設定への転写性を可能にし、極度の感受性を維持する。この方法は、感染模倣条件内の病原体の広範で公平なタンパク質豊富プロファイルをカタログ化するために最適化されています。具体的には、ここで示す方法は、毒性に必要なタンパク質産生などの C.ネオフォルマン病 原発病に関する重要な情報を提供し、微生物の侵入に応答する重要な宿主タンパク質を特定する。

Introduction

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侵襲性真菌感染症の有病率は非常に増加しており、容認できないほど高い死亡率と相関しており、免疫不全素因を有する個体で最も一般的に報告される1。クリプトコッカス・ネオフォーマンは、宿主マクロファージ細胞内で細胞内生存が可能な悪名高い日和見真菌病原体である。不十分な抗真菌介入は、真菌の播種およびクリプトコッカス髄膜炎および髄膜脳炎の生命を脅かす症状をもたらす 2,3.免疫不全状態の世界的な増加は、C.ネオフォーマンを含む多くの真菌種が4、5、6に対する耐性をますます進化させた抗真菌剤の使用の並行増加を要求している。したがって、宿主の防御応答と微生物の病因に関する重要な生物学的質問に答えるために、堅牢で効率的な技術を実装することが不可欠です。

強力な計算およびバイオインフォマティクスパイプラインの生成を含む質量分析(MS)の技術進歩の新時代は、宿主病原体研究7,8の大規模分析のための統合的ビジョンの基礎を提供する。従来の病原体主導のプロテオミクス解析は、タンパク質相関プロファイリング、プロテオミクスと結合したアフィニティークロマトグラフィー、およびインタークトミクス9などの包括的な方法論を含む、宿主または病原体の観点から感染の見解を一般的にプロファイルする。ホストシステムにおける危険病原体の病原性に関する調査は、非常に臨床的に重要である。しかし、単一の実験での二重遠近解析の適用は、以前は達成不可能と考えられていました。例えば、感染に対する病原体の視点は、多くの場合、低い豊富な真菌タンパク質の検出のための感度を低下させる豊富な宿主タンパク質によって圧倒される7。さらに、高いサンプルの複雑さは、単一の実験システムで調査するために多くのターゲットを招き、特定の病原体タンパク質の作用機序を解明する挑戦を証明する。

ボトムアッププロテオミクスは、管理しやすいサンプル調製を可能にする一般的なMS技術であり、その後に液体クロマトグラフィー分離、同定、定量をMS10、11で配列特異的酵素消化してペプチドを生成する。ここでは、感染に基づくプロテオームまたは「感染性」の公平なカバレッジを達成することを目的としたデータ依存的な取得戦略を示す方法を提示する。具体的には、ラベルフリー定量(LFQ)は、複数のプロテオーム間でタンパク質レベル変化を確実かつ正確に同定するための化学的または代謝ラベルへの依存性を低下させ、サンプル処理および処理ステップ12、13を低減する。この普遍的なアプリケーションは、任意の予想されるタンパク質産生とは無関係に細胞内の特定の瞬間に産生されたタンパク質を尋問します。したがって、感染に不可欠な新しい洞察が発見される可能性があります。

本明細書に記載されているワークフローは、宿主免疫細胞を用いた感染模倣状態の間の C.ネオフォーマン のタンパク質レベル変化を探索するために最適化される(図1)。このアプローチは、細胞型の分離と分離に頼るのではなく、宿主と病原体プロテオームを一緒に抽出し、生物特異的な2つのデータベースを用いた生物情報分離を利用して、種特異的タンパク質産生を区別する。この方法は、同位体ベースのラベリング研究または分画に必要な余分なコストのかかる準備ステップなしで処理されるサンプルの無制限の数のための利点を提供します。さらに、このワークフローは、宿主の免疫細胞を標的化し感染させることができる幅広い真菌および細菌病原体に伝達可能な最適化されたタンパク質抽出プロトコルをサポートします。全体として、このプロトコルは、高分解能MSのための公平なタンパク質抽出とサンプル処理を完了するための手順を概説し、続いて、感染に有意な真菌タンパク質に関する豊富な知識を提供し、宿主防御応答の包括的なプロファイリングを行うことができるデータおよび統計分析を行う。

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Results

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上記で概説したプロトコルは、真菌病原体、C.ネオフォーマンおよび宿主であるマクロファージ細胞の両方から得られたタンパク質を単一の実験で同定し、定量化する。共培養後、細胞は、各種に特異的なペプチドプロファイルに基づいて、一緒に収集および処理され、生物的に分離される。これは、感染時の宿主病原体関係の相互作用を定義するための強力なアプローチである。実験から同定されるタンパク質の数は、出発物質、サンプル調製、勾配長、MS計測、バイオインフォマティクスワークフローによって異なります。本明細書に記載されたプロトコルを用いて、我々は通常、1,500 C. ネオフォーマンタンパク質および6,500個の宿主タンパク質を用いて実験から約8,000個のタンパク質を同定する。データセットの処理に続いて、分析を推進する重要な要因を観察するための主成分分析(PCA)プロットを生成します(図2A)。ここでは、実験計画(成分1、79.8%)から予想されるように、データ間の分離の最大の成分が感染しているのと非感染サンプルが観測され、サンプルの第2の特徴は生物学的変動性(成分2...

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Discussion

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プロトコルの重要なステップには、マクロファージ細胞の調製および細胞への中断を最小限に抑えたタンパク質処理のための共培養サンプルの収集が含まれる。採取前に細胞の不必要なリシスを防ぐために、洗浄、接種、および接着性マクロファージ細胞を穏やかに慎重に除去する手順を実行することが重要です。実験に対して正しいMOIを確立することは、過度に高いMOIを接種すると、急速なマクロファージ細胞死を引き起こし、MS.のサンプルの収集と処理が困難になる可能性もあるので、MOI数が少ないと貪食細胞が少なくなり、生物学的系における真菌タンパク質の検出が制限される可能性があります。このような制限を克服するために、細胞死アッセイ(例えば、LDH定量)でサポートされる様々なMOIを用いて試験実験を行い、宿主応答を開始するが、収集前に宿主細胞を殺さない真菌細胞の数を定義することを推奨します。実験では、感染に関連する真菌タンパク質の同定を目指し、高いMOI(100:1)を必要とし、豊富な宿主タンパク質の中から真菌タンパク質を適切に検出することを目指しています。実験全体を行う前に、マクロファージ細胞傷害アッセイを日常的に行い、宿主細胞死に対するMOIの影響を評価する。C.<...

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Disclosures

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著者らは利益相反を宣言しない。

Acknowledgements

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著者らは、バイオインフォマティクス・ソリューションズ社のジョナサン・クリーガー博士が代表的な実験のために質量分析計を操作してくれたことに感謝し、Geddes-McAlisterグループのメンバーが実験的なセットアップと原稿フィードバックを支援してくれたことに感謝する。著者らは、バンティング研究財団-ジャリスロウスキー・フェローシップ・ディスカバリー賞、ニューフロンティア研究基金-探査(NFRFE-2019-00425)、.M カナダイノベーション財団(JELF 38798)、NsERCカナダ大学院奨学金奨学金、オンタリオ州卒業奨学金B..B

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 mM Tris-HCl、pH 8.5Fisher ScientificBP152-14°C;C
60 x 15 mm ディッシュ、Nunclon DeltaThermoFisher Scientific174888
6 ウェル細胞培養プレートThermoFisher Scientific140675
アセトニトリル、MS グレードPierceTS-51101
酢酸Sigma Aldrich1099510001
AcetoneSigma Aldrich34850-1L
アンモニウム重炭酸塩(ABC)サーモフィッシャーサイエンティフィックA643-500室温で最大1ヶ月間安定なストック50 mM ABC溶液を調製します。
ベルアート&貿易;HiFlow真空吸引器収集システムフィッシャーサイエンティフィック13-717-300必須ではありませんが、血清学的ピペットを使用して媒体を除去することができます。
C18樹脂3M Empore3M2215
細胞スクレーパーVWR10062-906ではありませんが、マクロファージ細胞を放出する他の方法を使用することができます。
遠心真空濃縮器エッペンドルフ07-748-15
コンプリートろ過ユニットVWR10040-436
円錐形ファルコンチューブ (15 mL)フィッシャー・サイエンティフィック05-539-12
カウンテス II 自動セルカウンターサーモフィッシャー・サイエンティフィAMQAX1000必須ではありませんが、血球計算盤は代替品として使用することができます。
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity AssayPromegaG1780
Dithiothreitol (DTT)ThermoFisher ScientificR08611 M DTTのバルクストック溶液を調製し、急速冷凍して-20°Cで保存します。使用までC。使用後は毎回廃棄してください(凍結融解を繰り返し行わないでください)。
DMEM、高グルコース、GlutaMAX サプリメントサーモフィッシャー サイエンティフィック10566016
ウシ胎児血清 (FBS)サーモフィッシャー サイエンティフィ1248302060°Cでインキュベートすることにより熱不活化;Cを30分間。50mlのアリコートを準備し、急速冷凍します。培地調製前に解凍する
血球計算盤VWR15170-208
HEPESSigma AldrichH3375ストック溶液中の40 mM HEPES/8 M尿素を調製し、急速冷凍し、-20°Cで保存します。使用までC。使用後は毎回廃棄してください(凍結融解を繰り返し行わないでください)。
高速液体クロマトグラフィーシステムサーモフィッシャーサイエンティフィックLC140グラジエントの長さはサンプルの複雑さに基づいており、感染性サンプルには120分のグラジエントを推奨しています。
高分解能質量分析計サーモフィッシャーサイエンティフィック726042
ヨードアセトアミド (IAA)シグマ アルドリッチI61250.55 Mバルクストック溶液を調製し、急速冷凍、-20°Cで保存。使用までC。使用後は毎回廃棄してください(凍結融解を繰り返し行わないでください)。
L-グルタミンサーモフィッシャー サイエンティフィック25030081アリコートして冷凍保存することができます。培地調製の前に解凍します。
LoBind微量遠心チューブEppendorf13-698-794
MaxQuanthttps://maxquant.org/MaxQuantは、大規模なMSデータセットの計算解析ステップを概説するMaxQuant Summer Schoolなどのチュートリアルを提供する公開プラットフォームです
微量遠心分離機エッペンドルフ13864457
ペニシリン:ストレプトマイシン10k/10kVWRCA12001-692アリコートして冷凍して保存することができます。培地調製の前に解凍します。
ペプチド分離カラムThermoFisher ScientificES803
Perseus Softwarehttp://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered SalineVWRCA12001-676Puchase 不要。PBSも調製できますが、使用前に滅菌ろ過を行う必要があります。
Pierce BCA Protein AssayThermoFisher Scientific 23225
ピペット、使い捨て血清学的 (10 mL)フィッシャー・サイエンティフィック13-678-11E
ピペット、使い捨て血清学的 (25 mL) バシックスフィッシャー・サイエンティフィ14955235
プローブ・ソシエーターサーモフィッシャー・サイエンティフィ100-132-894
プロテアーゼ阻害剤カクテル錠ロシュ4693159001
ドデシル硫酸ナトリウムサーモフィッシャーサイエンティフィック2836420% (w/v)
分光光度計 (ナノドロップ)サーモフィッシャーサイエンティフィックND-2000
STAGE 転倒遠心分離機ソネーションSTC-V2
サーマルシェーカーVWRNO89232-908
トリフルオロ酢酸サーモフィッシャーサイエンティフィック85183
トリプシン/リス-Cプロテアーゼミックス,MSグレードピアスA4000720°Cに維持します。
超音波浴BransonicA89375-450冷蔵室に保管 (4C)
尿素シグマ AldrichU1250-1KGバルクストック溶液で40 mM HEPES/8 M尿素を準備し、急速冷凍、-20 °Cで保管します。使用までC。使用後は毎回廃棄してください(凍結融解を繰り返し行わないでください)。
酵母抽出物ペプトンデキストロースブロスBD DifcoBM20
必須ック ック バルクック ック -

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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